Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания

Рис. 19 Схема паттерна и серологические свойства БТШ70 разных видов Drosophila. Указаны значения градиента рН и молекулярные массы в кДа

Нами был проведён анализ с более высоким разрешением зоны 70 кДа и изучен характер экспрессии БТШ при различных температурах. Паттерн БТШ70 разных линий и видов внутри группы D. virilis имеет сходные характеристики, сильно отличаясь от паттерна у D. melanogaster и D. mojavensis (рис. 19). У всех исследованных видов и линий группы D. virilis индуцибельные БТШ70 делятся на две группы, отличающиеся по молекулярной массе и изоэлектрической точке, причём каждая группа может включать несколько изоформ. Молекулярные массы белков, входящих в каждую группу, были ориентировочно определены методом электрофореза по маркеру как 70 и 72 кДа.

Практически каждая исследованная линия D. virilis и D. lummei имеет индивидуальный паттерн БТШ70. Интересно, что у всех видов группы D. virilis только группа БТШ70 с молекулярной массой 70 кДа узнаётся антителами 7FB. Белки с молекулярной массой 72 кДа реагируют только с антителами 7.10.3, то есть их серологические свойства напоминают свойства БТШ68 D. melanogaster. Паттерн конститутивных БТШ70, реагирующих с антителами 7.10.3, не отличается у всех рассматриваемых видов, что, очевидно, говорит об их более высокой эволюционной консервативности. Чтобы классифицировать две группы БТШ70 видов филады D. virilis, был предпринят пептидный анализ белков, относящихся к обеим группам. Подтвердилось, что белок с массой 70 кДа и изоэлектрической точкой ~ 6,1 у видов филады D. virilis является гомологом БТШ70 D. melanogaster, а белок с массой 72 кДа и изоэлектрической точкой ~ 5,75 гомологичен БТШ68.

Результаты секвенирования гена бтш68 выявили удлинение С-концевого домена, что объясняет бьльшую молекулярную массу белка (Velikodvorskaia et. al., 2005).

4.9. Изучение паттерна других групп БТШ, индуцируемых тепловым шоком у видов группы virilis. Кроме БТШ70, была изучена экспрессия других семейств БТШ у видов группы virilis. У всех термоадаптированных разновидностей наблюдается более интенсивное включение L-35S-метионина в низкомолекулярные БТШ и БТШ40.

Это было показано на примере линий 9, 101, 160, 1433, Т53 и Т61 D. virilis, линии 424 D. novamexicana, D. mojavensis и линии ТТ D. melanogaster. У D. lummei (линии 200, 202, 207, 1102 и 1109), D. texana (линия 423) и D. melanogaster (линия OR) включение метки в низкомолекулярные БТШ и БТШ40 происходит со значительно более низкой интенсивностью (рис. 20). При субкритических температурах у них снижается уровень включения метионина в БТШ70. Увеличение уровня экспрессии БТШ40 и низкомолекулярных БТШ у видов, обитающих в жарком климате и подверженных действию более высоких температур, может играть значительную роль в формировании термальной адаптации (см. ниже).

Все точки - 40,5С, 3 ч восстановления. Числами указаны молекулярные массы белков в кДа, 70с - конститутивные формы БТШ70.

4.10. Вклад нмБТШ в термоустойчивость. Из ряда работ известно, что большой вклад в термоустойчивость вносит семейство низкомолекулярных БТШ (Tanguay, 2006). Результаты двумерного электрофореза, показывают, что у более термоустойчивых видов: - D. virilis и D. novamexicana включение 35S-L-метионина в группу низкомолекулярных белков 22 - 27 кDa и 40 кDa значительно выше, чем у линий D. lummei и D. texana.

Аналогичная картина характерна для линий D. melanogaster OR и ТТ, а именно, у линии ТТ наблюдается более значительное включение 35S-L-метионина в группу с мол. массой 40 кD и 22 - 27 кD. Нами был подробно изучен синтез нмБТШ у видов Drosophila с разным уровнем термальной адаптации - D. virilis, D. lummei, и D. melanogaster OR. Количественное определение содержания нмБТШ, у всех трёх видов методом Вестерн-блоттинга с антителами, реагирующими с нмБТШ, с последующей денситометрией автографов, выявило более высокое содержание нмБТШ у D. virilis по сравнению с D. lummei и D. melanogaster как при контрольной температуре (25єС), так и при ТШ различной интенсивности (рис. 21).

Рис. 2 Результаты исследований нмБТШ у разных видов Drosophila

Содержание нмБТШ у D. melanogaster OR, D. lummei 200 и D. virilis 9 в зависимости от значений ТШ и времени восстановления. Значения даны относительно концентрации нмБТШ у OR при 37.5ОС и 1 ч восстановления.

Спектр изоформ нмБТШ у D. melanogaster OR значительно отличается от сходных друг с другом спектров изоформ нмБТШ у линий D. virilis и D. lummei (рис. 22.) При этом следует отметить большее число изоформ у термоустойчивого вида D. virilis, чем у D. lummei и D.

4.11. Анализ структуры кластера генов бтш70 D. virilis и D. lummei. Исходя из имеющихся литературных данных о важной роли БТШ70 в термальной адаптации у разных организмов, представляло интерес определить структуру кластера генов бтш70 у используемых в работе видов и линий, контрастных по термоустойчивости. Интересно также выяснить, обусловливается ли повышенный синтез БТШ70 при ТШ у некоторых линий D. virilis увеличением числа копий гена бтш70 или изменениями в их структуре. Для выяснения этих вопросов был проведён Саузерн-анализ геномной ДНК разных линий D. virilis и D. lummei с использованием различных зондов к кодирующей части генов бтш70. Для анализа использовались ферменты рестрикции, сайты которых находятся преимущественно вне кодирующей последовательности генов. При обработке ДНК всех линий D. virilis рестриктазой XbaI образуются три фрагмента ДНК длиной 3, 4 и 10 т.п.о., гибридизующиеся как с 5'-, так и с 3'-фрагментом гена бтш70 D. melanogaster, меченными 32Р (рис. 23).

