Кинетика ферментативного гидролиза полипептидов и гидрофобные эффекты

Таким образом, в третьей главе описаны принципы компьютерного моделирования протеолиза. Описана программа PROTEOLYSIS, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, описывающих демаскирование и гидролиз пептидных связей с учетом материального баланса по субстрату и ферменту. Программа позволяет предсказывать кинетику гидролиза с различными параметрами специфичности и маскированности, что позволяет проверять механизмы протеолиза. Программа удовлетворительно предсказывает места расщепления цепи (сайты) и состав гидролизатов.

Рис.11. Зависимость усредненной константы скорости гидролиза от d для m=0.05 и k_d=1.1 Отношение k_d/k_h=32.5 (), 23.8 (¦), 13.1 (^).

Рис.12. Зависимость усредненной константы скорости гидролиза от d для m=0.6 и набора индивидуальных констант k_Trp=10, k_Tyr=0.5, k_Phe=0.5, k_{Leu,Met,Asn,Gln}=0.003. Отношение k_d/k_h=3.3 (), 6.6 (?), 12.1 (^), 22 (Ў), 55 (¦).

В четвертой главе описываются наши эксперименты по определению гидратации водных растворов аминокислот, белковых гидролизатов, казеиновых мицелл и синтетических белковоподобных полимеров с помощью метода миллиметровой спектроскопии. Метод миллиметровой спектроскопии сравнивается с методом дифференциальной сканирующей калориметрии, позволяющей оценивать гидратацию по теплоемкостям гидратации.

В разделе 4.1 рассмотрен вариант метода миллиметровой (микроволновой) спектроскопии, основанный на резонансном эффекте. При помощи миллиметровой спектроскопии возможно определить фракцию свободной воды - фракцию молекул H₂O, обладающих вращательной подвижностью в соответствии с моделью "ожиданий и перескакиваний". Вращательные движения возможны из-за понижения активационного барьера вращений благодаря взаимодействию молекулы воды с дополнительной молекулой воды, т.е. с пятой соседней молекулой H₂O в тетраэдрической сетке водородных связей. Параметры гидратации были определены по дефициту поглощения (в терминологии Ю.И. Хургина) Khurgin Y.I., Kudryashova V.A., Zavizion V.A., Betski O.V. // Advances in Chemical Physics Series, W. Coffey (Ed.). - V. 87. - New York: Wiley, 1994. - P. 483., т.е. разнице в поглощении невозмущенной воды и воды в растворе. Этот дефицит приписывался уменьшению подвижности воды вследствие присутствия растворенной молекулы. Число гидратации N, число связанных молекул воды, было вычислено согласно следующей формуле:

, (13)

где С_{1 -} молярная концентрация водной компоненты, C₁^f - молярная концентрация свободной воды по данным поглощения миллиметрового излучения, С₂ - молярная концентрация растворенного вещества.

Числа гидратации природных a-аминокислот (кроме цистеина), находящихся в форме цвиттерионов H₃N⁺CHRCOO^-, были определены методом миллиметровой спектроскопии при частоте излучения 31ГГц и малой мощности излучения (1мВт), обеспечивающей нетепловой режим измерений (рис.13). Для аминокислот, известных как гидрофобные (Leu, Ile, Trp, Phe), получаются относительно большие величины N. Это согласуется с фактом, что гидрофобная гидратация сопровождается стабилизацией сетки Н-связей воды в первом гидратном слое гидрофобных групп. Таким образом, микроволновой метод позволял количественно выражать гидрофобность аминокислот, и были все основания полагать, что он мог быть эффективным для регистрации процессов, происходящих при изменении количества неполярных групп, экспонированных в сторону водного окружения.

Рис.13. Зависимость чисел гидратации N от площади доступной поверхности неполярных групп (Е²) для цвиттерионов природных a-аминокислот.

