Восстановление токсичных веществ

П-нитрозо-Н, Н-диметиланилин является первичным раздражителем кожи и вызывает развитие повышенной чувствительности, а также является распространенной причиной дерматита. Хотя иногда рабочие, у которых развился дерматит, могут впоследствии работать с этим соединением без всяких проблем, большинство при повторном соприкосновении получают тяжелые повреждения кожи, и поэтому разумно было бы переводить их на другую работу, чтобы избежать возможного контакта.

5-хлор-о-толуидин хорошо абсорбируется кожей или через дыхательные пути.

Хотя само это вещество (и некоторые из его изомеров) могут вызывать образование метгемоглобина, наиболее сильно проявляется его раздражающее действие на мочевыводящие пути, в результате чего развивается геморрагический цистит, характеризующийся болезненной гематурией и частым мочеиспусканием.

Появлению признаков цистита может предшествовать микроскопическая гематурия, но никакой канцерогенной опасности этого соединения для человека не обнаружено. Тем не менее, лабораторные исследования вызвали подозрения в онкогенности других изомеров для некоторых видов животных.

Доказано, что бензидин является канцерогеном, производство и промышленное применение которого привело к многочисленным случаям папилломы и карциномы мочевыводящих путей. На некоторых производствах заболели более 20% рабочих.

Недавние исследования показали, что бензидин может повышать вероятность образования и других форм раковых опухолей, но этот факт еще не является общепризнанным. Наиболее распространенный путь попадания бензидина в организм человека - абсорбция через кожу, однако нельзя исключать опасности вдыхания паров и мелких твердых частиц. Канцерогенное действие бензидина было установлено в результате анализа множества случаев опухоли мочевого пузыря у подвергнувшихся воздействию этого соединения рабочих, и в результате опытов на животных.[79]

3,3'-дихлорбензидин - вероятный канцероген для человека. Это заключение основано на статистически данных о значительном увеличении случаев развития опухолей у крыс, мышей и собак, а также на положительных данных относительно его вредного воздействия на ДНК. Структурное сходство с бензидином, известным сильным человеческим канцерогеном, который вызывает опухоли мочевого пузыря, повышает вероятность того, что и 3,3'-дихлоробензидин является канцерогеном для человека[79-81].

Диамино-4,40-диаминодифенилметан. Самым наглядным примером токсичности этого соединения может считаться случай, когда 84 человека получили токсический гепатит, съев хлеб, испеченный из загрязненной этим веществом муки. В других случаях гепатит развивался после абсорбции через кожу больших количеств этого соединения. Он может также вызывать аллергический дерматит. Эксперименты с животными показали, что его можно считать потенциальным канцерогеном, однако окончательные выводы еще не сделаны. Доказано, что производные диаминодифенилметана являются канцерогенами для лабораторных животных.

Диметиламиноазобензол. В результате активного исследования метаболизма ДАБ было установлено, что этот процесс включает в себя восстановление, разрыв связи с азогруппой, деметилирование, гидроксилирование кольца, Н-гидроксилирование, Н-ацетилирование, связывание протеина и кислот

После активации ДАБ обнаруживал мутагенные свойства. Он оказывал канцерогенное действие на крыс и мышей (карцинома печени), а при попадании через пищеварительный тракт вызывал карциному мочевого пузыря у собак. Единственным зафиксированным проявлением его вредного воздействия на человека является дерматит у имевших с ним контакт рабочих. Дифениламин. Это вещество может вызывать легкое раздражение. Похоже, его промышленное использование не представляет опасности, однако в процессе его производства может образовываться в качестве примеси сильный канцероген 4-аминодифенил. Он может в значительных концентрациях присутствовать в дегте, получаемом путем дистилляции, и вызывать рак мочевого пузыря. Несмотря на то, что современные технологические процессы позволяют существенно снизить количество примесей в конечном продукте, необходимо принимать соответствующие меры для предотвращения возможного контакта с ним. .[82]

Нафтиламины существуют в двух изомерных формах, и . абсорбируется через кожу и органы дыхания. Попадание на кожу или в глаза может привести к ожогам. Промышленное применение не вызывает острого отравления, но длительное воздействие присутствующего на рабочем месте этого вещества явилось причиной множества случаев папилломы и карциномы мочевого пузыря. Возможно, эти опухоли явились результатом значительной примеси . Теперь это представляет чисто академический интерес, поскольку в настоящее время доступен со значительно сниженной примесью.

- известный человеческий канцероген, вызывающий рак мочевого пузыря. Острое отравление им приводит к метгемоглобинемии или острому геморрагическому циститу. Одно время это соединение широко применялось как промежуточное звено при производстве красителей и антиоксидантов, но в настоящее время его производство и применение запрещено почти во всем мире, и оно считается слишком опасным, чтобы при обращении с ним пренебрегать мерами защиты. Оно легко абсорбируется через кожу и дыхательные пути. Из-за высокой канцерогенности вопрос об острых отравлениях им не возникает.

Фенилендиамины. Существуют различные изомерные формы фенилендиаминов, но только м- и п-изомеры имеют промышленное значение. Хотя п-фенилендиамин может вызывать образование метгемоглобина, неизвестны случаи метгемоглобинемии в результате отравления на производстве. п-фенилендиамин печально известен своей способностью сенсибилизации кожи и дыхательных путей. Регулярный контакт с кожей может привести к дерматиту. Также сообщалось о случаях появления прыщей и лейкодермы. Существовавшая раньше проблема "мехового дерматита" теперь отошла на второй план вследствие усовершенствования процесса окраски меха, при котором были удалены все следы п-фенилендиамина.

Точно так же астма, раньше весьма распространенная среди рабочих, занятых на окраске меха, теперь - после усовершенствования контроля над загрязняющей воздух пылью - встречается относительно редко. Экспериментальные исследования показали, что канцерогенное действие фенилендиаминов и их производных (например, Н-фенил или 4- или 2-нитрофенил) в настоящее время либо слабо выражено, либо не доказано, либо отсутствует вовсе. Проверенные производные, в состав которых входил хлор, были признаны потенциально канцерогенными для животных.[79-81]

В прошлом большое беспокойство вызывали канцерогенные свойства промышленных смесей из-за присутствия в них , примесь которого была обнаружена в больших количествах (от десятков до сотен ) в некоторых использовавшихся ранее составах, а также из-за открытия, что , хотя и в бесконечно малых количествах, является продуктом метаболизма Н-фенил-2-нафтиламина.