Таким образом, сайты XbaI расположены за пределами структурной части генов и консервативны для всех линий D. virilis. Гибридизация в области фрагмента длиной 4 т.п.о. у разных линий D. virilis имеет разную интенсивность, что позволяет предположить наличие разного числа копий данных фрагментов и, соответственно, входящих в их состав генов бтш70 у разных линий. Внутривидовые различия в числе копий бтш70 ранее не были описаны в литературе.

Рис. 23 Саузерн-анализ геномной ДНК из разных линий D. virilis и D. lummei. Гибридизация с PCR-фрагментом гена бтш70 D. lummei 200. 1 - D. lummei 200; 2 - D. lummei 202; 3 - D. lummei 1102; 4 - D. virlis 160; 5 - D. virlis 1433; 6 - D. virilis T-53; 7 - D. virilis 9; 8 - D. virilis T-40

4.12. Определение числа копий гена бтш70 у разных линий D. virilis и D. lummei. Для проверки гипотезы о наличии разного количества копий гена бтш70 у разных линий внутри вида Drosophila virilis было проведено измерение интенсивности гибридизации радиоактивно меченого зонда из гена бтш70 D. lummei с фрагментами, получаемыми при обработке геномной ДНК разными ферментами рестрикции (метод определения числа копий гена по Саузерну). Рестрикция для анализа проводилась ферментами XbaI, XbaI/AccI и XbaI/HindIII.

Интенсивность гибридизации линейно зависит от содержания ДНК в геле. В качестве внутреннего стандарта для рестрикции XbaI использовались уникальные фрагменты длиной 10 и 3 т.п.о., содержащие по одной копии гена, а в случае рестрикции по XbaI/AccI - фрагменты длиной 5 и 3 т.п.о. Число копий гена бтш70 у различных линий D. virilis приводится в таблице 2. Расчеты проводились на основе обсчета четырех независимых экспериментов, с достаточно высокой точностью (относительная ошибка не превышает 10%). Внутривидовые различия в числе копий бтш70 у природных линий Drosophila обнаруживаются впервые.

Как уже говорилось выше, наибольший интерес в данной работе представляет сравнение числа копий и структуры генов бтш70 D. virilis и D. lummei. Будучи северным видом с низкой термальной адаптацией, D. lummei резко отличается от D. virilis по количеству и динамике синтеза мРНК и белка БТШ70 (см. выше).

При рестрикции XbaI у всех линий D. lummei образуются четыре фрагмента длиной 2,8; 3,2; 4,5 и 10 т.п.о. (рис. 23). У 200-й линии все четыре фрагмента с одинаковой интенсивностью гибридизуются с 5'-фрагментом гена бтш70 D. melanogaster, у остальных линий фрагмент длиной 4,5 т.п.о. гибридизуется более интенсивно.

Таблица 2 Число копий гена бтш70 у разных линий D. virilis и D. lummei. * - одна из копий функционально неактивна

При рестрикции XbaI/AccI из XbaI-фрагмента длиной 2,8 т.п.о. вырезается участок длиной ~ 1,6 т.п.о. Оба эти фрагмента не гибридизуются с зондом к 3'-кодирующей части гена бтш70 D. melanogaster., По всей видимости, данная копия бтш70, утратила 3'-кодирующую часть гена и представляет собой функционально неактивный псевдоген. Таким образом, анализ геномной ДНК по Саузерну выявляет значительные отличия в структуре кластера генов бтш70 D. lummei по сравнению с D. virilis.

4.13. In situ-гибридизация с политенными хромосомами D. virilis и D. lummei. В работе М.Б. Евгеньева с соавторами (Evgen'ev M.B., et al., 1978) было показано, что мРНК, выделенная из клеток D. virilis после ТШ, меченная радиоактивным йодом, гибридизуется с двумя единичными локусами политенных хромосом - 29С и 20F. Нами было показано, что гены бтш70 расположены в локусе 29С. Для наглядной иллюстрации различия числа копий генов у D. virilis и D. lummei была поставлена in situ-гибридизация с политенными хромосомами гибридов F1 D. virilis 160 х D. lummei 200. Гибридизация была поставлена с меченой пробой D. lummei 200, содержащей бтш70 и прилежащую 3'-фланкирующую последовательность, включающую в себя повтор, специфичный для D. lummei. На рис. 24 видно, что бьльший по размеру пуф D. virilis, содержащий 7 копий генов бтш70, гибридизуется с пробой интенсивнее, чем меньший по размеру пуф D. lummei 200, содержащий 3 копии.

Рис. 24 Анализ генов бтш70 у гибридов D. virilis и D. lummei методом in situ гибридизации на политенных хромосомах

4.14 Определение структуры кластера генов бтш70 D. virilis и D. lummei на основе рекомбинантных фагов л. Исходя из картины in situ-гибридизации, а также из данных, полученных для других видов Drosophila, мы предполагали, что у D. virilis и D. lummei гены бтш70 организованы в виде одного кластера, как, например, у D. auraria. Для проверки этой гипотезы, а также для определения нуклеотидной последовательности генов бтш70 и прилегающих последовательностей были получены геномные библиотеки в фаговом векторе лDASH. Для получения библиотек использовались линия D. virilis 160 и линия D. Lummei 200. Было отобрано пять фагов из библиотеки D. virilis, обозначенных как 1, 2, 3, 7 и 17, и четыре фага из библиотеки D. lummei, обозначенных как 1/1, 17, 39 и 42 (см. рис. 25).

Рис. 25 Структура рекомбинантных фагов л и кластеров генов бтш70 D. virilis 160 и D. lummei 200. Красными стрелками выделены гены бтш70, нефункциональная копия D. lummei отмечена розовой стрелкой. Подробнее см. в тексте

Фрагменты, полученные при расщеплении фаговой ДНК различными рестриктазами и их комбинациями, были переклонированы в плазмиду pBluescript SK-. Были построены рестриктные карты, проанализированы данные по гибридизации фрагментов рестрикции с зондами к различным участкам генов бтш70 и фланкирующих последовательностей, и определены нуклеотидные последовательности ряда фрагментов. На основе этих результатов были сделаны выводы о перекрывании фагов, взаимной ориентации генов бтш70 и расстояниях между ними. В состав рекомбинантных фагов из линии 160 D. virilis входят шесть полных копий генов бтш70 и 3'-фрагмент седьмой копии, ограниченный сайтом Sau3A, образованный при частичной рестрикции ДНК для последующего клонирования в составе вектора лDASH.