Шкала гидрофобности аминокислот по данным миллиметровой спектроскопии устанавливает следующий порядок уменьшения гидрофобности: Ile (8.2), Leu (7.4), Trp (7.1), Phe (6.5), Val (6.2), Tyr (5.4), Met (3.9), Lys (3.4), Arg (2.5), Thr (2.2), Pro (2.2), Ala (1.9), Gln (1.9), His (1.9), Asp (1.4), Glu (1.4), Ser (0.8), Asn (0.8), Gly (-1.3). Теплоемкость гидратации DC_p,h= C_p,2 - C_p^g, представляющая собой разность между парциальной мольной теплоемкостью вещества в водном растворе (С_p,2) и мольной теплоемкостью в газовой фазе (C_p^g), представлена для цвиттерионов a-аминокислот в таблице 7. Для глицина получено отрицательное значение DC_p,h (наименьшее среди всех аминокислот), что соответствует данным миллиметровой спектроскопии. Вычисления инкрементов функциональных групп были проведены из данных для цвиттерионов аминокислот (таблица 7), а не модельных незаряженных органических соединений.

Таблица 7. Теплоемкости гидратации (DС_p,h) цвиттерионов a-аминокислот при 298К.

Вклады в гидратацию неполярных и полярных групп, полученные миллиметровой спектроскопией, сравнены с термодинамическими данными, полученными нами для цвиттерионов аминокислот (таблица 8). Оба метода имеют близкую чувствительность по отношению к разным типам гидратации. Установлено, что вклады в гидратацию полярных групп на порядок меньше, чем вклад метиленовой группы. Вклад цвиттерионного фрагмента отрицателен, и по относительной величине сопоставим для обоих методов.

Таблица 8. Вклады в гидратацию различных групп по данным двух методов.

Коэффициенты корреляции индексов гидрофобности для шкал гидрофобности, предложенных к настоящему времени, невелики (порядка 0.5-0.6). Наша шкала, построенная по данным миллиметровой спектроскопии (шкала 1, таблица 9), и шкала, построенная по теплоемкостям гидратации аминокислот (шкала 2), коррелируют с гораздо более высоким коэффициентом (0.973). Объяснение заключается в том, что обе представленные шкалы гидрофобности основаны на измерениях динамических свойств воды, хотя и на различных уровнях - микроскопическом и макроскопическом.

Таблица 9. Коэффициенты корреляция шкал гидрофобности аминокислот.

В разделе 4.2 на примере циклодекстринов и ароматических аминокислот рассмотрена гидратация ассоциирующих молекул, образующих обратимые комплексы. При конечных концентрациях, используемых в определениях гидратации с помощью миллиметровой спектроскопии (2-100 г/л), перекрывание гидратных оболочек для ассоциирующих растворенных веществ или даже вытеснение воды из области взаимодействия функциональных групп является существенным фактором, изменяющим гидратационные параметры по сравнению с не ассоциирующими растворенными веществами. Из гидратационных данных (таблица 10) следует, что a-циклодекстрин связывается с Tyr и Phe, поскольку удельное число гидратации n₃' существенно меньше чем n₃. Доля связанного a-циклодекстрина оказывается равной 0.17 для тирозина и 0.19 для фенилаланина. Эти значения согласуются с величинами, вычисленными из типичной величины константы связывания a-циклодекстрина с ароматическими группами аминокислот. Таким образом, при увеличении концентрации растворенных веществ, склонных к ассоциации, измеренное число гидратации уменьшается.

Таблица 10. Удельные числа гидратации лигандов в системе аминокислота + лиганд и доли связанного лиганда.

В разделе 4.3 приведены данные по гидратации белков и изменению гидратации при ферментативном гидролизе. Зависимость N от площади доступной для воды поверхности глобулярных белков можно считать пропорциональной (рис.14). Количество связанной воды, выраженной в г связанной воды на г белка, в среднем для изученных глобулярных белков можно оценить как 0.3. Сопоставление экспериментальных и теоретических значений N для рибонуклеазы и лизоцима, вычисленных по представленным в таблице 8 вкладам в N неполярной группы СН₂ (2.6), усредненной полярной группы (около 0) и заряженной пары (-3.4), приведено в таблице 11. Как можно видеть, имеется неплохое согласие вычисленных и экспериментально полученных значений N.