Экспериментальные исследования указывают на его потенциальную канцерогенность для животных, но окончательные выводы еще не сделаны, и степень значимости результатов метаболизма еще не известна. Эпидемиологические исследования большого количества людей работающих в разных условиях, не выявили существенного увеличения заболеваемости раком у рабочих, подверженных действию этих соединений.

В настоящее время содержание в конечных продуктах очень низко - менее , а нередко и . Сейчас не представляется возможным сделать какие-либо заключения относительно истинной опасности возникновения раковых заболеваний, и по этой причине следует принимать все возможные меры безопасности, включая устранение подозрительных примесей и технические меры защиты при производстве и использовании этих соединений.[82-83]

Толуидин существует в трех изомерных формах, но только о- и п- изомеры имеют промышленное значение. о-толуидин и п-толуидин легко абсорбируются через кожу, а также при вдыхании паров и пыли. Они являются мощными формирователями метгемоголобина, и острое отравление ими может сопровождаться микро- или макроскопической гематурией, но они гораздо меньше раздражают мочевой пузырь, чем 5 -хлор-о-толуидин. Существуют веские доказательства их канцерогенности для животных, и поэтому о-толуидин и п-толуидин относятся группе возможных человеческих канцерогенов.

Толуолдиамины. Среди шести изомеров толуолдиамина наиболее часто встречается 2,4-толуолдиамин, который составляет 80 % промежуточного продукта в производстве диизоцианата толуола; остальные 20 % приходятся на 2,6- изомер, который является одним из основных материалов для получения полиуретанов. На это соединение обратили внимание после обнаружения его канцерогенного действия на лабораторных животных. Данные о его влиянии на людей отсутствуют.

Ксилидины. Результаты экспериментов на животных указывают, что они, прежде всего, действуют на печень, а затем на кровь.

Азокрасители. В целом группа азокрасителей обладает относительно низкой общей токсичностью. Многие из их имеют оральный (смертельная доза) более 1 г/кг для крыс и мышей, а грызуны в лабораторных условиях получали в течение всей жизни более 1г испытуемого соединения на 1 кг пищи. Некоторые из азокрасителей могут вызывать дерматиты, но, как правило, средней тяжести; на практике очень сложно определить, вызвано ли кожное заболевание самим красителем, или сопутствующими материалами. Все возрастающее внимание уделяется канцерогенным свойствам азокрасителей. Хотя эпидемиологические исследования пока еще редки, уже накопились данные от долговременных наблюдений, подтверждающие, что некоторые азокрасители являются канцерогенами для лабораторных животных. Главным объектом таких исследований является печень; за ней следует мочевой пузырь. В некоторых случаях исследуется и кишечник. Тем не менее, достаточно проблематично экстраполировать эти результаты на людей.

Большинство канцерогенных азокрасителей являются не прямыми канцерогенами, а пред-канцерогенными веществами. То есть для того, чтобы стать настоящими канцерогенами, они должны в результате естественной метаболической активации превратиться в ближайшие канцерогенные вещества. Например, метиламиноазобензол сначала подвергается Н-гидроксилированию и Н-деметилированию в аминогруппе, а затем происходит сернокислое соединение с производной Н-гидроксида, в результате чего образуется настоящий канцероген, вступающий в реакцию с нуклеиновой кислотой.

Следует отметить, что бензидин-производные диазокрасителей могут в результате обычных обменных процессов в организме человека преобразовываться в высоко канцерогенный бензидин. В теле человека в естественных условиях или в результате действия кишечных бактерий восстанавливаются две азогруппы, в результате чего образуется бензидин. Поэтому азокрасители требуют осторожного обращения.

Таблица 1.