Фаги, полученные из линии 200 D. lummei, также имеют в своём составе перекрывающиеся последовательности: было показано перекрывание между фагами 17, 39 и 42. В составе этих фагов были клонированы три полноразмерных копии гена бтш70 D. lummei. Данные по перекрыванию фагов и структуре кластера генов бтш70 D. virilis 160 и D. lummei 200 суммированы на рис. 25.

Было показано, что гены бтш70 линии D. virilis 160 действительно организованы в форме кластера из 7-и копий, что подтверждает данные Саузерн-анализа и гибридизации in situ. Шесть генов расположены в тандемной ориентации на расстоянии 4,8 т.п.о. один от другого (считая границами ТАТА-бокс и сигнал полиаденилирования ААТААА), а седьмая копия имеет обратную ориентацию и расположена на расстоянии ~ 1,5 т.п.о. от соседней (см. рис. 25). Таким образом, два гена бтш70 у линии D. virilis 160 образуют инвертированный повтор, что характерно для всех изученных на сегодняшний день видов Drosophila.

У 200-й линии D. lummei так же, как и у D. virilis, два гена бтш70 расположены в виде инвертированного повтора на расстоянии ~ 1,5 т.п.о. друг от друга. Третья копия в составе фагов 17 и 42, как и копии, входящие в инвертированный повтор, является полноразмерной. Расстояние до этой копии установить не удалось, так как между фагами 1 и 17 отсутствует перекрывание. Для клонирования усеченной копии бтш70, из обработанной ферментом рестрикции XbaI геномной ДНК D. lummei, была получена плазмидная библиотека, которую скринировали XbaI/BamHI фрагментом гена бтш70а D. lummei. Полученные позитивные клоны секвенировали и обнаружили, что в состав клонированного 2.8 т.п.о. фрагмента входит усеченная копия бтш70с. У данной копии отсутствуют 300 н.п. кодирующей последовательности с 5' конца и 813 н.п. из 3' участка. Для определения локализации псевдогена были подобраны праймеры из 3' участка полученного клона и из 5'-конца фага 17. Методом ПЦР был амплифицирован, клонирован и секвенирован межгенный район бтш70с - d.

Можно сделать вывод, что кластеры генов бтш70 у D. virilis и D. lummei различаются по структуре, что выражается в различном числе копий, бьльших расстояниях между тандемно расположенными генами у D. lummei и разной структуре межгенных участков. Кроме того, одна из копий в составе кластера бтш70 D. lummei, является псевдогеном с делецией 5'- и 3'-участков. С другой стороны, у D. lummei, как и у D. virilis имеются два гена, образующие инвертированный повтор.

4.15. Определение первичной последовательности генов бтш70 и прилежащих участков у D. lummei, D. virilis и D. montana. Для более детального функционально-структурного анализа кластера генов бтш70 была полностью определена нуклеотидная последовательность шести генов из линии D. virilis 160 (бтш70a - c и бтш70e - g), и всех четырёх генов из линии D. lummei 200 (бтш70d), клонированных в плазмиду pBluescript SK-. Из генома D. montana 1071.0 был клонирован и секвенирован ген бтш70, с прилежащими 5`- и 3`-фланкирующими последовательностями.

Результаты сиквенса и трансляции белковых продуктов опубликованы в базе данных GenBank NCBI под номерами AY445083, AY445084, AY445085, AY445086, AY445087, AY445088, AY445089, AY445090, AY445091, AY445092, AY445093, AY665298 и AY665299. Полная нуклеотидная последовательность гена бтш70 D. montana депонирована под номером EU523047.

Шесть полностью секвенированных копий генов бтш70 D. virilis высоко консервативны и содержат всего 5 замен на всём протяжении кодирующей последовательности. Из них три замены приходятся на незначащий третий нуклеотид в мультикодирующих кодонах и две - приводят к замене аминокислотного остатка в последовательности кодируемого белка: замена GGG (глицин) на GTG (валин) и GTA (валин) на GCA (аланин). По сравнению с генами бтш70 D. virilis, ген бтш70d D. lummei содержит 33 нуклеотидных замены в составе кодирующей последовательности, из которых 28 являются незначащими, а 5 приводят к замене аминокислотного остатка, и делецию 9-и пар оснований после 1456-го нуклеотида относительно старта транскрипции.

Интересные результаты дало сравнение области промотора бтш70 D. virilis с промоторами генов бтш70 D. lummei, D. montana и D. melanogaster. Промоторные области генов бтш70 D. virilis, D. lummei и D. montana имеют по две канонических последовательности HSE, тогда как в составе промотора бтш70 D. melanogaster обнаружены четыре копии HSE.

В области 3'-фланкирующей последовательности генов бтш70 D. virilis и D. lummei наблюдается бьльшая дивергенция, чем между самими генами, выражающаяся в наличии нуклеотидных замен и делеций. Нуклеотидная последовательность генов бтш70 D. virilis , D. lummei и D. montana на 80% гомологична генам бтш70 D. melanogaster, такая же гомология наблюдается и между аминокислотными последовательностями белковых продуктов.

В области 3'-фланкирующей последовательности всех генов бтш70 D. virilis, D. lummei и D. montana обнаружен фрагмент мобильного элемента SGM (Corvelo, 2004). Данный мобильный элемент относится к эволюционно древним повторяющимся последовательностям. Был клонирован XbaI/AccI-фрагмент из фага №7 D. virilis, содержащий данную последовательность, и проведён Саузерн-анализ геномной ДНК D. virilis и D. lummei на содержание последовательностей, гомологичных SGM. Как видно из рис. 26, у D. virilis данные повторы локализованы преимущественно в области генов бтш70. В случае D. lummei повторы амплифицированы и, помимо локуса бтш70, распространены по всему геному. Повторяющиеся последовательности, в том числе мобильные элементы, могут играть важнейшую роль в эволюции, в частности способствовать изменению числа копий генов путём неравного кроссинговера и/или внутрихромосомной рекомбинации.