Таблица 11. Вклад в гидратацию глобулярных белков функциональных групп, расположенных на поверхности белков.

^аВ скобках приведены числа функциональных групп на поверхности белков.

Рис.14. Зависимость чисел гидратации глобулярных белков от площади доступной поверхности (Е²). Бычий сывороточный альбумин (1), яичный альбумин (2), пепсин (3), химотрипсиноген (4), a-химотрипсин (5), трипсин (6), соевый ингибитор трипсина (7), b-лактоглобулин (димер) (8), a-лактальбумин (9), лизоцим (10), рибонуклеаза А (11).

Пример изменения гидратации при протеолизе представлен на рис.15 для гидролиза трех субстратов трипсином. В начале процесса гидролиза как глобулярных белков (b-лактоглобулина и БСА), так и b-казеина происходит заметное увеличение гидратации. При гидролизе трипсином БСА, b-лактоглобулина и b-казеина максимальное увеличение удельной гидратации составляет 36, 17 и 37% соответственно. При протеолизе глобулярных белков после гидролиза хотя бы одной пептидной связи происходит развертывание глобулы, внутренние пептидные связи становятся доступны воде, что и регистрируется при увеличении гидратации. Явление заметного увеличения гидратации при гидролизе b-казеина согласуется с ролью демаскирования при протеолизе b-казеина, которая была определена нами по кинетике образования продуктов гидролиза (раздел 2.1).

Рис.15. Изменение удельных чисел гидратации (число гидратации на единицу массы растворенного вещества) при гидролизе трипсином БСА (^), b-лактоглобулина () и b-казеина (¦).

Как известно, при гидролизе всего одной пептидной связи Phe (105) - Met (106) в k-казеине ренином казеиновая мицелла теряет стабильность, и происходит коагуляция.

Однако, это слишком сложная система для одновременного количественного описания протеолиза и изменения гидратации.

Для моделирования закономерностей гидратации при агрегации казеиновых мицелл мы использовали агрегацию мицелл, индуцированную медленным закислением глюконовой кислотой (раздел 4.4).

Использовались казеиновые мицеллы, восстановленные из обезжиренного молока. Изучали две разновидности мицелл: немодифицированные мицеллы с изоэлектрической точкой около 4.9 и модифицированные мицелы с имобилизованными белками на поверхности.

Они дают значение изоэлектрической точки порядка 5.2. При уменьшении pH ниже значения 4.8-4.9 (изоэлектрическая точка казеиновых фосфопептидов находится в интервале 4.3-4.2) казеиновые мицеллы в таких растворах агрегируют за счет гидрофобных взаимодействий, что приводит к образованию мягких вязкоупругих гелей.

Медленное уменьшение рН вызывалось самопроизвольным гидролизом d-глюконолактона с образованием D-глюконовой кислоты (рК_а =3.56):

белковая частица (1 мкм), казеиновая мицелла (0.05мкм)

На рис.16 представлены зависимости динамического модуля упругости и связанной воды от времени гелеобразования для процессов, протекающих при различных скоростях уменьшения рН (различных концентрациях d-глюконолактона). Чем больше концентрация d-глюконолактона, тем раньше наступает начало гелеобразования. Взаимосвязано с G' ведет себя параметр гидратации, увеличиваясь в ходе гелеобразования.

Рис.16. Зависимости модуля упругости G? (Па) и связанной воды (г Н₂О/г препарата·100%) от времени гелеобразования немодифицированных казеиновых мицелл (16%) для процессов, протекающих при различных скоростях уменьшения рН (различных концентрациях d-глюконолактона). Концентрации d-глюконолактона: 3.4% (_,); 3% (?, ^); 2.7% (Ў, ¦). Температура 43^оС. Частота измерений щ=1 рад с^-1.

