Методичні основи одержання і використання трансгенних тварин

Безперечно, технологія CRISPR / Cas9 найближчим часом стане домінуючою в створенні трансгенних сільськогосподарських тварин. Нечисленність публікацій по отриманню домашніх тварин в даний час пов'язана з тривалістю отримання потомства у сільськогосподарських тварин. Беручи до уваги, що клонування з використанням пересадки ядер соматичних клітин (SCNT) є очевидною процедурою в цілому ряді лабораторій у всьому світі, найближчим часом можна прогнозувати експоненціальне зростання отримання трансгенних сільськогосподарських тварин з використанням технології CRISPR / Cas9.

4. Трансгенні тварини із заданими ознаками

Одним з основних напрямків генної інженерії на першому етапі була зміна спадковості тварин відносно збільшення швидкості росту, підвищення надоїв і поліпшення якості продукції. Ріст тварини є складним процесом, який залежить від дії генів, умов годівлі і факторів навколишнього середовища. З генетичної точки зору найбільш цікаві гени, що кодують протеїни каскаду гормону росту, а саме, безпосередньо гормон росту (ГР), рілізінг, фактори гормону росту (РФ ГР) і інсуліноподібний фактор гормону росту (ІФ ГР). Перших трансгенних мишей з геном ГР виведено у 1982 р. У них була встановлена підвищена швидкість росту (в чотири рази) і подвоєна жива маса. Що стосується сільськогосподарських тварин, то у трансгенних свиней і овець не спостерігалося відповідного прискорення росту або підвищення його не перебільшувало 15…16% порівняно з контролем. Деякі дослідники пояснюють це тим, що піддослідні тварини походять з популяцій, в яких протягом десятиліть проводилася селекція за цим показником. Генетичний потенціал росту цих тварин, очевидно, є недалеко від потенційного плато і тому додатковим уведенням гену гормону росту можна досягти лише незначного ефекту у швидкості росту.

Поряд із цим, відмічено збільшення вмісту білка і зменшення вмісту жиру в тканинах трансгенних тварин з генами гормону росту, що значно підвищує якість і товарну цінність отриманих м'ясопродуктів. Так, товщина шпику в трансгенних свиней - 7…8 мм проти контрольних 18…20 мм. Аналогічно трансгенні вівці мають жиру 5…7% порівняно з 25…30% контрольної групи.

У наш час основними напрямками створення трансгенних тварин є:

- тварини стійкі до захворювань;

- тварини з поліпшеним складом м'яса і молока;

- тварини, які про дукують біологічно активні речовини медичного і технологічного призначення;

- тварини призначені для ксенотрансплантації.

Трансгенні тварини стійкі до захворювань. Резистентність - це спадкова генетично обумовлена сприйнятливість тварин до певних мікроорганізмів, вірусів, шкідників або токсинів. Тому можливо отримати трансгенних тварин з чужорідними генами, що забезпечують несприйняття цих тварин певних захворювань. Вторгненню і розмноженню збудників запобігають, головним чином, імунні механізми і експресія генів, що відповідають за синтез таких речовин, як інтерферони, нейропептиди, гормони й інтерлейкіни.

Досліджується можливість отримання трансгенних тварин, які здатні збільшити вміст лактоферину в тканинах молочної залози з метою підвищення резистентності до маститу.

Значний інтерес викликають дослідження щодо отримання трансгенних тварин з генами антисенсової РНК (асРНК). Експресія її у клітинах спричиняє наступну гібридизацію із смислової РНК вірусу і, відповідно, інгібірування реплікації вірусного геному. Створені трансгенні кролі, кури, велика рогата худоба з геном асРНК проти вірусу лейкозу, стійкі до зараження лейкозом.

Трансгенні тварини з поліпшеним складом молока. Окремою метою трансгенезу великої рогатої худоби є зміна вмісту в молоці різних його компонентів. Її можна досягнути як кількісно, за рахунок зміни співвідношення компонентів молока, так і якісно, шляхом додавання інших компонентів, що відсутні у складі природного молока, але вони посилюють його поживну цінність. У молоці містяться чотири основні компоненти: жир, білок, лактоза і транспортний компонент.

З економічної точки зору існує інтерес збільшити вміст казеїну в молоці, що поліпшує процеси виробництва сиру. Вважать, що молочна залоза обмежена у здатності синтезувати білок. Будь-яке додаткове створення білка компенсується зменшенням кількості інших білків молока. Враховуючи це, є другий можливий шлях збільшення рівня казеїну, а саме, гальмування виробництва білків, що менш корисні. Для цього підходить в-лактоглобулін, який існує лише в молоці жуйних і є основним алергеном молока корови.