Для проверки гипотезы о роли ретроэлемента SGM в возможных перестройках кластера генов бтш70 у видов группы virilis был проведён Саузерн-анализ структуры кластера у 10 различных генетических линий вида D. virilis. В ходе исследования в линии А11 была обнаружена вставка размером 3,6 т.п.о. в участок ДНК между генами бтш70a и бтш70b, расположенными в виде инвертированного повтора. Клонирование и последующее секвенирование участка ДНК между генами бтш70a и бтш70b линии А11 D. virilis показало, что в данном участке находится интермедиатный повтор SGM.

Кластер генов бтш70 D. lummei отличается от кластера D. virilis по числу и расположению тандемно ориентированных копий, находящихся на больших расстояниях друг от друга. Таким образом, можно сказать, что в ходе эволюции группы virilis изменялось число тандемно ориентированных копий. Общая схема предполагаемой эволюции кластера генов бтш70 D. virilis и D. lummei приведена на рис. 27.

D. pseudoobscura, один из предковых видов рода Drosophila, имеет единственный локус, содержащий два гена бтш70 в виде инвертированного повтора (B. Bettencourt, unpublished data). Из этого следует, что дополнительные копии бтш70 D. virilis (бтш70c - g) образовались в ходе тандемных дупликаций. В ходе дивергенции видов D. virilis - D. lummei, по-видимому, произошла потеря части тандемно ориентированных копий и увеличение длины межгенных участков между ними. Возможным механизмом участия SGM в увеличении или уменьшении числа копий генов бтш70, а также увеличения расстояния между генами бтш70 у D. lummei, может являться неравный кроссинговер и/или рекомбинация между гомологичными участками одной хромосомы.

Особи D. lummei с уменьшенным числом копий генов бтш70 и пониженной экспрессией БТШ70 не выбраковывались в ходе естественного отбора, так как, будучи обитателями климатических зон с умеренным климатом, не подвергались воздействию высоких температур.

Рис. 27 Эволюция кластера генов у группы virilis

Эта гипотеза подтверждается наличием в 3'-фланкирующей последовательности генов бтш70g D. virilis и бтш70d D. lummei специфичной 24-нуклеотидной последовательности, не встречающейся в составе других генов. Возможно, гены бтш70g D. virilis и бтш70d D. lummei являются гомологами, и в ходе эволюции D. lummei были делетированы копии бтш70c - f D. virilis.

5. Роль мобильных элементов в эволюции генов бтш

Одним из важных вопросов, привлекающих внимание исследователей, является анализ закономерностей эволюции семейства генов бтш70. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при эволюции системы генов бтш70 могли происходить как изменения в числе копий бтш70, так и изменения в структуре самого кластера генов, как это было обнаружено у видов D. virilis и D. lummei. По-видимому, важную роль в этом процессе играет древний мобильный элемент SGM. Мобильные элементы (МЭ), встраиваясь в промоторную область генов, могут частично или полностью инактивировать соответствующие копии (Lerman et al., 2003), что приводит к изменению уровня экспрессии БТШ и терморезистентности организма. Некоторые исследования указывают на то, что МЭ неслучайно перемещаются по геному в процессе транспозиции (Евгеньев, 1998). Имеются данные, что гены бтш70, в особенности их регуляторные зоны, являются «горячими точками» при транспозиции МЭ, из-за конститутивно деконденсированного состояния хроматина таких районов ДНК (Karpov,1984). Выявление преимущественных мест встраиваний и оценка влияния МЭ на функционирование генов бтш70 позволяет изучить возможный путь эволюции основной защитной системы организмов, а также установить роль МЭ в процессах микроэволюции и адаптации.

Очередной задачей данного исследования была попытка ответить на вопрос - действительно ли промоторы генов бтш70 являются «горячими точками» инсерций МЭ, и как такие встраивания влияют на терморезистентность. Для выполнения этой задачи, на модельной системе D. melanogaster, исследовали перемещение конструкции, созданной на основе Р элемента, в гены бтш70.

5.1. Получение инсерций конструкции на основе Р элемента в гены бтш70 методом Р-инсерционного мутагенеза. В данной работе была использована модель целенаправленного получения транспозиций конструкции EPgy2 на основе Р элемента в локус генов теплового шока, примененная при изучении малых генов ТШ (Timakov B., 2002), с некоторыми изменениями. Из коллекции центра (Bloomington Drosophila Stock Center) были получены две лабораторные линии D. melanogaster №15616 и №15904 (обозначенные далее как US-4 и US-2), содержащие исходную конструкцию EPgy2 в локусе 87А на расстоянии 8 и 5 т.п.о., соответственно, от старта транскрипции гена бтш70 Ab (рис.28).

Рис. 28 Расположение исходной конструкции EPgy2 в линиях US-4 (в положении +243 относительно старта транскрипции гена CG12213) и US-2 (+33 относительно старта транскриции гена aur) D. melanogaster. Стрелками указано направление транскрипции генов

Также была получена линия №1429 (обозначена далее как Д2-3), несущая ген транспозазы Р элемента.

В результате скрещиваний (Рис. 29) нами были выведены линии с перемещением конструкции. Для линий, полученных из US-4, общая частота перемещения конструкции составляет 7,5%, для линий US-2 - 4,9%. Некоторые инсерции конструкции в гены бтш70 были переведены в гомозиготное состояние.

5.2 Идентификация инсерций EPgy2 методом Саузерн-блот-анализа. Анализ проведенных скрещиваний позволил отобрать линии с дополнительными инсерциями EPgy2 в той же хромосоме, что и стартовый элемент. Для того чтобы определить, произошло ли встраивание EPgy2 в какую-либо из шести копий гена бтш70, был проведен Саузерн-анализ геномной ДНК трансгенных линий. При обработке геномной ДНК D. melanogaster парой рестриктаз BamHI/HindIII образуется набор фрагментов разной величины, специфичный для разных копий гена бтш70 (рис. 30А, Б, В).