Токсичность некоторых нитро- и аминоароматических соединений

Ароматические амины ArNR1R2, R1, R2 = H, алкил, арил (бесцветные высококипящие жидкости или твердые вещества со специфическими запахами)
Токсическое действие. Наиболее характерным проявлением токсического действия ароматических аминов является избирательное поражение красной крови. Ключевым механизмом этого процесса является окисление гемоглобина (Hb) с переходом железа в трехвалентное состояние и образованием метгемоглобина (MtHb), в результате чего уменьшается способность гемоглобина переносить кислород к тканям и органам организма, развивается гипоксия. При содержании MtHb в крови на уровне 50 % и выше возникает реальная угроза жизни. Наряду с MtHb при интоксикации ароматическими аминами в крови появляется сульфгемоглобин (SfHb), который, в отличие от MtHb, легко восстанавливающегося в организме за счет редуктазных ферментных систем в гемоглобине, представляет собой необратимое производное Hb. Наличие в крови SfHb резко усиливает цианоз, поскольку он в 3 раза темнее, чем MtHb. При отравлении также происходит разрушение эритроцитов, следствием чего является развитие гемолитической анемии. Наряду с избирательным поражением красной крови соединения данной группы вызывают расстройства ЦНС, которые в условиях острого отравления реализуются по типу синдрома гипотонического возбуждения. Возможно также поражение печени, почек, хотя в общем избирательной гепато- и нефротоксичностью соединения не обладают, за исключением отдельных веществ, к которым относится 4-(ацетиламино)фенол (парацетамол), обладающий специфическим гепатотоскическим эффектом. Некоторые алкоксипроизводные, такие как анизидины, фенетидины, известны как почечные яды. Наиболее агрессивным по этому признаку является п-ацетилфенетидин (фенацетин), вызывающий фенацетиновый нефрит с возможным исходом в сморщенную почку. Отдельные производные проявляют канцерогенную активность. Они вызывают новообразования со специфической для ароматических аминов локализацией, а именно -- опухоли мочевого пузыря. К бластомогенам такой природы относится бензидин и его производные, а также о-толуидин.
Анилин Фениламин, аминобензол C6H5NH2 (бесцветная жидкость с характерным запахом, темнеющая на свету и на воздухе)
Токсическое действие. Является метгемоглобинообразователем. Повреждает красную кровь, приводит к гемолитической анемии регенераторного типа со снижением кислородной емкости крови и развитию гемической гипоксии. Оказывает влияние на ЦНС. Острое отравление. Острое отравление развивается при поступлении вещества с вдыхаемым воздухом, через кожу и внутрь. Смертельные дозы при приеме внутрь варьируют от 1 до 30 г. Характерными признаками острого отравления являются цианоз, бурый цвет крови, выраженность которых пропорциональна тяжести отравления. Цианоз особенно резко проявляется на деснах, губах, ушах, кончике носа, несколько менее заметен на пальцах рук и ног. Цианоз проявляется при содержании MtHb в крови в концентрации 15 % и более. При уровне MtHb 20-30 % его исчезновение из крови происходит в течение 1-3 дней без врачебного вмешательства. Наличие в крови MtHb свыше 40 % грозит летальным исходом и требует активных лечебных мер. Острое отравление характеризуется изменениями центральной и вегетативной нервных систем, включающими головную боль, головокружение, иногда потерю сознания, одышку, тахикардию, падение артериального давления, эйфорию («анилиновое опьянение»), тошноту, рвоту. Описаны случаи острой сердечной недостаточности, а также коматозного состояния с нарушением ритма дыхания. Для тяжелых форм отравления характерны увеличение и болезненность печени, гемоглобинурия. Может развиваться почечно-печеночная недостаточность с явлениями олигурии, альбуминурии, азотемии. Хроническое отравление. Наиболее характерными признаками служат изменение красной крови типа анемии. Признаки поражения аналогичны таковым при остром отравлении, но менее выражены.
2-Хлоранилин, о-Хлоранилин (бесцветная жидкость, темнеющая на воздухе)
Токсическое действие. Вызывает образование метгемоглобина. В последующем развивается гемолитическая анемия регенераторного типа и гемическая гипоксия. Поражает ЦНС, печень, почки, селезенку и сердечно-сосудистую систему. Легко проникает через неповрежденную кожу. По степени токсичности вещество близко к анилину.
4-Хлоранилин, п-Хлоранилин, (белое кристаллическое вещество)
Токсическое действие. Вызывает образование метгемоглобина. Поражает ЦНС, печень, почки, селезенку и сердечно-сосудистую систему. Легко проникает через неповрежденную кожу. По токсичности превосходит анилин. Острое отравление. У рабочих, подвергающихся воздействию вещества, выявляется цианоз. Известны случаи тяжелого отравления вследствие всасывания через кожу рук. Симптомами отравления являются головная боль, головокружение, шум в ушах, загрудинные боли, цианоз губ и ногтей, одышка.
о-Нитроанилин (желтое кристаллическое вещество)
Токсическое действие. Практически лишен гемотоксической активности. Оказывает повреждающее действие на печень. Не проникает через неповрежденную кожу. Местное действие. Оказывает слабое раздражающее действие на кожу. Раздражает кожу век и слизистую глаз.
м, п- Нитроанилин (желтое кристаллическое вещество)
Токсическое действие. Чрезвычайно активный метгемоглобинообразователь. Существует опасность отравления веществом при всасывании через кожу. [64,65]
Бензидин и его производные
Токсическое действие. Бензидин является канцерогеном, производство и промышленное применение которого привело к многочисленным случаям папилломы и карциномы мочевыводящих путей.

2. Результаты и обсуждения

В настоящее время для интенсификации и повышения эффективности протекания химических реакций, приводящих к ценным органическим продуктам, используют различные подходы, включая гомо- и гетерогенный, межфазный, мицеллярный катализ, инициаторы, ультрафиолетовое излучение, высокое давление и многие другие физические воздействия.

В последние годы достигнуты большие успехи в создании разных конструкций эффективных генераторов ультразвука, в связи с чем наблюдается повышенный интерес к использованию ультразвукового излучения для интенсификации различных химических реакций.

Целью данной работы является исследование влияния ультразвука на скорость и селективность протекания некоторых реакций, лежащих в основе синтеза практически ценных соединений, с целью их интенсификации и повышения эффективности.

Процессы получения ароматических соединений, содержащих одновременно нитро- и аминогруппы, в том числе нитроанилинов, представляют как теоретический, так и практический интерес.

Этот класс ароматических соединений включает в себя большой ряд практически ценных продуктов моногоцелевого назначения. Они используются при получении лекарств [70], красителей [71,72] и др.. Кроме того, отработка эффективных методов синтеза соединений, содержащих подобные разнообразные функции (нитро-, аминогруппа, галогены и др.) является весьма актуальной для современного органического синтеза, поскольку служит базисом для инструментария при получении широких рядов заданных структур и их модификации.

На сегодняшний день для синтеза нитроанилинов используется целый набор методов.

Разработка новых, доступных и перспективных методов синтеза органических соединений, является очень актуальной, и широко востребованной задачей. В этой связи, перед химиками-синтетиками встает вопрос о минимизации операционного времени синтеза, повышении выхода целевых продуктов, снижения количества отходов, вследствие повторного использования агентов реакции, а значит ресурсосберегающего и экологически безопасного способа проведения синтеза, а также возможности целенаправленного управления химическим процессом.

Одним из вариантов, обеспечивающих развитие данного подхода, является восстановление нитроароматических соединений в бинарных системах под действием ультразвуковых волн.

Механизм протекания звукохимической реакции была рассмотрена в 1985.

В этой теории рассматривается двойной электрический слой на поверхности расщепляющегося кавитационного пузырька. Показано, что при его расщеплении образуется некомпенсированный электрический заряд Q, который зависит от радиуса шейки (г) образующегося пузырька, дзета-потенциал а, частоты и амплитуды акустических колебаний, электропроводности жидкости и т.д. При отрыве осколочного пузырька некомпенсируемый заряд локализуется на малой площадке радиуса r. Напряженность возникающего электрического поля Eн=Q/2р?₀r² (?₀- диэлектрическая проницаемость газа), для обычных экспериментальных параметров Eн ?10⁸-10¹¹В/м. T. к. критическая напряженность для электрического пробоя в сухом воздухе при атмосферном давлении Eкr = 3·106 В/м, а Екр пропорциональна давлению газа, электрический заряд в кавитационном пузырьке может образовываться с высокой вероятностью даже при давлениях, значительно превышающих атмосферное.

Хим. реакция, возникающая в жидкости под действием звукохимической реакции, подразделяется на окислительно-восстановительной реакции, протекающие в водных растворах между растворенными веществами и продуктами разложения молекул воды внутри кавитационного пузырька (H, ОН, H₂, H₂O₂), напр.:Fe²⁺+OH^-=Fe⁺³+OH^- [84].

Из ранее проведенных на кафедре органической и биологической химии ЯрГУ им. П.Г. Демидова работ, следует, что одним из перспективных восстанавливающих агентов являются соли металлов переменной степени окисления. Однако, также отмечались и недостатки этого метода: сложность выделения целевых продуктов реакции, а также в ряде случаев при восстановлении замещенных динитробензолов наблюдается низкая селективность процесса.