Зменшення його кількості поліпшує склад молока. Для вирішення цієї проблеми використовували асРНК. Зменшення кількості лактози в молоці також було б корисним і не лише для людей, які не здатні розщеплювати її через недостатній синтез ферменту лактази, а й для молочної промисловості, оскільки збільшило б ефективність виробництва сиру. Проблема була вирішена за рахунок створення трансгенних корів, у молочній залозі яких відбувалась експресія лактази, що гідролізувала лактозу безпосередньо в тканинах вимені. Отримані трансгенні вівці з геном хімозину, які продукують з молоком у середньому 200…300 мг ферменту хімозину на 1 л молока. Це джерело отримання хімозину - основного компонента для виробництва сиру - може замінити традиційний спосіб отримання його з сичугу молочних телят і ягнят, але його вартість буде в 5…10 разів меншою.

Молоко, поряд зі своєю цінністю як продукту, може використовуватися і як транспортний засіб для інших речовин, що збільшують не лише його поживні, а також і функціональні властивості. Наприклад, лактоферин, кислий білок молока людини з бактеріостатичними властивостями, що посилює адсорбцію заліза. Він міститься в молоці корів у незначній кількості і з його збільшенням можна досягнути декілька цілей. Оскільки він поліпшує адсорбцію заліза, то за його рахунок можна захистити збереженість нащадків, крім того, він контролює розмноження бактерій.

Синтез молочною залозою лізоциму не тільки забезпечує антибактеріальний вплив, а й зменшує ймовірність захворювання на мастит, викликає специфічний пасивний імунітет у новонароджених. Крім того, він також сприяє збільшенню виходу сиру, оскільки пов'язаний з казеїнами.

Таким чином, внаслідок секреції білків людини в молоко корів можливо зробити його більш адекватним для використання людиною. Включення лактоферину, лізоциму і імуноглобулінів людини мають додаткову терапевтичну користь.

Трансгенні тварини, які продукують біологічно активні речовини медичного і технологічного призначення. Трансгенні тварини - біореактори. Біореакторами називають організми, що продукують лікарські білки. Біореакторами можуть бути будь-які живі організми - бактерії, гриби, рослини, тварини і, навіть, клітинні культури. У кожного з таких організмів-біореакторів є переваги й недоліки. Бактерії, наприклад, легко модифікуються методами генної інженерії, швидко розмножуються і їх зручно використовувати в промислових біотехнологічних установках. Таким методом роблять генно-інженерний інсулін людини - у цей час найбільш якісний з тих, що одержують промисловим способом інсулінів. Однак, для нормального функціонування білків людини дуже важливі ті зміни, які відбуваються на післятрансляційному рівні: глікозилювання, ацетилювання, фосфорилювання, карбоксилювання й деякі інші перетворення.

Більша частина біохімічних механізмів, що забезпечують ці процеси, відсутня у прокаріот, і білки, синтезовані ними з матриць генів людини, не повністю ідентичні білкам із клітин людського організму. Інша складність пов'язана з виділенням і очищенням лікарського білка - бактеріальні клітини йдуть у переробку цілком, і тому важко позбутися всіх сторонніх домішок у кінцевому продукті. Трансгенні дріжджові культури й культури клітин людини не мають цих недоліків, але продуктивність таких систем у цей час нижча за ту, що вже отримана в експериментальних трансгенних тварин.

Незважаючи на активний розвиток біотехнології в останні десятиліття, основним джерелом багатьох необхідних фармакології лікарських білків людини є донорська кров. Це фактори зсідання крові - фібриноген, антитромбіни, альбумін, імуноглобуліни й інші білки, без використання яких важко уявити собі сучасну медицину. Достатня кількість якісних і дешевих лікарських білків людини могло б урятувати багатьох пацієнтів. Гетерогенні білки можуть бути отримані більшістю тканин тіла тварини. Шляхом поєднання структурних генів із специфічними регуляторними елементами можливо досягнути експресії трансгена у певних органах.

Найбільший прогрес у виробництві трансгенних продуктів був досягнутий у цілеспрямованої трансгенної експресії в епітеліальні клітини молочної залози і синтезі білків поряд з молоком. Структурний ген, що пов'язаний з промотором гена молочного протеїну, в першу чергу, буде здійснювати експресію у клітинах молочної залози. Використання молока доцільне тому, що воно утворюється в організмі тварини у великій кількості, його можна надоювати за необхідністю без шкоди для тварини. Запропоновано новий термін біофармінг, який належить до процесу отримання з молока білків людини або фармацевтичних препаратів.