Рис. 30 А. Гибридизация с 5'-фрагментом гена бтш70 D. melanogaster. Стрелками показаны линии, несущие инсерции EPgy2 в разных копиях бтш70 (Аа и Аb). Справа указан молекулярный вес фрагментов гибридизации, специфичных для разных копий бтш70. Б. Гибридизация с 3'-фрагментом гена бтш70 D. melanogaster. В. Схема сайтов рестрикции BamHI/HindIII генов бтш70, расположенных в локусе 87А (бтш70 Aa , Ab) и 87С (бтш70 Ba, Bbb, Bb, Bc) (Gong and Golic, 2004); сайты рестриктаз BamHI и HindIII обозначены серыми треугольниками

Использование данных рестриктаз и последующая гибридизация с зондами к 5' и 3' участкам гена бтш70 позволяет выявить изменения, происходящие со всеми копиями гена бтш70. Так как конструкция EPgy2 содержит на 5'- и 3'-концах сайты для рестриктазы HindIII, то появление инсерций в генах бтш70 в гетерозиготных линиях фиксировали как появление низкомолекулярного дополнительного фрагмента гибридизации. При этом наблюдали уменьшение интенсивности гибридизации той копии гена бтш70, в которую произошло встраивание. При выведении линий в гомозиготное состояние, полностью исчезает фрагмент, соответствующий исходной копии гена, и увеличивается интенсивность гибридизации нового фрагмента с инсерцией EPgy2. Нами не было зафиксировано ни одного случая внедрения конструкции в 3'-кодирующий или фланкирующий участок бтш70 (рис. 30Б); все встраивания произошли в 5'-район генов бтш70, расположенных в локусе 87А - бтш70Aa и Ab.

Нами было зарегистрировано 31 встраивание EPgy2 в гены бтш70 из 375 локальных перемещений конструкции для линий, выведенных из US-4, и 14 инсерций для линий, полученных из US-2 (из 160 проанализированных локальных перемещений).

5.3. Точная локализация полученных инсерций EPgy2. C помощью Саузерн-анализа было выявлено, что все инсерции EPgy2 происходят в 5'-районы генов бтш70 локуса 87А. Для точной локализации места встраивания были проведены полимеразные цепные реакции с разным набором праймеров с последующим секвенированированием полученных фрагментов. После серии ПЦР было доказано, что конструкция встраивается в регуляторную область бтш70. На рис. 31 приведен пример ПЦР для нескольких линий.

На дорожках 1 - 5 представлены результаты ПЦР для пяти разных трансгенных линий с праймерами из 5'-конца бтш70 (№2) и из 3'-конца EPgy2 (№7). Разный размер синтезированных фрагментов свидетельствует о разных местах встраивания.

Рис. 31 Локализация инсерций и ориентации конструкции EPgy2 методом ПЦР. А. ПЦР с праймерами: 2-7: 1 - линия 31IIa, 2 - 5IId, 3 - 111IIa, 4 - 1IIa, 5 - 134Ib; с праймерами 2-6: 6 - 1IIa; с праймерами к Р элементу и гену aur для идентификации исходной конструкции: 7 - 31IIa, 8 - 5IId, 9 - 111IIa, 10 - 1IIa, 11 - 134Ib. Б. Схематическое изображение встраивания EPgy2 в промоторную область гена бтш70Аа и праймеров, использованых для локализации инсерции.

Саузерн-анализ показал, что инсерции EPgy2 происходят в 5'-регуляторную зону генов бтш70 Aa и Ab. Для подтверждения транспозиции в ту или иную копию гена бтш70 были поставлены ПЦР с праймерами из 5'-кодирующей части бтш70 наружу (последовательность идентична для обеих копий гена бтш70 Aa и Ab) и праймерами из 5' и 3'-участков EPgy2 (№6 и 7). Соответственно, синтезировались фрагменты размером ~ 2.5 и 0.5 т.п.о. В качестве примера приведена картина ПЦР для линии 1IIа (на рис. 31А дорожки 4, 6). Секвенирование показало, что фрагмент размером 2.5 т.п.о. соответствует межгенному участку, примыкающему к гену бтш70Ab (см. схему на рис. 31Б.) Таким образом, инсерция в линию 1IIа произошла в регуляторный район гена бтш70Аа.

ПЦР-анализ с праймерами из инвертированного повтора конструкции и из гена бтш70, направленными внутрь и наружу гена, показал, что ни в одном случае не произошло инсерций в кодирующую и 3'-фланкирующую области генов бтш70.

Результаты анализа трансгенных линий, полученных из US-4 и US-2, показали, что во всех случаях транспозиции EPgy2 происходят с переворотом по отношению к стартовому элементу (рис. 32), в промоторную область генов бтш70 между -28 и -240 п.о. выше старта транскрипции. Проведенный анализ выявил «горячие точки» встраиваний EPgy2: 59% всех инсерций для US-4 и 40% для US-2 происходят в одну и ту же область промотора -96 и -97 п.о. от старта транскрипции. Результаты по локализации инсерций EPgy2 в гены бтш70 трансгенных линий представлены в таблице 3.

Встраивание EPgy2 исключительно в 5'-область генов бтш70 можно объяснить свойствами Р элемента и особой организацией промоторной области генов теплового шока (Nacheva, 1989). Из литературы известно, что предпочтительным местом встраивания Р элемента являются регуляторные области генов (Spradling, 1995), преимущественно несколько сотен п.о. от старта транскрипции генов (Liao, 2000).

Промоторные районы генов бтш70 обладают рядом свойств, делающих их уязвимыми для инсерций: в них отсутствует нуклеосомная организация и хроматин находится в деконденсированном состоянии. «Горячие точки» встраивания EPgy2, нуклеотиды -96, -97 выше старта транскрипции генов бтш70, также располагаются в особой области промотора.