Поэтому, для устранения этих недостатков был предложен новый метод восстановления нитроаренов, заключающийся в проведении реакции в спиртах, не смешивающихся с водой под действием ультразвука. В данной системе реакционная масса переходит из бинарного в гомофазное состояние, позволяя тем самым увеличить выход продукта (скорость реакции в гомогенной среде выше, чем в гетерогенной, т.к. увеличивается площадь взаимодействия агентов реакции), а при прекращении воздействия ультразвука вновь расслаивалась на две фракции, позволяя разделить компоненты реакции. Таким образом, достоинства данной методики заключается в уменьшении операционного времени процесса как за счет уменьшения времени самого процесса восстановления, так и упрощения выделения продуктов реакции.

Отсутствие экстракции - неотъемлемой стадии при восстановлении в обычных условиях без использования ультразвука позволит избежать проблем связанных с выделением продукта реакции из-за низкой растворимости его в хлороформе, а также позволяет экономить время и реактивы.

Возможность регенерации продуктов этой реакции (восстановление металла под действием электрического тока) уменьшает количество отходов, тем самым позволяет экономить ресурсы.

Важной особенностью этой системы - изобутиловый спирт, практически не растворим в воде (растворимость изобутанола по данным справочника составляет 9,5% при 18°C), важно было подобрать тот агент (металл), соль которого растворялась лишь только в водной фракции. Им оказался сульфат железа (II).

Использование других восстанавливающих агентов, таких как хлорид титана(III), хлорид олова (II), растворимых как в воде, так и в спирте, оказалось невозможным, так как вызывает загрязнение продукта, из-за трудности его выделения из реакционной массы. Регенерацию железа лучше всего осуществлять электрохимическим методом. Этот способ позволяет вернуть в цикл практически все железо.

Данная методика позволяет восстанавливать одну две и несколько нитрогрупп в замещенных нитроаренах с высоким выходом - до 95% и отсутствием побочных продуктов.

Мы предлагаем использовать данный способ для селективного восстановления полинитроароматических соединений. Методика была отработана для 2,4-динитротолуоле и, в дальнейшем, проведена на ряде веществ с использованием свежеприготовленного сульфата железа (II) и изобутилового спирта. Как известно, с увеличением длины углеводородного ряда спирта, селективность такого растворителя увеличивается.

Процесс селективного восстановления схематично представлен на рис 1.

Рис.1.Схема проведения селективного восстановления динитроарена.

Полученные результаты мы сравнили с селективным восстановлением с помощью солей металлов переменной валентности без применения ультразвука. В приведенной ниже таблице приводятся данные селективного восстановления 2,4-динитротолуола в метаноле по старой схеме, приведенной в приложении (схема №1), и по новой методике с использованием ультразвуковых волн и, применение в качестве растворителя, изобутилового спирта.

Таблица .1. Сравнение выхода продукта

Метанол
Выход + исходный, %	Количество исходного, %	Выход ортоизомеров,%	Выход параизомеров, %	Пара/орто, метаизомеры
(TiCl3) 91,8	54,17	18,89	21,01	0,9
(SnCl2) 97	57,4	8,5	34,1	0,25
Изобутанол + ультразвук
(FeSO4) 99,94	29,08	70,86	-	-

Как видно из приведенных данных в таблице, в реакциях с участием в качестве восстанавливающего агента хлорида титана(III) и хлорид олова(II) мы наблюдаем низкий выход как орто- так и пара- изомеров, а также высокое содержание исходного продукта. Все это свидетельствует о неприменимости данных металлов переменной валентности в системе селективного восстановление динитроаренов.

Синтез, протекающий в условии ультразвука, с использованием в качестве восстановителя сульфат железа(II), характеризуется высоким выходом орто-изомера, а также отсутствием других изомерных форм восстановления.

Восстановление одной нитрогруппы именно в орто- положении 2,4-динитротолуола свидетельствует о узкой специфичности предложенных условий протекания селективного восстановления нитроароматических соединений.

Для анализа полученных продуктов реакций восстановления мы использовали газожидкостную хроматографию. Этот метод позволяет анализировать состав смеси продуктов синтеза без их предварительного разделения.

1. Диаграмма. Газожидкостная хроматография 2,4-динитротолуола



№	Время, мин	Компонент	Высота,мв	Площадь, мв*мин	Высота,%	Площадь,%	Ширина,сек
1	9,93		0,198	0,0269	0,0323	0,0134	8,80
2	12,24	2,4-динитротолуол	199,303	58,5060	32,5818	29,0761	34,16
3	15,01		0,138	0,0239	0,0226	0,0119	11,52
4	15,62	2-амино-4-нитротолуол	411,805	142,5876	67,3215	70,8626	25,72
5	18,47		0,255	0,0724	0,0418	0,0360	11,96
			611,699	201,2168	100,0000	100,0000

Из приведенной выше диаграммы видно, что пик орто-изомера выявлен на 15 минуте. Площадь под пиком равна 70,86 % -что соответствует процентному содержанию целевого продукта в реакционной массе. Пик исходного вещества выявлен на 12 минуте, площадь под пиком составила 29,08%- это процентное содержание исходного компонента.

Если сравнить полученные результаты, обнаруживается одно из достоинств данной методики - крайне малое содержание исходных продуктов реакции. Если при селективном восстановлении динитроарен в метаноле содержание субстрата реакции 54,17% при использовании в качестве восстановителя TiCl₃ и 57,4% при использовании SnCl_2.

2. Диаграмма. Газожидкостная хроматография для 2,5-динитрохлорбензола, 3,4-динитрохлорбензола

№	Время, мин	Детектор	Компонент	Высота,мв	Площадь,мв*мин	Высота,%	Площадь,%	Ширина,сек
1	2,24	ПИД-2	2,5-динитрохлорбензол	366,597	12,1207	23,2610	24,5449	4,16
2	2,33	ПИД-2	2,5-диаминохлорбензол	343,245	11,4837	21,7793	75,4127	1,88
3	2,45	ПИД-2	2-хлор-5-нитроанилин	329,135	11,5531	20,8840	75,5360	2,60
4	2,66	ПИД-2	4-хлор-3-нитроанилин (2,33м.)ддинитрохлорбензол - 0,0103г. (2,33м.)	254,751	9,6459	16,1643	67,1459	3,56
5	2,72	ПИД-2	3,4-динитрохлорбензол	282,289	11,4544	17,9115	32,3605	1,76

Из приведенной выше диаграммы видно, что методика селективного восстановления полинитросоединений в бинарных системах под действием ультразвуковых волн, позволяет синтезировать продукты без отсутствия изомерных смесей продуктов, а так же обеспечивает высокий выход продуктов реакций. На 2,45 мин. детектор обнаружил продукт с выходом 75,5% . Чуть меньше выход наблюдается на 2,66 минуте у 4-хлор-3-нитроанилина - 67,5% , но процентное содержание субстрата реакций остается также на низком уровне: 24,5 % и 32% соответственно для продукта 4-хлор-3нитроанилина.