Одним з основних етапів у отриманні трансгенних тварин, які продукують гетерогенний білок з молоком, є ідентифікація промотору, що буде спрямовувати експресію у секреторний епітелій молочної залози. В наш час виділені промотори аS1-казеїну, в-казеїну, б-лактоальбуміну, в-лактоглобуліну і сироваткового кислого протеїну (WАP). Стратегія цих робіт така: отримати трансгенну тварину, в якої чужий ген експресується в клітинах молочної залози й продукт роботи цього гена виділяється в молоко. Тоді одержання лікарського білка зведеться до процесу, що відомій людині вже багато тисяч років, - до доїння. Апаратами механічного доїння, звичайно, користуються, але є апарати, що дають можливість подоїти козу, вівцю, свиню, кролика й навіть мишу. Трансгенні тварини дозволять вирішити й ще одну проблему - проблему очищення лікарських білків. Навіть якщо після очищення в препараті залишаться домішки, це будуть нетоксичні для людини білки молока.

Сьогодні більша частина тварин, що виділяє трансгенні продукти в молоко, - це миші. Миші з їхнім коротким терміном вагітності й росту - зручний об'єкт для аналізу експресії введеної генної конструкції, на них відпрацьовують ті методики, які потім використовують для одержання великих трансгенних тварин.

Список трансгенних ссавців, що виділяють продукт активності чужорідного білка в молоко, є такий: кролі - інтерлейкін-2 (нг/мол) і тканинний активатор плазміногену (мкг/мол), вівці - 1-антитрипсин (мг/мол) для лікування емфіземи легень і фактор зсідання крові IX (нг/мол) проти гемофілії, кози - тканинний активатор плазміногену (мкг/мол). У цей час активно ведуться роботи з одержання тварин-продуцентів рекомбінантних імуноглобулінів людини - вони з'являться в найближчі роки, і галузь їхнього застосування майже безмежна.

Яку ж кількість трансгенних тварин необхідно отримати, щоб забезпечити потребу в лікарських білках людини? Коли намагаються співвіднести можливу продукцію білка людини й потребу в ньому, то результати аналізу дивують. Так, для того, щоб забезпечити всю світову потребу у факторі зсіданні крові IX, потрібно отримувати за рік до 85 кг цього білка, а для фактору зсідання крові VIII ця кількість і того менша - до 7 кг. При рівні продукції трансгена в 1 мг на 1 мл молока (а сьогодні це цілком реальний рівень) корова, що виробляє до 6 тис. л молока за рік, може зробити до 6 кг лікарського білка. Всю потребу в факторі VIII зможе забезпечити одна або дві корови-біореактори, а для одержання фактора IX у кількості, достатній для всіх хворих на гемофілію у світі, необхідно всього лише маленьке стадо з 15…20 трансгенних корів. Потреба медицини в інших білках, одержуваних із крові людини, більша. Так, для фібриногену це до 3 т. Таку кількість зможе забезпечити стадо в 500 трансгенних корів - одна тваринницька ферма.

Серед рекомбінантних білків, отриманих з молока трансгенних тварин, відомі такі: білок С людини, що запобігає утворенню тромбів; VІІІ і ІХ фактори зсідання крові проти гемофілії; тканинний плазмінно-генний активатор, що використовується для лікування венозних тромбів і емболії легеневої артерії; лактоферин; інтерлейкін-2; альфа-1-антитрипсин для лікування емфіземи легень; моноклональні антитіла для лікування різних форм раку. А ще одне джерело повноцінних білків, частину з яких можна замінити лікувальними, - це яйця. Донедавна головним недоліком пернатих біореакторів була занадто мала концентрація потрібних білків - промислове виробництво при цьому було б нерентабельним.

Восени 2005 року одночасно дві фірми перебороли цей бар'єр. Каліфорнійська Origen Therapeutics отримала моноклональні антитіла до раку передміхурової залози в кількості 1…3 мг на яйце. До того ж протиракова активність цих антитіл виявилася в 10…100 разів більшою за антитіла, які отримано звичайним методом, за допомогою химерних клітин. А британська фірма Oxford Biomedica у співробітництві з американською компанією Viragen і Рослинським інститутом отримали в білку трансгенних яєць антитіла проти одного з видів раку шкіри - меланоми. Для селекції курей потрібно менше часу, ніж для кіз і тим більше корів. Собівартість виробництва лікувальних курячих білків буде невисокою: головне - створити трансгенну породу, а далі, із цілою біофабрикою буде не більше турбот, ніж зі звичайною птахофермою. Це дозволяє сподіватися, що пернаті біореактори зможуть змагатися не тільки з ссавцями, а й із традиційними методами одержання вакцин, антитіл та інших білків для потреб медицини.