In vivo, ДНК промоторных областей бтш70 находится в связанном состоянии со многими белками (GAF, TBF и др.), поддерживающими «открытую» структуру хроматина. Белки GAF способны взаимодействовать друг с другом таким образом, что ДНК оборачивается вокруг нескольких GAF (Georgel, 2005), при этом определенные участки ДНК оказываются «открытыми». Нуклеотиды -96, -97 находятся в центре такого участка ДНК (с -80 по -111 п.о.), образованного GAF. Также известно, что Р элемент предпочтительно встраивается в районы ДНК с повышенным содержанием CG-пар (Liao, 2000). Нами был выявлен 8-нуклеотидный сайт дупликации в месте инсерций EPgy2: CGGCGCAC при транспозиции в положение -97 выше сайта инициации транскрипции и GGCGCACT при транспозиции в положение -96. Таким образом, предпочтительное встраивание EPgy2 в 5'-область бтш70 и наличие «горячих» сайтов инсерций можно объяснить совокупностью многих факторов.

Большинство инсерций EPgy2 в промоторные области единичны; мы зафиксировали лишь два случая двойного встраивания - в линиях б198I и 30IIb. В обоих случаях двойное встраивание выявлено по результатам Саузерн-гибридизации. Методами ПЦР и секвенирования полученных фрагментов было установлено, что в линии а198I произошли внедрения EPgy2 в разные места 5'-регуляторных районов генов бтш70 (-160 п.о. гена Аа и -96 гена Аb). В линии 30IIb инсерции были зафиксированы выше -96 п.о. от старта транскрипции генов бтш70 Аа и Ab.

Таблица. 3 Сводная таблица локализации сайтов инсерций EPgy2 в гены бтш70 трансгенных линий, выведенных из исходных линий US-4 и US-2 (б). Знаком * обозначены линии с перестройками геномной ДНК

Получение гомозиготной линии 30IIb давало возможность исследовать влияние большой вставки (20 т.п.о.) на морфологию пуфа, образующегося в локусе 87А. Особое расположение генов бтш70Aa и Ab в виде сближенных инвертированных копий важно для быстрого начала транскрипции этих генов в условиях ТШ, поэтому увеличение расстояния между генами может влиять на характер функционирования генов бтш70 и вызывать изменение морфологии пуфа. По результатам иммунофлуоресцентного окрашивания хромосом (совместно с С. Г. Георгиевой), было установлено, что при активации транскрипции генов ТШ происходит изменение структуры пуфа в локусе 87А линии 30IIb по сравнению с линией Oregon R. В контрольной линии две инвертированные копии гена бтш70, расположенные в локусе 87А, при ТШ образуют одиночный пуф, в линии 30IIb этот пуф становится двойным (рисунок не приводится), т.о. происходит физическое отдаление двух копий гена бтш70 локуса 87А друг от друга, что может затруднять координированную регуляцию транскрипции этих генов.

5.4. Влияние инсерций EPgy2 на уровень транскрипции бтш70. Инсерции МЭ могут по-разному влиять на экспрессию генов. Из экспериментальных работ (Lerman, 2003; Lerman, 2005; Michalak, 2001) известно, что в природе встречаются популяции Drosophila, содержащие инсерции МЭ в промоторных областях генов бтш70. Эти инсерции нарушают нормальное функционирование тех копий генов бтш70, в которые произошло встраивание. Представлялось интересным оценить влияние встраиваний EPgy2 в гены бтш70 на уровень транскрипции этих генов.

В результате проведенной Нозерн-гибридизации нами было зафиксировано снижение уровня синтеза тотальной мРНК бтш70 в гомозиготных трансгенных линиях 30IIb (двойное встраивание в гены Аа и Аb в положение -96), 134Ib (встраивание в положение -28 в район ТАТА-бокса), по сравнению с контрольной линией US-4.

Снижение уровня синтеза РНК в трансгенных линиях было подтверждено методом количественного ПЦР в реальном времени (quantitative real time PCR) с праймерами, позволяющими различить группу генов бтш70А и бтш70В (рис. 33). На рис. 33А приведена картина экспрессии генов бтш70А после 30 мин ТШ 37ОС и 30 мин восстановительного периода при температуре 25ОС, нормализованных относительно рибосомального гена rp49. Этот эксперимент позволил выявить зависимость снижения синтеза мРНК от места встраивания (рис. 33). У D. melanogaster в регуляторной области генов бтш70 содержится 4 копии HSE (Jachansan A., 1987). Мутации, затрагивающие HSE, или встраивания между этими элементами, особенно между HSE1 и HSE2, могут существенно снижать уровень транскрипции гена. Нами было показано, что при инсерции EPgy2 в район ТАТА-бокса (положение -28) уровень транскрипции двух генов локуса 87А, бтш70Аа и Ab, составляет лишь 44%, по сравнению с контрольной линией (уровень синтеза мРНК в линии US-4 принят за 100%); при инсерции в район -42 эти гены функционируют только на 51%; при двойном встраивании в положение -96 (линия 30IIb) - на 52%.

Согласно полученным данным, можно предположить, что при встраивании EPgy2 в ТАТА-бокс (положение -28) и в положение -42 (между ТАТА-боксом и HSE1) один из генов группы бтш70А перестает транскрибироваться; при двойном встраивании, вероятно, существенно нарушается транскрибирование обеих копий гена бтш70. При инсерциях в область -134 и -144 п.о. от старта транскрипции уровень синтеза РНК составляет, соответственно 81 и 97%. Таким образом, чем ближе к старту транскрипции происходит встраивание, тем существеннее снижение уровня синтеза РНК генов бтш70.

Рис. 33 А. Относительная экспрессия генов бтш70A (Aa и Ab) в трансгенных линиях (по оси ординат), определенная методом количественного ПЦР в реальном времени. В качестве контроля представлена линия US-4. РНК была выделена после ТШ (37ОС 30 мин) и последующего периода восстановления (25ОС 30 мин). Б. Уровень синтеза мРНК бтш70А у трансгенных линий относительно контрольной линии US-4 (принят за 100%). Цифрами указан нуклеотид относительно старта транскрипции гена бтш70, выше которого произошло встраивание

5.5. Анализ синтеза БТШ70 в трансгенных линиях. Влияние инсерций EPgy2 на уровень трансляции генов бтш70 в трансгенных линиях было оценено по результатам одномерного и двумерного электрофореза белков.