На диаграмме так же присутствует соединение полного восстановления динитросоединения до диамина с целью выявлении закономерностей изменения токсичности исходных субстратов и их продуктов.

Таблица 2. Таблица полученных результатов.

Вещество	Условия	Восстан. агент	Выход
			Исходный продукт, %	Ортоизомеры, %	Параизомеры, %	Орто/параизомеры, %
2,4-динитро-толуол	Метанол	TiCl3	54,17	18,89	21,01	0,9
	Метанол	SnCl2	57,4	8,5	34,1	0,25
	Изобутанол+ ультразвук	FeSO4	29,08	70,86	-	-
2,5-динитро-хлорбензол	Изобутанол+ ультразвук	FeSO4	24,5	-	75,4	-
3,4-динитро-хлорбензол	Изобутанол+ ультразвук	FeSO4	32,36	67,14	-	-

Акустическое воздействие оказало значительное влияние на скорость и направление протекания реакций, снизило общее операционное время проведения синтеза, повысив выход целевого продукта. Многие реакции, осуществляемые с применением ультразвуковых волн, могут проходить при пониженных температурах. Ультразвук способен понижать энергию активации, тем самым являясь катализатором процесса, а, в отсутствие акустического воздействия, система не может быть использована в операционных целях.

В данной работе применение ультразвукового излучения позволило повысить селективность протекания химических процессов.

Исследования продолжились в токсикологическом опыте с использованием тест-объектов.

Билогическая часть

Тест - объектом традиционно используется рачки-дафнии. Способ применим для биологического контроля токсичности водных сред. В способе биотестирования токсичности водной среды путем сравнения изменений параметра вибрации контролируемой области биологического тест-объекта в процессе оптического облучения при помещении объекта в контрольную и анализируемую водные среды перед помещением в водную среду предотвращают движение тест-объекта как целого, оценивают период движения контролируемой области тест-объекта и определяют диапазон изменения основной частоты вибрации контролируемой области, формируют прямое и отраженное от исследуемой области объекта отражение, суммируют их и воздействуют им на источник излучения, регистрируют периодические изменения интенсивности излучения источника, выделяют из спектра зарегистрированного сигнала гармонику с максимальной амплитудой в заданном диапазоне изменений частоты вибрации, после чего определяют точное значение основной частоты вибрации, выделяют из спектра гармоники с максимальной амплитудой вблизи частот, кратных основной частоте вибрации, и по их набору судят о контрольных значениях формы движений контролируемой области тест-объекта, сравнивают со значениями формы движений в токсичной водной среде и по отклонению формы вибрации от контрольных значений судят о степени токсичности водной среды. Достигается повышение достоверности (информативности) за счет большего числа исследуемых параметров.

нитроанилин динитропродукт токсичность синтез

3. Экспериментальная часть

Схема №1. Селективное восстановление динитросоединений, минуя стадию экстракции

В синтезе использовался восстанавливающий агент: свежеприготовленный раствор сульфат железа(2). Для того, что бы его приготовить, потребовалась железная пыль, которая помещалась в 20% раствор серной кислоты до полного растворения.

Примеси отфильтровывались бумажным фильтром.

Рис. 1. Процесс восстановление нитросоединений до аминоароматических продуктов

Теоретически, для того, что бы восстановить одну нитрогруппу в динитроароматическом соединении, по количеству ионов железа рассчитывалась необходимая масса навески динитротолуола и других полинитросоединений(известно, что на восстановление одной нитрогруппы требуется 6 моль ионов железа).

Рассчитанную навеску растворяли в изобутиловом спирте, слегка подогревая смесь над электроплиткой, и доводили до полного растворения ди- и полинитросоединения.

После того, полученный раствор сульфат железа(II), не дожидаясь его окисления на воздухе, что могло привести к потере восстановительных свойств этого агента, поместили в ультразвуковую мойку. Туда же прилили изобутиловый спирт, содержащий ароматическое соединение.

Из схемы №1 видно, что водный раствор и изобутиловый спирт не смешиваются, и образуется бинарная система.

Режим ультразвуковой мойки был установлен на продолжительность синтеза в течение 10 минут, температура процесса составляла 40^оС.

В процессе воздействия ультразвуком, бинарная система перешла в гомофазную, что обеспечило наибольшее соприкосновение реагентов в искомых двух не смешивающихся растворов.

Рис.2.Реактор - после окончания реакции происходит расслоение на 2 фазы

После процедуры с ультразвуком, полученную смесь поместили в экстракционную колбу. В экстракционной колбе смесь разделилась на две фракции: водную, содержащую в себе неорганическую часть, и органическую. В этой фракции, т.е. в изобутиловом спирте(плотность меньше 1 (0,8027 (20°C, г/см3)), следовательно вода внизу), содержался продукт реакции.

С целью выделения органических компонентов из полученную реакционную смесь подщелачивали аммиаком до рН=6,5-7,5. Полученную массу экстрагировали хлороформом 5-8 раз (объём хлороформа равен объёму смеси). В дальнейшем хлороформ отгоняли под вакуумом досуха.

Смесь после сушки под вакуумом анализировали методами ГЖХ и ЯМР 1Н - спектроскопии. ИК - спектры записывали на приборе SPECORD М-80. Анализ веществ проводили в растворе СНCl₃ при спектральной ширине щели прибора 1,5 см-1, времени интегрирования 5 с. Применялись кюветы толщиной 0,1 - 0,2 мм с окошками из NaCl.

ЯМР 1Н спектры записывали на спектрометре Bruker DRX (500.13 МГц) в ДМСО, с ТМС в качестве внутреннего стандарта при комнатной температуре.

Элементный состав определяли на элементном анализаторе СHN-1.

