Морфофункциональное состояние и дифференцировочный потенциал культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека при моделировании эффектов микрогравитации

А Б

Рис. 12. Индуцированная экспрессия щелочной фосфатазы. А - экспозиция 10 суток, Б - 20 суток. (M±m, данные четырех независимых экспериментов, в каждом из которых анализировали 5-10 тыс кл., p<0,05^* - различия достоверны по сравнению с шейкером, критерий Манна-Уитни). СК - статический контроль, Ш - шейкер. (Кривая С указывает на процентное содержание окрашенных клеток в популяции).

При изучении выработки и структурной организации органического матрикса, образуемого в ходе остеогенной дифференцировки ММСК, было обнаружено, что у клеток, культивировавшихся в течение 10 суток в среде с остеогенными стимулами в статических условиях и на шейкере, коллагеновый матрикс был хорошо структурирован, отчетливо проявлялась его характерная зигзагообразная организация. В то же время, островки коллагенового матрикса практически отсутствовали при экспозиции клеток на RPM на тех же временных сроках. Интересно, что к 20-м суткам культивирования клеток в остеогенной среде описанные различия в структурной организации коллагенового матрикса между контрольными и опытными культурами немного сглаживались, но полностью не исчезали (Рис.13).

А Б

Рис. 13. Структурная организация внеклеточного коллагенового матрикса в культурах остеогенных производных ММСК. А - экспозиция 10 суток; Б - экспозиция 20 суток (а, в - статический контроль; б, г - RPM). Ув.х200.

При оценке поздних этапов остеогенной дифференцировки в культурах ММСК, последовательно прошедших все этапы остеогенеза при их экспозиции на RPM, при общем достаточно низком уровне кальцификации матрикса во всех экспериментальных группах между ними не было выявлено значимых отличий. Изучение формирования очагов кальцификации в культурах престимулированных остеогенных производных ММСК показало, что минерализация матрикса на определенных сроках экспозиции на RPM в культурах полностью отсутствует (Рис. 14, А). Мелкие островки кальциевого вещества обнаруживались в опытных культурах на гораздо более поздних этапах культивирования. В контрольных группах клеток в это же время очаги кальциевой минерализации сливались друг с другом, в результате чего до ~99% площади поверхности клеточных культур было «замуровано» в минерализованное межклеточное вещество, то есть процесс остеогенной дифференцировки клеток был на завершающих стадиях (Рис. 14, Б). Интересно, что примерно такая же картина наблюдалась и в культурах остеобластов, которые экспонировали на RPM c одновременной остеогенной стимуляцией, с той лишь разницей, что сам процесс формирования минерализованного матрикса происходил у них в более короткие сроки (Рис.14, С).

Таким образом, длительная экспозиция клеток различного уровня коммитированности на RPM приводила подавлению конечных этапов индуцированного остеогенеза как остеогенных производных ММСК, так и остеобластов, что, вероятно, свидетельствует об универсальном характере клеточных реакций на пребывание в условиях моделирования эффектов микрогравитации.

(А) Остеогенные производные ММСК

(Б) Остеогенные производные ММСК

(С) Остеобласты

Рис.14. Минерализация внеклеточного матрикса солями кальция, образованная в ходе индуцированной остеогенной дифференцировки остеогенных производных ММСК и остеобластов в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM. А,С - экспозиция 20 суток, Б - экспозиция 30 суток (а, г, и - статический контроль; б, д, к - шейкер; в, е, л - RPM). Ув.х100.

Рис.15. Морфология адипоцитоподобных клеток, образованных в ходе адипогенеза адипогенных производных ММСК в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM в течение 10 суток. а - статический контроль, б - шейкер, в - RPM. Ув.х100.

Рис.16. Эффективность индуцированного адипогенеза ММСК (а) и адипогенных производных ММСК костного мозга человека (б) в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM. (Репрезентативные данные, представлено среднее значение числа клеток в поле зрения и стандартное отклонение среднего, n=10), СК - статический контроль, Ш - шейкер.

Исследования показали, что морфологические характеристики адипоцитоподобных клеток и эффективность индуцированной адипогенной дифференцировки ММСК, а также их престимулированных производных после 20 суток воздействия адипогенных стимулов не изменялись при экспозиции клеток в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM (Рис. 15, 16).

Таким образом, несмотря на некоторые теоретические предпосылки, свидетельствующие о возможности активации адипогенной дифференцировки ММСК в условиях микрогравитации [Zayzafoon et al., 2004], на основании полученных данных можно заключить, что индуцированная адипогенная дифференцировка ММСК в отличие от индуцированной остеогенной дифференцировки не изменяется при моделировании эффектов микрогравитациии.

ВЫВОДЫ

1) Подобраны оптимальные режимы культивирования и индукции дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека (ММСК) и коммитированных клеток-предшественников на горизонтальном клиностате и Устройстве для рандомизации положения (RPM), которые позволяют воспроизводить эффекты влияния микрогравитации на культивируемые клетки в наземных условиях.

2) Моделирование эффектов микрогравитации приводит к изменению кинетики роста ММСК, а также коммитированных к остеогенезу клеток-предшественников. Прирост количества клеток после 72 часов экспозиции достоверно снижается в 4 - 6 раз при клиностатировании и в 1,6 - 2 раза при рандомизации положения культуры клеток с помощью RPM.

3) В условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации (20 суток) ММСК и их остеогенные производные сохраняют экспрессию основных поверхностных антигенов стромальных клеток - CD29, CD90, CD44 и не экспрессируют гемопоэтические маркеры - CD34, CD45, HLA DR. Доля клеток, экспрессирующих рецептор адгезии CD106 значительно уменьшается при остеогенной дифференцировке ММСК. При коммитировании ММСК к остеогенезу моделирование эффектов микрогравитации с помощью RPM, но не клиностата, приводит к увеличению числа клеток, экспрессирующих HLA A,B,C.