Трансгенні тварини, що служать джерелом їжі, ще далекі від комерційного використання, хоча дуже багато різних варіантів вже створено. Наприклад, в геном свиней вдалося вбудувати кілька генів, що прискорюють зростання, які також впливають на якість м'яса, роблячи його більш пісним і ніжним. Ця робота розпочата більше 10 років тому, проте в силу певних негативних морфологічних і фізіологічних змін, що спостерігалися у тварин, цей варіант не був комерціалізований. Швидше за все, негативні зміни в даних трансгенних свинях були обумовлені недосконалістю використаної генетичної конструкції, так що роботи в цьому напрямку тривають.

Запропоновано також велику кількість модифікацій молока великої рогатої худоби, що полягають в додаванні нових білків або в маніпуляціях над ендогенними протеїнами. Наприклад, були створені тварини, що продукують молоко для дитячого харчування, за своїм складом максимально наближене до материнського молока людини. Інший приклад - нещодавно вчені з Нової Зеландії отримали корів з підвищеним вмістом в молоці казеїну. Використання такого молока має підвищити продуктивність сироварного виробництва. Ще кілька груп дослідників працюють над зниженням вмісту в молоці лактози. Кінцевою метою є створення молока, придатного для вживання в їжу людьми з лактозною непереносимістю.

Поки ближче всіх на шляху до комерціалізації знаходяться фітазні трансгенні свині (екосвині), метою створення яких було різке зменшення гнойового забруднення навколишнього середовища. Ця лінія несе ген бактеріальної фітази під транскрипційним контролем тканеспецифічного промотору слинних залоз. Секретована рекомбінантна фітаза дозволяє свиням розщеплювати рослинні фітати (інозитол гексафосфат, ІГФ - найбільш поширена нерозчинна форма органічного фосфору ґрунту), що зменшує вихід забруднюючих навколишнє середовище фекальних токсичних сполук фосфору (до 75%). Очікується вихід цих свиней на ринок в наступні кілька років. Це також стосується багатьох важливих біомедичних продуктів, таких як фактори згортання крові та антитіла, які в даний час не мають іншої альтернативи, ніж продукти в тваринних клітинах. Підтвердженням необхідності трансгенних організмів є бурхливе зростання біотехнологічних ринків в останні роки. У майбутньому очікується велика кількість протипухлинних препаратів у поєднанні зі значною незадоволеною потребою в них. Таким чином, створення трансгенних тварин може вирішити багато проблем сучасного суспільства

Ксенотрансплантація. Трансгенні тварини можуть стати донорами органів і тканин для пересаджування людині. Основна проблема міжвидової трансплантації - це гіпергостре відторгнення. Воно пояснюється тим, що антитіла організму господаря зв'язуються з антигенними детермінантами на поверхні клітин пересадженого органу, виникає гостра запалювальна реакція (активація каскаду комплементу) і швидка втрата трансплантованого органу.

В даний час ряд дослідницьких центрів працюють над виведенням генетично модифікованих свиней, органи яких можуть бути використані для трансплантації. Необхідними умовами для успішної ксенотрансплантації є:

1) подолання імунологічних бар'єрів (гістосумісність),

2) недопущення перенесення патогенів від донорної тварини людині,

3) анатомічна і фізіологічна сумісність донорного органу з людським.

У природних умовах реакція запалювання блокується особливими білками (супресорами). Було зроблено припущення, що коли тварина-донор має один або декілька білків людини - інгібіторів запалювального процесу, то орган, який пересаджено, буде захищений від первинної запалювальної реакції.

Із цією метою вивели трансгенних свиней, які несуть різні людські гени інгібітору комплементу. Клітини однієї із цих тварин виявилися зовсім нечутливими до компонентів системи каскаду комплементу. Попередні експерименти з пересадження органів трансгенних свиней приматам показали, що тканини пересадженого органу ушкоджуються рідше, а сам орган не відторгається трохи довше. Можливо, трансгенні свині, що несуть людський ген інгібітору комплементу й позбавлені основного поверхневого білка клітин свиней, що викликає найгостріше відторгнення, можуть стати джерелом органів для трансплантації людині.

Вважають, що на першому етапі ця технологія буде використана для заміни інсулінотерапії у хворих на діабет пересадкою людині тканин острівців Лангенгарса, що синтезують інсулін.