Количественная оценка накопления индуцибельного БТШ70 после ТШ была получена с помощью иммуноблоттинга с 7FB антителами. Результаты для некоторых трансгенных линий представлены на рис. 34. После ТШ 30 мин при температуре 37ОС в линиях 30IIb и134Ib наблюдается более низкий уровень индукции БТШ70 по сравнению с US-4. После получасового периода восстановления разница в уровне синтеза БТШ70 между линиями становится меньше.

Проведенный анализ показал снижение уровня трансляции бтш70, что согласуется с пониженным уровнем индукции мРНК бтш70 в трансгенных линиях, по сравнению с контрольной. Несмотря на снижение уровня синтеза мРНК и белка БТШ70, вследствие внедрения EPgy2, термоустойчивость трансгенных линий существенно не меняется.

5.6. Определение плодовитости потомства трансгенных линий. Инсерции мобильных элементов по-разному проявляются на уровне целого организма. Известно, что они могут влиять на одно из самых важных свойств всех живых существ - способность давать плодовитое потомство. Поскольку данное свойство является одним из главных факторов действия естественного отбора, представляло интерес оценить последствия внедрения EPgy2 на фертильность трансгенных линий. Эксперимент по оценке плодовитости потомства был проведен на гомозиготных трансгенных линиях (рис. 35).

В эксперимент были отобраны мухи, находящиеся на одной и той же стадии развития, четырех трансгенных линий 30IIb, 111IIa, 134Ib, 369I (c инсерциями EPgy2 соответственно в положения -96 генов бтш70 Aa и Ab; -97 бтш70Аа; -28 бтш70Аа; -144 бтш70Аа) и линии US-4 (контроль). Ставили серии индивидуальных скрещиваний (одна самка х два самца) и исследовали фертильность мух трех-, шести- и девятидневного возраста. Были проведены исследования репродуктивной способности самок в нестрессовых условиях (постоянное развитие при 25єС) и самок, перенесших тепловой шок (в этом случае девственные самки были подвергнуты ТШ при температуре 37єС в течение 30 мин и скрещены с нестрессированными самцами). Подсчет потомства проводился после вылупления всех куколок (рис. 35). Было показано, что у самок с инсерцией EPgy2 в промотор гена бтш70 после ТШ увеличивалось число потомков, а у контрольной линии - снижалось.

Рис. 35 Определение фертильности трансгенных линий. Столбиками обозначено число потомков трансгенных линий от индивидуальных скрещиваний после 4 - 6; 7 - 9; 10 - 12 дней после вылупления. Белые столбики - потомство от нестрессированных самок, темные от самок после ТШ. Для каждой линии было поставлено 12 независимых скрещиваний; проведен подсчет потомства и статистическая обработка

Таким образом, эти линии могут иметь преимущество в размножении в условиях незначительных температурных перепадов. В работе (Lerman et al., 2003) было обнаружено, что природные линии с инсерцией Р-элемента в промоторную область гена бтш70Ва, более плодовиты, чем линии без инсерций. В работе (Walser, 2006) обнаружили преимущественное встраивание Р-элемента в промоторную область именно генов теплового шока на примере 48 естественных популяций. Так как большинство генов бтш мультикопийно, то встраивание Р-элемента в отдельные промоторы генов бтш, и незначительное снижение уровня их экспрессии в условиях отсутствия резких перепадов температур может быть эволюционно выгодным. Дальнейший естественный отбор на термоустойчивость может приводить к появлению линий типа Termotolerance. Таким образом, МЭ, вероятно, играют важную роль в эволюции адаптации организмов к условиям их обитания.

Выводы:

1. Молекулярные механизмы адаптации к условиям обитания значительно различаются у разных организмов и связаны с уровнем БТШ70 в клетках при нормальных условиях и тепловом шоке. Экспрессия БТШ70 у разных видов может определяться:

а) регуляцией транскрипции,

б) числом копий гена бтш70,

в) встраиванием в промоторную область генов бтш70 мобильных элементов.

2. Основным молекулярным механизмом, обеспечивающим термоустойчивость пустынных видов ящериц, является повышенная экспрессия БТШ70 при нормальных условиях. У северных видов при нормальных условиях синтез БТШ70 отсутствует. Уровень БТШ70 у пустынных организмов претерпевает значительные колебания в течение суток, коррелируя с изменениями температуры окружающей среды и тела животного.

3. Повышенная экспрессия БТШ70 у термофильных ящериц контролируется на уровне транскрипции и обусловлена присутствием активной формы HSF, связанной с промотором в нормальных условиях.

4. На примере культур первичных фибробластов, полученных из кожи коренных жителей Туркменистана и России, впервые выявлены различия в термоустойчивости клеток у теплокровных.

5. На примере видов Drosophila выявлены сложные взаимоотношения между уровнем синтеза БТШ и термотолерантностью. Показана положительная корреляция между уровнем синтеза БТШ70 и термоустойчивостью у различных географических линий и видов Drosophila группы virilis, однако при сравнении видов, принадлежащих к разным группам рода Drosophila, такой корреляции не наблюдается.

6. Показано наличие индивидуального спектра изоформ БТШ70 у всех изученных линий и видов Drosophila. Показано, что у термоустойчивых видов более интенсивно экспрессируются низкомолекулярные БТШ и БТШ40, по сравнению с термочувствительными, при жестком температурном воздействии.

7. Подробно изучена структура и функционирование системы генов ТШ у нескольких видов Drosophila группы virilis:

а) обнаружены различия как в строении самого кластера генов, так и в числе генов бтш70 у видов и линий данной группы. Показано, что линии термофильного южного вида D. virilis имеют больше копий бтш70, чем линии северного филогенетически близкого вида D. lummei, что может иметь адаптивное значение;

б) у всех копий генов бтш70 видов группы virilis в 3'-фланкирующей последовательности обнаружен древний МЭ SGM. На основании этих результатов предложена модель, объясняющая адаптивные изменения числа копий генов бтш70 у видов группы D. virilis.