4) Длительное моделирование эффектов микрогравитации приводит к возрастанию (1,7 - 3,2 раза) продукции интерлейкина-8 в культурах ММСК и их остеогенных производных, при этом моделирование эффектов микрогравитации с помощью RPM стимулирует продукцию ИЛ-8 на более ранних этапах экспозиции.

5) При коммитировании ММСК к остеогенезу в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM наблюдается достоверное уменьшение числа клеток, экспрессирующих щелочную фосфатазу, что свидетельствует о подавлении начальных этапов дифференцировки ММСК в остеобласты.

6) В условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации ухудшается «качество» основных структурных компонентов костного матрикса. В ходе коммитирования ММСК к остеогенезу замедляется выработка коллагена I типа клетками, что сопровождается последующими изменениями в структурной организации органического матрикса. При экспозиции более дифференцированных остеогенных клеток снижается уровень кальциевой минерализации матрикса.

7) Длительное моделирование эффектов микрогравитации не влияет на эффективность индуцированной адипогенной дифференцировки ММСК и коммитированных адипогенных производных ММСК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

* Для моделирования эффектов микрогравитации в наземных условиях рекомендуется использование Устройства для рандомизации положения культуры клеток относительно вектора земной гравитации - Random Positioning Machine (RPM).

* Для изучения молекулярно-клеточных механизмов дифференцировки стволовых клеток и остеогенных клеток-предшественников рекомендуется применять способ рандомизации положения объекта относительно вектора земной гравитации с помощью RPM, который имеет преимущество перед горизонтальным клиностатированием за счет меньшего вклада посторонних факторов, таких как перемешивание среды культивирования и действие центробежных сил, и более эффективной имитации влияния микрогравитации на культивируемые клетки-предшественники.

* Экспозиция клеток-предшественников на RPM способствует сохранению менее дифференцированного состояния культуры клеток, в связи с чем может быть рекомендована к использованию для предупреждения процессов спонтанной или индуцированной дифференцировки клеток в остеогенном направлении.

* Для изучения фактора силы сдвига жидкости и активации ранних этапов процесса коммитирования ММСК в остеогенном направлении целесообразно применять культивирование клеток на горизонтальном орбитальном шейкере при 60 об/мин, при условии полного заполнения культуральных флаконов средой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах:

1) Морфофункциональное состояние и остеогенный дифференцировочный потенциал мезенхимальных стромальных клеток-предшественников человека при моделировании эффектов микрогравитации in vitro. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007. №4. С. 196-202. (Соавтор: Буравкова Л.Б.).

2) Продукция интерлейкинов в культуре мезенхимальных стромальных клеток человека при моделировании эффектов микрогравитации. Авиакосмическая и экологическая медицина. 2009. №3. С. 43-46. (Соавтор: Буравкова Л.Б.).

3) Cultured stem cells are sensitive to gravity changes. Acta Astronautica. 2008. №63. P. 603-608. (Co-authors: Buravkova L.B., Romanov Yu.A., Konstantinova N.A., Buravkov S.V., Grivennikov I.A.).

4) The primary effects of prolonged gravity vector randomization (2D-clinorotation) on precursor's cells in vitro. Jornal of Gravitational Physiology. 2007. Vol. 14. №1. Р. 133-134. (Co-authors: Konstantinova N.A., Buravkova L.B., Gershovich P.M.).

Тезисы конференций:

5) Влияние рандомизации вектора гравитации на морфофункциональные характеристики клеток-предшественников мезенхимального ряда in vitro. V Международный Симпозиум «Актуальные проблемы биофизической медицины». Киев. 2007. С. 45. (Соавторы: Гершович П.М., Буравкова Л.Б.).

6) Адипогенная дифференцировка мезенхимальных стромальных клеток из костного мозга человека в условиях рандомизации вектора гравитации in vitro. 6-я Конференция молодых учёных и специалистов, аспирантов и студентов, посвящённая дню Космонавтики. Москва. 2007. С. 17.

7) The primary effects of prolonged gravity vector randomization (2D-clinorotation) on precursor's cells in vitro. 28^th Annual International Gravitational Physiology Meeting. Сан-Антонио, США. 2007. С. 117. (Co-authors: Konstantinova N.A., Gershovich P.M., Buravkova L.B.).

8) Влияние 3D-клиностатирования на индуцированную остеогенную дифференцировку различных культивируемых остеогенных клеток-предшественников человека. 7-я Конференция молодых учёных и специалистов, аспирантов и студентов, посвящённая дню Космонавтики. Москва. 2008. С. 14-15.

9) Reduced osteogenesis of human osteogenic precursors' cells cultured in the random positioning machine. 29^th Annual International Gravitational Physiology Meeting. Анже, Франция. 2008. С. 51. (Co-author: Buravkova L.B.).

10) Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга человека как модель для изучения гравирецепции клеток в культуре. 1-я конференция «Методы культивирования клеток». Санкт-Петербург. 2008. С. 799-800. (Соавторы: Гершович П.М., Буравкова Л.Б.).

11) Гравирецепция в культуре мезенхимальных клеток-предшественников. Тезисы докладов. 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. «Биология-наука XXI века». Пущино. 2008. С. 172. (Соавторы: Гершович П.М., Буравкова Л.Б.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИЛ-8 - интерлейкин-8

ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

ЩФ - щелочная фосфатаза

FITC - флюоресцеинизотиоционат

PE - фикоэритрин

RPM - Random Positioning Machine

TNF-б - фактор некроза опухолей альфа

Размещено на Allbest.ru