Створення тварин - генетичних моделей спадкоємних захворювань людини. Багато хворіб мають спадкоємні причини. І це стосується не тільки моногенних захворювань, що відбуваються через мутацію в якомусь одному певному гені. Часто причиною захворювання є цілий комплекс порушень геному: присутність алелей, що визначають схильність до захворювання, гіперфункція якихось генів через наявність додаткових копій цього гена або порушень у його регуляції й багато інших, але з генетично визначеними причинами. До цієї групи належить більша частина захворювань серцево-судинної й нервової систем, багато ендокринних захворювань. Часто важко встановити конкретну причину захворювання, співвіднести виявлені у пацієнта генетичні дефекти з його анамнезом. В останні 10 років для вирішення цих питань усе частіше залучаються трансгенні моделі спадкоємних захворювань людини.

Після того як виявлено ген, можливо відповідальний за дане захворювання, можуть бути створені два типи модельних тварин: миші з функціонуючим трансгеном і миші із втратою функції даного гена. Перший тип - це класичні трансгенні миші, у геном яких уведено ген людини, відповідальний за конкретне захворювання. Якщо схильність до захворювання залежить від наявності в геномі одного з алелей, то для перевірки цієї гіпотези створюються лінії трансгенних мишей, що несуть різні алелі даного гена.

На цих моделях можна досліджувати вплив кількості копій гена й рівня його експресії на прояв захворювання, а також розробляти нові методи лікування. Другий тип модельних тварин - це миші, у яких відсутній ген, аналогічний тому, що викликає дане захворювання у людини. На цій моделі досліджують конкретні функції генів, що особливо важливо для аналізу причин мультигенних захворювань.

Трансгенні тварини і флуоресценція. Існує можливість проводити дослідження із використанням флуоресценції на живих клітинах і навіть цілих організмах. Видиме флуоресцентне світло не поглинається біологічними макромолекулами, водою та іншими компонентами живих клітин та не впливає на процеси, що відбуваються в клітині.

За останні роки були розроблені численні біосумісні флуорофори та флуоресцентні зонди. Серед них особливо виділяються флуоресцентні білки.

Завдяки генній інженерії флуоресцентні білкові маркери різних кольорів можуть бути приєднані до протеїнів у різних лабораторних організмах (fusion proteins). На фотографії ліворуч зображені миші, у геном яких був вбудований ген eGFP - підсиленого зеленого флуоресцентного білку.

При візуалізації флуоресценції в живих тканинах певну проблему складає поглинання світла з короткими довжинами хвиль. У зв'язку з цим широку популярність як лабораторний організм здобула Danio rerio -- маленька акваріумна рибка, яка є повністю прозорою для видимого світла на перших етапах розвитку. Це робить її зручним модельним організмом для досліджень із використанням флуоресцентних міток та зондів.

Розробка методів генної терапії на основі вивчення трансгенних тварин. До будь-якого втручання в геном людини необхідно підходити з набагато більшою обережністю, ніж до втручання в геном інших видів тварин і рослин, але бувають ситуації, коли саме такі методи можуть урятувати хворого. Одна з таких ситуацій - ракове захворювання. Надії на лікування хворих від СНІДу також пов'язують із генною терапією. При цьому використовується соматична трансфекція - метод, коли генетичні конструкції вводяться в певні клітини й тканини організму пацієнта. За даними Американської асоціації охорони здоров'я за 2006 рік тільки в США до клінічних випробувань було допущено близько 300 генотерапевтичних розробок. Як і всі інші методи лікування, генотерапевтичні методи розробляються й проходять випробування на модельних трансгенних тваринах.

5. Види трансгенних тварин

Трансгенні корови. Якщо передбачається використовувати молочну залозу як біореактор, то придатною твариною для трансгенозу є велика рогата худоба, яка щорічно дає до 10 000 л молока, в якому міститься до 35 г білка на 1 л. Якщо в молоці буде міститися така кількість рекомбінантного білка й ефективність його очищення становитиме 50%, то від 20 трансгенних корів можна буде отримувати приблизно 100 кг такого білка за рік. За випадковим збігом, саме стільки білка С, що використовується для запобігання тромбоутворення, потрібно щорічно. З іншого боку, однієї трансгенної корови буде цілком достатньо для одержання необхідної щорічно кількості фактора IX (фактора Кристмаса) каскадного механізму згортання крові, що вводять хворим на гемофілію для підвищення її зсідання. Для створення трансгенних корів використовують модифіковану схему трансгенозу мишей методом мікроін'єкцій ДНК.

Процедура включає такі основні етапи:

1) збирання ооцитів корів, забитих на скотобійні;

2) дозрівання ооцитів in vitro;

3) запліднення спермою бугаїв in vitro;

4) центрифугування яйцеклітин, що запліднені, для концентрування жовтка, який в нормальних яйцеклітинах запобігає баченню чоловічого пронуклеусу за допомогою мікроскопу;

5) мікроін'єкція ДНК в чоловічий пронуклеус;

6) розвиток ембріона in vitro;

7) нехірургічна імплантація одного ембріона самки-реципієнту під час тічки;

8) скринінг ДНК нащадків на наявність трансгена.