8. Промоторная область генов бтш70 D. melanogaster имеет особую структуру, которая определяет преимущественное встраивание Р элемента в определенные участки промотора. Показано, что МЭ играют важную роль в функционировании и эволюции генов бтш70 у различных видов рода Drosophila.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Lyashko VN, Vikulova VK, Chernicov VG, Ivanov VI, Ulmasov KA, Zatsepina OG, Evgen'ev MB. Comparison of the heat shock response in ethnically and ecologically different human populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91 (26): 12492 - 5.

2. Ульмасов Х.А., Зацепина О.Г., Рыбцов С.А., Джумагельдыев Б.Т., Евгеньев М.Б. Некоторые аспекты состояния компонентов системы теплового шока у ящериц различных экологических ниш. Известия АН. Серия биологическая. 1997. 2: 133 - 44.

3. Ulmasov KA, Zatsepina OG, Molodtsov VB, Evgen'ev MB. Natural body temperature and kinetics of heat-shock protein synthesis in the toad-headed agamid lizard Phrynocephalus interscapularis. Amphibia-Reptilia. 1999. 20: 1 - 9.

4. Zatsepina OG, Ulmasov KA, Beresten SF, Molodtsov VB, Rybtsov SA, Evgen'ev MB. Thermotolerant desert lizards characteristically differ in terms of heat-shock system regulation. J. Exp. Biol. 2000. 203 (6): 1017 - 25.

5. Zatsepina OG, Velikodvorskaia VV, Molodtsov VB, Garbuz D, Lerman DN, Bettencourt BR, Feder ME and Evgenev MB. A Drosophila melanogaster strain from sub-equatorial Africa has exceptional thermotolerance but decreased Hsp70 expression. The J. Exp. Biol. 2001. 204: 1869 - 81.

6. Молодцов В. Б., Великодворская В. В., Гарбуз Д. Г, Зацепина О. Г., Евгеньев М. Б. Анализ экспрессии белков теплового шока и терморезистентной линии Drosophila melanogaster. Известия Академии наук, Серия биологическая, 2001. 5: 522 - 32.

7. Гарбуз Д. Г., Молодцов В. Б., Великодворская В. В., Зацепина О. Г., Евгеньев М. Б. Эволюция ответа на тепловой шок внутри рода Drosophila. Генетика, 2002. 38 (8): 1097 - 109.

8. Garbuz DG, Zatsepina OG, Feder ME, Evgen'ev MB. Evolution of termotolerance and the heat-shock response: evidence from inter/intra specific comparison and interspecific hybridization in the Drosophila virilis species group. I/ Thermal phenotype. J. Exp. Biol. 2003. 206: 2399 - 408.

9. Michael B. Evgen'ev, Martin E. Feder, David Garbuz, Daniel Lerman, Vera Velikodvorskaia and Olga G. Zatsepina. Evolution of Thermotolerance and Heat-Shock Response in the virilis Species Group of Drosophila. Biology International. 2004. 46: 49 - 51.

10. Evgenev MB, Zatsepina OG, Garbuz DG, Lerman DN, Velikodvorskaia VV, Zelentsova ES, Feder ME. Evolution and arrangement of the hsp70 gene cluster in two closely related species of the virilis group of Drosophila. Chromosoma. 2004. 113 (5): 223 - 32.

11. Zatsepina OG, Garbuz DG, Shilova V, Karavanov AA, Tornatore P, Evgen'ev MB. Use of surface-enhanced laser desorption ionization - time-of-flight to identify heat shock protein 70 isoforms in closely related species of the virilis group of Drosophila. Cell Stress and Chaperones. 2005. 10 (1): 12 - 6.

12. Евгеньев М. Б., Гарбуз Д. Г., Зацепина О. Г. Белки теплового шока: функции и роль в адаптации к гипертермии. Онтогенез. 2005. 36 (4): 267 - 75.

13. Шилова В. Ю., Гарбуз Д. Г., Евгеньев М. Б., Зацепина О. Г.. Низкомолекулярные белки теплового шока и адаптация к гипертермии у видов Drosophila. Молекулярная биология. 2006. 40 (2): 271 - 6.

14. Victoria Y. Shilova, David G. Garbuz, Elena N. Myasniankina, Bing Chen, Michael B. Evgen'ev, Martin E. Feder, and Olga G. Zatsepina. Remarkable Site Specificity of Local Transposition into the hsp70 Promoter of Drosophila melanogaster. Genetics. 2006. 173: 809 - 20.

15. M. B. Evgen'ev, D. G. Garbuz, V.Y. Shilova and O. G. Zatsepina. Molecular mechanisms underlying thermal adaptation of xeric animals. J. Biosci. 2007. 32 (3): 489 - 99.

16. Savvateeva-Popova E, Popov A, Grossman A, Nikitina E, Medvedeva A, Peresleni A, Korochkin L, Moe JG, Davidowitz E, Pyatkov K, Myasnyankina E, Zatsepina O, Schostak N, Zelentsova E, Evgen'ev M. Pathogenic chaperone-like RNA induces congophilic aggregates and facilitates neurodegeneration in Drosophila. Cell Stress Chaperones. 2007. 12 (1): 9 - 19.

17. В. Ю. Шилова, Д. Г. Гарбуз, Е. Н. Мяснянкина, М. Б. Евгеньев, Е. С. Зеленцова, О. Г. Зацепина. Качественный и количественный анализ транспозиций генетической конструкции на основе Р элемента в область генов бтш70 Drosophila melanogaster. Генетика, 2007. 43 (12): 1333 - 43.

18. Bing Сhen, V. Yu. Shilova, O. G. Zatsepina, M. B. Evgen'ev, M. E. Feder. Location of P element insertions in the proximal promoter region of Hsp70A is consequential for gene expression and fecundity in Drosophila melanogaster. Cell Stress Chaperones. 2008. 13 (1): 11 - 7.

19. Д.Г. Гарбуз, И.А. Юшенова, М.Б. Евгеньев, О.Г. Зацепина. Сравнительный анализ структуры кластера генов hsp70 у видов Drosophila группы virilis. Молекулярная биология. 2009. 43 (1): 44 - 52.

Размещено на Allbest.ru