С начала гидролиза глюконолактона рН снижается от значения 5.5, поэтому сначала образуются тяжи из модифицированных мицелл. В промежуточной области рН может происходить разрыв геля, образованного модифицированными мицеллами, и замещение его гелем, образованным немодифицированными мицеллами. Поэтому имели место наблюдаемые нами немонотонные зависимости на графиках увеличения модуля накопления при гелеобразовании.

Эффект стабилизации казеиновых мицелл при добавлении смеси полипептидов был продемонстрирован с помощью описанной выше гелеобразующей системы, включающей агрегацию казеиновых мицелл при гидролизе d-глюконолактона. Увеличение стабильности системы определялось по увеличению времени, требуемого до достижения точки гелеобразования при неизменной скорости уменьшения рН (рис.17) или по величинам модуля упругости G и коэффициента вязкости з, полученных при анализе частотных зависимостей динамических модулей G' (?) и G'' (?) в рамках модели Максвелла.

Рис.17. Кинетика гелеобразования при добавлении к казеиновым мицеллам смеси полипептидов. Массовая доля полипептидов: 0 (Ў), 3.6% (_), 7.8% () и 10.4% (^). Концентрация d-глюконолактона 3%, температура 43^оС.

Представленные на рис.18 зависимости показывают, что гидратационные и реологические параметры изменяются согласованно, а их минимумы достигаются в одной и той же концентрационной области. Таким образом, максимум эффекта стабилизации казеиновых мицелл приходится на концентрацию добавленных пептидов порядка 6%.

Рис.18. Зависимости реологических параметров 10^-2·G () и 10^-3·з (¦), а также зависимость количества связанной воды в конце выбранного временного интервала гелеобразования (^) от концентрации добавленных полипептидов (вес полипептидов/вес сухих веществ·100%).

В разделе 4.5 приведены данные по гидратации синтетических полимеров. Величины N, приходящиеся на мономерное звено, представлены на рис. 19 для полиакриламида (ПАМ), полэтиленгликоля (ПЭГ) и термочувствительного поли-N-изопропилакриламида (ПНИПАА):

ПАМ: ПЭГ: ПНИПАА:

Числа гидратации были интерпретированы как величины, зависящие только от числа неполярных групп и их доступности для воды.

Измерения были сделаны при температурах ниже (30^оС) и выше (43^оС) температуры перехода клубок-глобула для макромолекулы ПНИПАА (около 32^оС).

Было найдено, что гидратация ПНИПАА различна в чистой воде и в воде с додецилсульфатом натрия (ДСН, 0.375 г/л), что согласуется с данными о чувствительности перехода клубок-глобула к присутствию в растворе ионных детергентов.

Выше температуры перехода клубок-глобула, величина N для ПНИПАА в присутствии ДСН была выше, чем для ПНИПАА в чистой воде (рис. 19).

Рис. 19. Зависимость числа гидратации от количества атомов углерода в неполярных группах (на звено) для ПЭГ (^), ПАМ (), ПНИПАА в воде (¦ 30^oC, Ў 43^oC), и ПНИПАА с ДСН (30^oC, _ 43^oC). Прямая линия соответствует алифатическим спиртам. Стрелки соответствуют переходу клубок > глобула.

Другим примером применения миллиметровой спектроскопии к анализу конформационного состояния полимеров явилось изучение гидратации гидрофобно-модифицированных полиакриламидов и хитозанов, содержащих гидрофобные кластеры, но не способных образовывать глобулы.

Следующие гидрофобно-модифицированные полимеры были использованы в сравнительном анализе:

1. Гидрофобно-модифицированный хитозан (ГМХ) Babak V.G., Desbrieres J., Tikhonov V.E. // Colloids Surf. A. - 2005. -V.255. - P. 119.