У тестових експериментах із пула в 2470 ооцитів було отримано два трансгенних теляти. Дослідження в цій галузі тривають, і є надія на вдосконалення методики трансгенозу. Один зі способів полягає в тому, що відбирають незначну кількість клітин з ембріона, що розвивається in vitro, і тестують їх на наявність трансгена; така втрата клітин ембріоном не перешкодить його нормальному розвитку. Цей тест дозволить імплантувати лише ембріони, що несуть трансген.

Трансгенні вівці, кози й свині. Досліди із трансгенозу на вівцях і козах, в основному, спрямовані на перетворення молочних залоз цих тварин у своєрідні біореактори для одержання білкових продуктів, що використовуються в медицині. Незважаючи на те, що надої овець і кіз менші ніж у корів, за рік вони дають сотні літрів молока. За допомогою методу, аналогічного використаному для створення трансгенних мишей у трансгенних конструкцій, що містять гени людини під контролем промоторів, специфічних для молочних залоз, було створено трансгенну вівцю і козу, в молоко яких секретирували білки людини. Вони були глікозиліровані й мали активність, близьку до тих відповідних білків, що одержані від людини. Експресія трансгенів у клітинах молочних залоз овець і кіз не виявляла ніяких побічних дій ні на самок у період лактації, ні на нащадків, що вигодовуються. На відміну від цього, за введення свиням трансгена гормону росту бугаїв під контролем промотору металотіонеїну спостерігалися несприятливі ефекти. Кількість гормону в різних особин у групі трансгенних свиней розрізнялася, однак у цілому вся ця група швидше збільшувала вагу. На жаль, цей позитивний результат частково знецінювався різними паталогіями: у тварин виявляли виразку шлунку, ниркову недостатність, кульгавість, запалення перикарду, зменшення рухливості суглобів, схильність до пневмонії. Причини цих симптомів невідомі. Можливо, вони пов'язані з довгостроковою присутністю в організмі надлишку гормону росту. У цих експериментах трансген синтезувався більшменш безперервно.

Було створено також трансгенну вівцю з підвищеною швидкістю росту вовни. Для цього кДНК овечого інсуліноподібного фактора росту було поміщено під контроль мишачий промотор гена кератину з високим вмістом сірки, що забезпечувало гіперекспресію кДНК. При цьому в трансгенних овець, на відміну від свиней, ніяких небажаних побічних ефектів не спостерігалося.

Позитивні результати отримали й за експериментів із трансгенними свинями. Наприклад, були створені здорові трансгенні свині, у геномі яких присутня така генетична конструкція: регуляторна ділянка гена в-глобіну людини, два гени б1-глобіну людини й один ген ЯА-глобіну людини. У результаті її експресії в клітинах крові свиней синтезувався людський гемоглобін, при цьому, при заміні людського промотору гена в-глобіну свинячим, людський гемоглобін синтезувався в значно більшій кількості. Людський гемоглобін, що продукується трансгенними свинями, мав такі ж хімічні властивості, як і природний людський. Його можна було очистити від гемоглобіну свиней звичайною хроматографією. Ці результати вказують на принципову можливість заміни цільної крові, що використовується за трансфузії, людським гемоглобіном, отриманим методом трансгенезу.

Однак, ізольований гемоглобін переносить кисень не так ефективно, як гемоглобін у складі еритроцитів. Більше того, він швидко руйнується в організмі тварини, куди був уведений, а продукти його розпаду токсичні для нирок. Таким чином, одержання замінника людської крові за допомогою трансгенезу - це справа майбутнього.

Трансгенна птиця. При створенні трансгенної птиці виникають певні проблеми, що пов'язані з особливостями відтворення і розвитку птиці. Так, за запліднення птиці в яйцеклітину можуть проникнути одразу декілька сперматозоїдів, а не однин, як це звичайно буває у ссавців, і визначити певний чоловічий пронуклеус, що з'єднується з жіночим, стає неможливим. Тобто, метод мікроін'єкції для створення трансгенної птиці непридатний. А якщо і вдасться здійснити мікроін'єкцію ДНК в ядро, наступні операції буде важко зробити, оскільки у птиці яйцеклітина після запліднення досить швидко вкривається міцною мембраною, шаром альбуміну і внутрішньою та зовнішньою вапняними оболонками. Використання ретровірусів як вектори неефективне через причини, указані раніше. Ніяких специфічних ES-клітин для птиці також не знайдено.