Молекулярную массу определяли из масс-спектра, полученного на приборе МХ-1310.

3.1 Эксперимент на Ceriodaphnia affinis

Цериодафнии как тест-объект для токсикологических исследований

Ветвистоусые рачки родов Daphnia и Ceriodaphnia широко распространены в водоемах, поэтому легко доступны для исследования. Они имеют небольшие размеры, не требовательны, высоко плодовиты и имеют короткий цикл развития. Тело их заключено в прозрачную камеру (карапакс), благодаря чему есть возможность на живых экземплярах наблюдать процесс созревания яиц в гонадах, прохождение пищи по пищеварительному тракту, дыхательные движения, ритм сердцебиения. Эти показатели являются весьма важными при постановке токсикологических опытов для оценки степени токсичности и механизма действия веществ [23]. Кроме того, их использование в качестве тест-организмов для биотестирования рекомендовано для государственного экологического контроля [20].

Рачки вида Ceriodaphnia affinis обитают в пресноводных водоемах Европы, Северной Америки, Азии, Северной Африки. Этот вид относится к олиго- и бетамезосапробам и населяет водоемы с замедленным течением (неглубокие озера, реки, водохранилища).

Цериодафнии имеют сравнительно мелкие размеры (половозрелые самки - 1,5 мм, самцы - 0,8 мм), что позволяет в опытах манипулировать с меньшими объемами воды и более компактными емкостями. Биологический цикл развития от рождения до половозрелости у цериодафний короток при оптимальных условиях развития. Так, при температуре 25^oС созревание наступает на 2-3-и сутки от рождения, время первого помета - на 3-4-е сутки, а за срок 7-8 суток у рачков получают 3 помета.

При температуре 18^oС сроки получения трех пометов у рачков могут растянуться до 28 суток. Численность молоди у рачков в первом помете невелика - по 2-6 особей, а начиная со второго помета - от 6 до 20 особей на самку. Этот вид цериодафний моно- или дицикличен. Максимум полового периода размножения приходится на август-сентябрь. В лабораторных условиях самцы появляются при недостаточном освещении, снижении температуры, концентрации растворенного кислорода, голодании.

По отношению к кислородному фактору цериодафния довольно чувствительна, ее нормальное развитие протекает при концентрации растворенного кислорода в воде не ниже 5 мг П₂/л. Вследствие этого цериодафнии чувствительны к органическому загрязнению веществами, снижающими концентрацию растворенного кислорода в среде.

Исследуя биологическое действие химических соединений, токсикологи регистрируют изменение выживаемости и плодовитости (основные показатели), длину тела цериодафний, используют биохимические и биофизические показатели; иногда встречаются данные об изменении морфологических признаков.

3.3 Методика проведения острого опыта на Ceriodaphnia affinis

В помещении, где содержатся цериодафнии, недопустима обработка химическими веществами с целью уничтожения насекомых, грызунов и др.

Лабораторную культуру Ceriodaphnia affinis ведут на природной воде из водоема либо на водопроводной воде, отстоянной не менее семи суток и желательно дехлорированную путем аэрации. Вода должна удовлетворять следующим требованиям:

1) рН - 7,8-8,2;

2) общая жесткость - 1,3-2,0 мг-экв/л;

3) содержание растворенного кислорода - 5,0-7,0 мг О₂/л.

Рачков лучше всего культивировать в стаканах емкостью 0,5-1 литр, с плотностью посадки не более одной особи на 20 мл объема. При этом удается более объективно оценивать качество культуры, ее пригодность для токсикологических исследований, а также дает возможность вести клональные культуры. С целью адаптации рачков к условиям лаборатории их помещают в смешанную воду: 1 часть среды, в которой рачки жили ранее, и 3 части лабораторной воды. Культуральная среда обновляется полностью один раз в неделю.

В качестве корма для цериодафний используют зеленые протококковые водоросли (Chlorella vulgaris) и пекарские дрожжи. Водоросли вносят в концентрации 250-500 тыс. кл/мл ежедневно (2 мл суспензии на 1 л воды). Дрожжи дают не чаще одного раза в неделю (1-2 мл 1%-ного раствора на 1 л), желательно перед сменой раствора.

Культуру цериодафний выращивают в климатостате, люминостате или бюксе при оптимальных условиях содержания: температуре (25±1)^oС, освещенности 400-600 лк, продолжительности светового дня 10-12 ч.

При культивировании цериодафний удобно содержать рачков двух поколений - материнского (размножающиеся особи) и подрастающей молоди. Продолжительность использования маточных культур ограничивается 15-20 сутками. Отмечается каждое родившееся в лабораторных условиях поколение, и ставится дата рождения.

Для токсикологических исследований используют цериодафний, начиная с третьего поколения. Рачков в возрасте (4±2) ч исследуют на устойчивость к стандартному токсиканту - бихромату калия в остром опыте. Величина LC₅₀ бихромата калия за 24 часа находится в интервале 1,0-2,2 мг/л.

В дальнейшем эксперименты с бихроматом калия ставят одновременно с постановкой основного острого опыта с каждым веществом [54, 55, 57].

Перед основными острыми опытами проводят предварительные опыты для установления диапазона концентраций исследуемых веществ, которые вызывают иммобилизацию или гибель рачков в интервале 10-90 %. В предварительном остром опыте обычно используют по 5 концентраций для каждого вещества, различающихся в 10 раз: 100; 10; 1; 0,1; 0,01 мг/л. Длительность опыта 24 или 48 часов. Из концентраций, используемых в предварительных опытах, отбрасывают концентрации, которые вызывают гибель 0 или 100 % рачков. Оставшийся диапазон концентраций (в котором находится искомая летальная концентрация, вызывающая гибель 50 % рачков) используется для основного острого опыта.

Продолжительность основного острого опыта для данного объекта исследования составляет 48 часов. Основным биологическим показателем служит выживаемость гидробионтов (процент гибели). Острый опыт проводится с набором из пяти концентраций исследуемого вещества, входящих в диапазон, установленный в предварительных испытаниях.

Растворы веществ для опытов готовятся с учетом их растворимости.

Для опытов используют химические стаканы объемом 250 мл, куда наливают по 50 мл раствора токсиканта и вносят от 5 до 10 рачков Ceriodaphnia affinis в возрасте (6±2) ч. Для статистической достоверности используют не менее трех повторностей для каждой концентрации. Параллельно ставят контрольные опыты с отстоянной водой и водой с растворителем, использовавшимся для растворения исследуемых веществ в концентрациях, соответствующих разведениям в опытах. Повторность контролей соответствует повторности в опытах. Если в контроле наблюдается значительная гибель организмов, опыт бракуется и должен быть повторен.

