Разработка mini-Mu системы для эффективной интеграции и амплификации генетического материала в хромосому бактерии E. coli в отсутствие селективного маркера

При конструировании штамма-продуцента валина в качестве реципиента был использован штамм V-01. Данный штамм был получен на основе штамма дикого типа E. coli MG1655 путем последовательного внесения мутаций ilvG5 и ileS17 посредством Р1-трансдукции.

Штамм-продуцент валина V-4 был получен на основе штамма V-01 путем интеграции генов валиного оперона, находящихся под регуляцией P_R-промотора фага л, из состава плазмиды pMP_R-ilvG*MED-2T_fd в бактериальную хромосому штамма V-01 и последующими несколькими этапами амплификации данного оперона при помощи транспозазной плазмиды pMH10.

На первом этапе конструирования была осуществлена интеграция mini-Mu вектора pMP_R-ilvG*MED-2T_fd в хромосому реципиентного штамма V-01. Среди полученной группы штаммов был отобран лучший V-2 на основании результатов ферментации в пробирках (рис. 6). Было проведено определение числа копий mini-Mu кассет в хромосоме данного штамма методом ДНК-гибридизации по Саузерну. Результаты гибридизации показали, что в хромосоме штамма V-2, полученного после первого этапа интеграции, содержалось 4 копии валинового оперона (рис.7). Количество интегрированных копий mini-Mu определяли по числу полос на радиоавтогафе и их интенсивности.

Далее при использовании транспозазной плазмиды рМН10 было проведено два последовательных этапа амплификации mini-Mu кассет pMP_R-ilvG*MED-2T_fd в хромосоме данного штамма V-2. На основании данных по продуктивности полученных штаммов в условиях пробирочной ферментации были отобраны штаммы V-3 и V-4, обладающие повышенным уровнем синтеза валина (рис. 6). В полученных штаммах было проведено определение числа копий валинового оперона методом ДНК-гибридизации по Саузерну. Как показали полученные результаты, в хромосоме штамма V-3 содержалось 7 копий валинового оперона, а в хромосоме штамма V-4 - 10 копий валинового оперона (рис. 7).

Рисунок 6 Относительное поэтапное увеличение продуктивности штаммов-продуцентов валина V-01,V-2,V-3,V-4, выраженное в %.

Этапы 0 1 2 3

Рисунок 7 Результаты гибридизации по Саузерну штаммов, содержащих копии валинового оперона PR-ilvG*MED-2Tfd: 0 - контроль: штамм V-01 (1 копия), 1- штамм V-2 (4 копии), 2- штамм V-3 (7 копий), 3- шамм V-4 (10 копий). Данный радиоавтограф наглядно показывает поэтапное увеличение числа копий валинового оперона PR-ilvG*MED-2Tfd в хромосомах штаммов

Таким образом, проведенный повторный цикл амплификации привел к последующему увеличению числа копий валинового оперона с 7 до 10 в хромосоме исходного штамма V-3. Проведенный эффективный процесс амплификации валинового оперона сопровождался поэтапным увеличением продуктивности штаммов. Конструирование штамма-продуцента валина является примером эффективного применения способа увеличения числа копий интегративной кассеты путем последовательной амплификации с использованием только транспозазной плазмиды рМН10. В результате проведенной работы был получен бесплазмидный безмаркерный штамм-продуцент валина, в хромосоме которого содержится 10 интегрированных копий валинового оперона.

Выводы

1. Проведена оценка эффективности транспозиции группы транспозонов: Tn5, mini-Tn10, mini-Mu (MD4041), MD4041-thrA*BC. Показана высокая эффективность транспозиции mini-Mu транспозонов группы MD. Сконструированы штаммы-продуценты треонина с использованием интегративных векторов группы MD4041-thrA*BC. Показана нестабильность полученных штаммов, что явилось результатом высокой активности транспозазы, гены которой входят в состав данного транспозона.

2. Проведено разделение интегративного и транспозазного доменов mini-Mu вектора MD4041, и разработана двухплазмидная система. Плазмида-помощник pMH10 кодирует транспозазу A фага Mu, транспозиционный кофактор - белок B, термочувствительный репрессор cts62, репрессор ner и attL-сайт. Интегративный вектор содержит сайты необходимые для интеграции (attL- и attR-сайты фага Mu) и маркер антибиотической устойчивости.

3. Проведено сравнительное изучение эффективности интеграции векторов pM-cts-IAS и pM, в которые были клонированы гены треонинового и лейцинового оперонов. Эффективность интеграции составила: 98-100% для векторов группы pM, что было в 30-50 раз более эффективно, чем для векторов группы pM-cts-IAS (2-3%). Проведена оценка эффективности амплификации векторов двух видов. При проведении нескольких последовательных этапов амплификации с использованием вектора pM число копий mini-Mu кассет было увеличено с 4 до 7, а затем до 10. Амплификация векторов группы pM-cts-IAS происходила с такой же низкой эффективностью, как и интеграция, и число копий mini-Mu кассет было увеличено с 1 до 2, а затем до 3 при проведении второго этапа амплификации.

4. Проведена оценка эффективности интеграции и амплификации многокопийных и малокопийных интегративных векторов, не содержащих антибиотический маркер. Наиболее эффективные интегративные векторы включают только attL- и attR-сайты фага Mu: pM, pM16, pM17. Во всех случаях наблюдался высокий процент интеграции: 85-100% (репликон рМВ1), 75-100% (репликон pSC101).

5. Безмаркерные интегративные векторы были успешно использованы при конструировании генетически стабильного высокопродуктивного бесплазмидного штамма-продуцента валина, который содержал 10 копий mini-Mu кассет P_R-ilvG*MED-2T_fd.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Саврасова Е.А. // «Разработка интеграционной mini-Mu системы для обеспечения высокоэффективной интеграции и амплификации генетического материала в хромосому бактерии E. coli», Материалы международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Москва, 28 ноября - 1 декабря, 2006 г, стр. 77-78.

2. Саврасова Е.А. // «Интеграционная mini-Mu система применимая для конструирования бесплазмидных штаммов-продуцентов аминокислот на основе E. сoli», Материалы четвертого московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 12-16 марта, 2007, том 2, стр. 96.

3. Ахвердян В.З., Саврасова Е.А., Каплан А.М., Лобанов А.О., Вавилова Е.Ю., Козлов Ю.И. // «Разработка mini-Mu системы, обеспечивающей эффективную интеграцию генетического материала в хромосому бактерии Escherichia coli и его амплификацию». Биотехнология №3, 2007, стр.3-20.

4. Саврасова Е.А., Ахвердян В.З, Лобанов А.О., Каплан А.М., Вавилова Е.Ю., Козлов Ю.И. // «Создание mini-Mu системы, лишенной селективных маркеров, для интеграции генов в хромосому бактерии Escherichia coli». Биотехнология №4, 2007, стр.3-17.

5. Ахвердян В.З., Саврасова Е.А., Каплан А.М., Лобанов А.О., Козлов Ю.И. «Способ получения L-аминокислот, штамм Escherichia coli - продуцент L-аминокислоты». Патент РФ №2229513.

6. Ахвердян В.З., Саврасова Е.А., Каплан А.М., Лобанов А.О., Козлов Ю.И. «Способ получения L-треонина, штамм Escherichia coli - продуцент треонина». Патент РФ №2244007.

7. Ахвердян В.З., Саврасова Е.А. «Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia - продуцент треонина и способ получения L-треонина». Патент РФ №2288264.

Размещено на Allbest.ru