Більш перспективним є метод з використання рекомбінантних ембріональних клітин. Він полягає у тому, що відокремлюють клітини бластодерми з курячого ембріону, за допомогою катіонних ліпідів, що зв'язані з трансгенною ДНК, проводять трансфекцію, і знову вводять їх до підзародкової зони свіжовідкладених яєць. Частина нащадків буде нести у незначній кількості клітини донору. Таких тварин називають химерами. У деяких химер клітини, що створилися з трансформованих клітин, можуть становити лінії зародкових клітин, і після декількох раундів схрещування можна отримати лінії трансгенних тварин. Для збільшення ймовірності створення химер, що мають чужорідні гени в клітинах зародкової лінії, кількість донорських клітин у химерах можна підвищити за рахунок випромінювання ембріонів реципієнту перед введенням у них трансгена (540…660 рад протягом 1 години). Під впливом випромінювання деякі (але не всі) клітини бластодерми гинуть, і співвідношення між трансформованими клітинами і клітинами реципієнта збільшується на користь перших.

Трансгенних курчат можна використовувати для поліпшення генотипу вже існуючих порід - для надання їм (in vivo) стійкості до захворювань, кращої ефективності засвоєння кормів, зниження рівня жиру і холестеролу в яйцях, підвищення якості м'яса. Було також запропоновано використовувати яйце, з його високим вмістом білка, в якості джерела білкових продуктів для фармацевтичної промисловості.

Трансгенні риби. У міру вичерпання природних рибних запасів усе більшого значення набуватиме розведення риби в штучних умовах. Основна мета досліджень у цій галузі - створення рекомбінантних риб шляхом трансгенозу. До цього часу трансгени вводять мікроін'єкцією ДНК або електропортацією запліднених яйцеклітин різних видів риб - форелі, лосося, коропа та ін. Трансгенну ДНК вводять в цитоплазму запліднених яйцеклітин або клітин ембріонів, що досягли стадії чотирьох бластомерів. Ембріогенез відбувається у риб у водному середовищі поза організмом, тому немає необхідності здійснювати імплантацію. Всі наступні процеси можуть відбуватися в резервуарах з температурою, що регулюється. Після мікроін'єкцій життєздатними залишаються від 35 до 80% ембріонів, а доля трансгенних нащадків коливається від 10 до 70%.

Більшість перших досліджень в цій галузі було спрямовано на визначення впливу трансгена гормону росту на швидкість росту. Як правило, трансгенні лососі були більш крупні і швидше набували вагу ніж контрольні особі. Для експресії було обрано систему з прискореною транскрипцією гена гормону росту в холодній воді, що була придатна для всіх риб, тобто використовувався ген гормону росту риб для запобігання біологічної несумісності. Однорічні трансгенні особі, що були отримані в результаті введення в яйцеклітини генетичної конструкції гормону росту, придатної для всіх риб, важили, приблизно, в 11 разів більше за нетрансгенних. Передбачається, що у наступному гени стійкості до хвороб і стресових впливів, а також гени, що обумовлюють інші біологічні особливості, будуть уведені як рибам помірних зон, так і тропічним рибам.

На жаль, інтеграція трансгена, як правило, має випадковий характер:

- у деяких випадках чужорідна ДНК стимулює виникнення мутацій;

- не завжди трансгенна тварина характеризується експресією трансгена. Наприклад, експерименти щодо введення гена гормону росту людини сільськогосподарським тваринам дозволили отримати трансгенних кролів і свиней, однак ріст їх не відрізнявся від росту контрольних тварин;

- експресія трансгена в організмі трансгенної тварини окрім позитивного ефекту, що очікується, може викликати і негативну реакцію. Збільшення рівня гормона росту в крові трансгенних овець у деяких випадках приводило до виникнення діабету і загибелі тварин;

- внесення трансгена в ембріон може викликати народження мозаїків. Мозаїками вважаються тварини, які мають дві або декілька клітинних ліній, що походять з одної зиготи, але мають різні генотипи. Трансгенні мозаїки, крім клітинних ліній, що містять трансген, мають нетрансгенні лінії. За отриманні від таких тварин нащадків можуть виникнути певні труднощі. Так, якщо клітини гонад не містять трансген, нащадки не можуть успадковувати ін'єктований ген від трансгенних батьків.

Дані, які маємо, свідчать, що близько 30% первинних трансгенів, отриманих за рахунок методу мікроін'єкцій, є мозаїками. Частина мозаїків зовсім не здатна створити трансгенну лінію, оскільки в них відсутня спадкова передача трансгену.