Условия проведения опытов те же, что и при разведении культуры цериодафний, но в ходе острых опытов рачков не кормят, а смену раствора проводят ежедневно.

Наблюдения за выживаемостью проводят непрерывно в течение первого часа воздействия раствора, через каждые 15 минут в продолжение второго часа, затем ежечасно до конца первого дня наблюдений, на следующий день - 2-3 раза в сутки [54, 55].

3.4 Обработка и оценка результатов эксперимента на Ceriodaphnia affinis

Для определения наличия острого действия растворов исследуемых веществ на цериодафний рассчитывают летальность (L, %) рачков для каждой концентрации и находят медиальную летальную концентрацию.

Летальность (L, %) рассчитывается по формуле:

где X_K - число выживших особей в контроле, шт.;

X_о - число выживших особей в тестируемой воде, шт.

В случае гибели дафний в контроле от 5 до 20 %, вносят поправку в результаты по формуле Аббота:

Результаты всех повторностей суммируются, и определяется средняя смертность организмов в данной концентрации токсиканта. По ней рассчитываются величины LC₅₀ за 48 часов и определяются действующие концентрации веществ по наличию статистически достоверного снижения величины выживаемости цериодафний в опыте по сравнению с контролем.

Достоверность полученных результатов считается надежной, если удовлетворены следующие условия:

1) гибель контрольных цериодафний не превышает 10 %;

2) LC₅₀ бихромата калия за 24 часа для цериодафний в возрасте (6±2) часов находится в интервале 1,0-2,2 мг/л;

3) содержание растворенного кислорода в исследуемых растворах, определенное в конце опыта, не ниже 5,0 мг О₂/л [54, 55, 57].

Медиальная летальная концентрация (LC₅₀) определяется с помощью графического метода. Он основан на определении LC₅₀ по кривой летальности или характеристической кривой, отражающей распределение индивидуальной устойчивости животных к исследуемому токсическому агенту. Характеристическая кривая строится путем нанесения концентраций или логарифмов концентраций по оси абсцисс, а процента летальности - по оси ординат. В полуграфическом виде эта зависимость близка к прямой. От точки на оси ординат, соответствующей 50 % смертности, проводится линия, параллельная оси абсцисс. Из точки пересечения этой линии с опытной прямой опускают перпендикуляр на ось абсцисс. Полученная концентрация разбавления С_х и будет соответствовать искомой величине LC₅₀. Медиальную летальную концентрацию можно найти, решив уравнение, описывающее характеристическую кривую. Чем больше LC₅₀, тем токсичнее тестируемое вещество.

Зависимость между концентрацией и эффектом (в данном случае процентом гибели животных) при графическом изображении должна иметь вид S-образной кривой. При логарифмировании концентраций кривые становятся более симметричными [56].

3.5 Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов можно проводить с использованием различных критериев достоверности. Широко используется в практике t-критерий Стьюдента. Применение его возможно только в том случае, если при некоторых строго определенных условиях распределение величины известно, т.е. является нормальным. Для проверки гипотезы о нормальном распределении величины используют критерий Фишера, который и позволяет оценить равенство дисперсий. Если дисперсии равны, то распределение является нормальным и использование t-критерия Стьюдента возможно. В этом случае расчет производится по формулам для малых выборок [59-61].

Вычисляют среднее значение (Х) для каждой величины по формуле:

где X_i - значение каждой величины;

n - количество проанализированных вариантов.

Затем определяют отклонение каждого варианта от средней величины (D):

Среднее квадратичное отклонение () вычисляют по формуле:

где D - отклонение каждой величины от средней;

n - количество проанализированных вариантов.

Ошибку среднего (m) вычисляют по формуле:

где - среднее квадратичное отклонение;

n - количество проанализированных вариантов.

Для выявления достоверности различий в показателях токсичности между опытным и контрольным вариантами рассчитывают t-критерий Стьюдента:

где m_о - ошибка среднего в опытном варианте;

m_K - ошибка среднего в контрольном варианте;

Х_о - среднее значение опытного варианта;

X_K - среднее значение контрольного варианта.

Его сравнивают с табличным td (соответствующим заданному уровню значимости и степени свободы). Если рассчитанная величина t-критерия Стьюдента больше или равна табличному значению критерия, то различия между величинами показателя в контрольной и тестируемой воде достоверны, и тестируемая вода оказывает острое токсическое действие на гидробионтов [58, 59, 62].

Приложение

Схема №1. Восстановление нитросоединений.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Схема №2.Селективное восстановление динитросоединений, минуя стадию экстракции

Рис.1.Схема проведения селективного восстановления динитроарен.

Рис.2. Реактор - после окончания реакции происходит расслоение на 2 фазы

Литература

1. Н.Н. Ворожцов // Основы синтеза промежуточных продуктов и красителей, Госхимиздат, 1955.

2. Б.. Богословский, Н.Г. Лаптев // Химия красителей. Изд. научи.-тех. лит. РСФСР, 1960.

3. Н.А. Преображенский, Э.И. Генкин // Химия органических лекарственных веществ, Госхимиздат, 1953.

4. Инф. бюлл. о зарубежн. хим. пром., НИИТЭхим, № 14, 5 (1962).

5. D. Вгaun, Kunststoffe, 50, 375 (1960).

6. Матвеев Л.Г. Улучшенный способ получения 2-амино-4-нитрофенола. // М.: Хим. промышленность.- 1984.- N3.- с.143-144.

7. Пат. 2916815 ФРГ // 1980.

8. Фирц-Давид Г.Э., Бланже Л. Основные процессы синтеза красителей.- М.:

ИЛ.- 1957.- 382 с.

9. M.Hoyo, V.Takagi, Y.Ogata // J.Am.Chem.Soc.- 1960.- v.82, № 10.- p.2459-

2462.

10. Hurashima Tsucnaki, Manabe Osamu. // Chem.Zelt.-1975.- v.3.- p.259-260.

11. Terpko M.O., Heck R.F. // J.Org.Chem.- 1980.- v.45, № 24.- p.4992-4993.

12. Пат. 215912 ГДР // 1981.