2. Сополимер акриламида и додецилметакрилата (АМ/ДДМК)

[-CH₂-C (CONH₂) H-] _x- [-CH₂-C (CH₃) (COOC₁₂H₂₅] _y; Shashkina Y.A., Zaroslov Y.D., Smirnov V.A., Philipova O.E., Khokhlov A.R., Pryakhina T.A., Churochkina N.A. // Polymer. - 2003. - V.44. - P.2289.

3. Сополимер акриламида и нонилметакрилата (АМ/НМК)

[-CH₂-C (CONH₂) H-] _x- [-CH₂-C (CH₃) (COOC₉H₁₉] _y.

Для различных классов растворенных веществ с различными молекулярными массами и различной степенью доступности их неполярных групп для воды имеет смысл сравнивать удельные величины параметров гидратации n=N'/c_нп, где N'=N/DN (CH₂), DN (CH₂) - вклад в гидратацию метиленовой группы, c_нп - число атомов углерода в неполярных группах.

Изменение n при вариации содержания гидрофобов обнаружено нами в следующих пределах (рис. 20): 0.29-0.21=0.08 (гидрофобно-модифицированные хитозаны), 0.72-0.53=0.19 (сополимеры АМ/НМК), 0.72-0.50=0.22 (сополимеры АМ/ДДМК). Для перехода клубок > глобула для ПНИПАА (стрелка на рис. 20) получаем больший диапазон изменения n (0.73-0.29=0.4). Для процесса экспонирования в водное окружение неполярных групп, содержащихся в БСА, получается еще большее значение n?0.7 (стрелка на рис. 20). Таким образом, методом миллиметровой спектроскопии показано, что гидрофобная модификация полиакриламидов и хитозанов приводит к меньшей вариации параметра удельной гидратации, чем кооперативные переходы связанные с денатурацией белков и переходом клубок-глобула для термочувствительного ПНИПАА.

Рис. 20. Зависимость относительного числа гидратации Nґ от числа атомов углерода в неполярных группах в расчете на одно звено. ПАМ и гидрофобно-модифицированный ПАМ: АМ/НМК - ¦, АМ/ДДМК - Ў; БСА - _; хитозан и гидрофобно-модифицированный хитозан - ; ПНИПАА (клубок) - ^; ПНИПАА (глобула) - ?. Прямая линия соответствует алифатическим спиртам ().

Миллиметровая спектроскопия позволила дифференцировать также различные конформационные состояния сополимеров N-винилкапролактама и N-винилимидазола, полученные при сополимеризации в водной среде при температуре выше точки фазового расслоения полимерной системы.

Таким образом, в четвертой главе описан метод определения параметров гидратации различных соединений с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии по эффекту упорядочения структуры воды в гидратной оболочке растворенной молекулы. При протеолизе зарегистрировано увеличение удельной величины связанной воды, что логично, поскольку происходит разворачивание белковой глобулы и увеличение поверхности контакта функциональных групп с водой. Миллиметровая спектроскопия была применена для анализа слипания казеиновых мицелл и образования гелей при медленном самопроизвольном гидролизе d-глюконолактона, приводящем к снижению рН. Показано, что реологические параметры и гидратационные параметры ведут себя согласованным образом. Показано, что миллиметровая спектроскопия позволяет контролировать конформацию термочувствительных синтетических полимеров и белковоподобных сополимеров. Таким образом, измерение гидратации является перспективным методом, способствующим пониманию физико-химических закономерностей процессов, протекающих с участием гидрофобных эффектов.

В пятой главе описаны детали оригинальных методик, которые были предложены и использованы специально для решения поставленных в диссертационной работе задач. Среди них: методика определения общей кинетики протеолиза по накоплению аминного азота, определяемого фотометрированием N-тринитрофенильных производных продуктов протеолиза; методика приготовления казеиновых гелей при одновременном определении динамических реологических модулей; методика определения параметров гидратации с помощью миллиметровой резонансной установки, работающей в диапазоне частот 26-37 ГГц. В разделе 5.2 в качестве примера приведены две подпрограммы, входящие в пакет программы PROTEOLYSIS.

Основные результаты и выводы