6. Морально-етичні проблеми, що постають на шляху трансгенним дослідженням

Розвиток клонування і трансгенезу тварин був раптовий, і більшість людей не може наразі адекватно оцінити переваги та недоліки цих методів. Не дивно, що ці методи стали предметом бурхливих дискусій. Для застосування трансгенезу існують не лише практичні, а й теоретичні обмеження. Додавання чужорідних їм або інактивація генів може мати руйнівні наслідки і навіть викликати смерть тварин. З іншого боку, часто нокаут генів не має ніяких очевидних фенотипових наслідків.

Водночас трансгенні тварини неодмінно досягнуть людей-споживачів, як це вже сталося із трансгенними рослинами та мікроорганізмами. Чужорідні гени, уведені в їх геноми, можуть вплинути на поживні властивості або безпечність для споживання відповідних продуктів. Для запобігання цьому можуть застосовуватися як звичні тести на токсичність та алергенність продуктів, так і порівняння між собою трансгенних і нетрансгенних організмів за загальним складом, а також за експресією генів та білків (з використанням ДНК-чіпів). Особливою проблемою біологічної безпеки є можливість виникнення у трансгенному організмів сприятливих умов для розвитку патогенів, що може бути виявлено не одразу, а лише при появі епідемічної ситуації.

Щодо трансгенезу постають також питання суто етичного плану. Деякі люди вважають такі методи насильством над законами природи, інші встають на захист прав піддослідних тварин. Щодо перших, то слід усвідомити, що більшість із нині існуючих порід свійських тварин створена з використанням селекції, яка теж є одним із способів генетичної модифікації. У другому випадку треба визнати, що одержання ембріонів для мікроін'єкцій та їхнє перенесення до самиць-реципієнток потребує хірургічного втручання або смерті самих тварин.

Для мінімізації таких проблем Європейський центр перевірки альтернативних методів (ECVAM) вимагає дотримання таких правил: зменшення кількості лабораторних тварин, удосконалення лабораторних методик і заміни використання тварин, де це можливо, дослідами in vitro на культурах клітин. Рекомендовано також уникати одержання трансгенних тварин, які не можуть дати жодної корисної інформації дослідникам, а також максимально розповсюджувати дані навіть про неґативні результати, щоб уникнути повторного проведення дослідів різними групами. Комітети із справ етики на місцевому, національному або загальноєвропейському рівні закликаються до дослідження етичних аспектів методів, що використовують трансгенних тварин. Ця практика також поступово запроваджується у промисловості та науці.

Висновки

Підсумовуючим сказане, можна зауважити, що сучасний проґрес у трансгенезі дає можливість зробити лише деякі передбачення щодо його майбутнього, позаяк ця галузь розвивається надто швидко для загальних прогнозів. Можна сказати, що в майбутньому в кількох тваринних модулях трансгенез буде використаний більш систематично, зокрема очікується нокаутування більшості генів у миші з подальшим широкомасштабним дослідженням наслідків. Трансгенні тварини стануть необхідним інструментом для дизайну та відкриття лікарських препаратів на основі геноміки. Продукція рекомбінантних фармацевтичних білків у молоці трансгенних тварин не повинна зустріти ніяких суттєвих перешкод. Особливо багатообіцяючими серед білків, отриманих із трансгенних тварин, виглядають моноклональні антитіла, здатні замінити антибіотики в боротьбі з інфекціями. Застосування трансгенезу у тваринництві перебуває на первинних стадіях і потребує подальшого розвитку.

Питання можливості трансгенезу в людини за наявного стану справ у найближчому майбутньому залишається без шансів на втілення. Важливою проблемою залишається ворожість громадськості до біотехнології загалом, спричинена, принаймні частково, відсутністю проінформованості в питаннях, що стосуються цієї галузі.

Список використаних джерел

1. Біотехнології отримання і застосування трансгенних тварин: метод. вказівки до виконання практ. роботи для студентів денної форми навчання першого та другого рівнів вищої освіти (бакалавр, магістр), спеціальності 204 Технології виробництва і переробки продукції тваринництва; Харків. нац. техн. у-т сіл. госп-ва ім. П. Василенка; уклад.: В.О. Шигимага. - Харків: [б. в.], 2020.- 33 с.

3. Юлевич О. І. Біотехнологія: навчальний посібник / О.І. Юлевич, С.І. Ковтун, М.І. Гиль ; за ред. М.І. Гиль. -- Миколаїв: МДАУ, 2012. - 476 с.

4. Пономарьов П.Х. Генетично модифіковані організми: трансгенні культури, ферментні препарати, харчові продукти: монографія / П.Х. Пономарьов, Н.В. Притульська, І.В. Донцова. - Київ : Київ. нац. торг.-екон. ун-т, 2014, - 208 с.

Размещено на allbest.ru