13. J.L. Miesel, G.O.P. O'Doherty, and J.M.Owen. Catalysis in Organic Synthesis.- Academic Press, New York, 1976.

14. Molga E.J., Westerterp K.R. // Chem.End.Sci.- 1992.- v.47, № 7.- p.1733-1749.

15. Davey C.L., Powell L.W., Turner N.Y., Wells A. // Tetrahedron Lett.-1994.- 35. № 42.- С. 7867

16. Пат. 215912 ГДР // 1981.

17. А.с. 578303 СССР // 1978.

18. Chemikal Analit.- 1964.- vol.46, № 12, р. 601-606.

19. Пат.289454 Германия // 1912.

20. Robert E. // Ber.- 1927.- Bd.66.- s.173.

21. Vojiz W. // Chem. prium.- 1981.- vol.31,N 2.- s.74-75.

22. Houben-Weyl. Methoden der organischen Chemie. Stuttgart: G. Thieme Verlag.- 1957 - Bd.11/1.- p.474-490

23. Blanksma J.J., Broek W.S., Halgen D. // Rec.trav. Chim.Bas.- 65, 1946.- p.329.

24. Claus A., Stiebel B. // Ber.- 1887.- Bd.20.- s.1379-1382.

25. Копейкин В.В., Копейкин В.А., Миронов Г.С. и др.// Основной органический синтез и нефтехимия: Межвуз. сб. научн. тр.-Ярославль, ЯПИ, 1983.-в.19.-С. 65-68

26. Копейкин В.А. Селективное электрохимическое восстановление ароматических нитронитрилов.- Дис. ... канд. хим. наук.- Москва, 1985.- 158 с.

27. Бегунов Р.С., Орлов В.Ю., Копейкин В.В. и др. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. -1998.- т. 41, в. 5.- С. 9-11.

28. Орлов В.Ю., Бегунов Р.С., Орлова Т.Н., Копейкин В.В. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. -1998.- т. 41, в. 6.- С. 79-83. А.с. 1558892 СССР. //Б.И.- 1990.- № 15.

29. Leibzon V.N., Michalchenko L.V., Leonova M.Yu., and Gultyai V.P., Absrs Electrochemical Society 197^th Meeting (Toronto, May 14-18, 2000), Toronto, 2000, 1, Abstract No. 1069.

30. Leibzon V.N., Michalchenko L.V., Leonova M.Yu., and Gultyai V.P., in New Directions in Organic Electrochemistry, Y. Matsumura, The Electrochemical Society, Inc., Pennington, USA, 2000, 15, 60.

31. Билькис И.И., Гойдин В.В., Усков С.И., Штейнгардц В.Д., Журн. орган. химии, 1991, 27, 24.

32. Билькис И.И., Усков С.И., Штейнгарц В.Д., Изв. Сиб. Отд. АН СССР, 1987, 3, 111.

33. S.E. Barrows, C.J. Cramer, D.G. Truhlar, M.S Elovit, and E.J. Weber, Envirion. Sci. Technol., 1996, 30, 3028.

34. В.Н Лейбзон, Л.В Михальченко, М.Ю. Леонова, В.П Гультяй Изменение региоселективности моновосстановления 2,4,6 - тринитротолуола ионами титана (111) и ванадия (11) в присутствии солей железа(11) и меди (11). /Изв. Академии наук. Сер. Хим. 2005, № 5, с. 1172-1176

35. Brand K., Eisenmenger T. // J. Pract. Chemie.- 1913.- 87.- s.487-507.

36. Иванов В.И. Электрохимическое восстановление динитропроизводныхбензола.- Дис. ... канд. хим. наук.- Москва, 1988.

37. Лисицин Ю.А. Электросинтез ароматических аминов.- Дис. ... канд. хим. наук.- Казань, 1991.- 167 с.

38. Davey C.L., Powell L.W., Turner N.Y., Wells A. // Tetrahedron Lett.-1994.- 35. № 42.- С. 7867.

39. Реакция гидробионтов на загрязнения / Под. ред. Строганова Н.С. - М.: Наука, 1983. - 177 с.

40. Основы промышленной токсикологии / Под. ред. Толоконцева Н.А. - С.-П.: Медицина, 1978.-303 с.

41. Биологические аспекты охраны и рационального использования окружающей среды: Сб. науч. Тр./ Днепропетровск, 1977.

42. Вопросы охраны природы и рационального использования природных ресурсов / Под. ред. Жекулина В.С.- С.-П., 1978.

43.Химическая энциклопедия. Научное издательство: «Большая Российская энциклопедия». 1995. Т. 4. с. 13.

44. Евгеньев М.И. Тест-методы и экология / М.И.Евгеньев // Соросовский образовательный журнал. - 1999. - №11. - С. 29 - 34.

45. Брагинский Л.П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на Daphnia magna и других ветвистоусых ракообразных / Л.П. Брагинский // Гидробиологический журнал. - 2000.- №5. - с.50 - 57.

46. Розанцев Э.Г. Биотестирование, или биологическая оценка безопасности / Э.Г. Розанцев, Е.Г.Черемных // Экология и промышленность России. - 2003. - № 10. - С.44-46.

47. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование: учеб.пособие для студ.высш.учеб. заведений / О.П. Мелеховой, Е.И. Егоровой, Т.И. Евстегнеева и др.; под ред. О.П.Мелеховой, Е.И. Егоровой. - М.: Издательский центр «Академия», 2007. - 288 с.

48. Реакция гидробионтов на загрязненияю / Под. ред. Строганова Н.С. - М.: Наука, 1983. - 177 с

49. Моделирование и контроль качества вод: сб. науч.тр. - Харьков, 1988. - 167 с.

50. Филенко О.Ф., Соколова С.А. // Методические рекомендации по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение. М.: ВНИРО, 1998. С. 33-69.

51. Муравьева С.И. Руководство по контролю вредных веществ в воздухе рабочей зоны: справ. Издание / С.И.Муравьева, М.И. Буковский, Е.К. Прохорова. - М.: Химия, 1991. - 368 С.

52. Филенко О.Ф., Соколова С.А. // Методические рекомендации по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение. М.: ВНИРО, 1998. С. 33-69.

53. http://abc.vvsu.ru/Books/ecolog_tocsicolog/page0005.asp

54. Филенко, О.Ф. Методические рекомендации по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение / О. Ф. Филенко, С.А. Соколова. -- М.: ВНИРО, 1998. -- С. 33-69.

55. РД 118-02-90. Методическое руководство по биотестированию воды. -- М.,1991.--64 с.