Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека

№ п/п	ПАТ	Взаимодействие ПАТ с ВМ и рекомбинантными белками в ИБ	Титры рекомбинантных белков при специфическом взаимодействии с ПАТ (обратные величины) в ТИФА
		ВМ	рек. GP	рек. NP	рек. VP40	рек. VP35	рек. VP24	рек. GP	рек. NP	рек. VP40	рек. VP35	рек. VP24
1	ЧС (1/500)	+	-	+	+	+	+	800	12800	8100	8100	6400
2	IgG лошади (1/1500)	+	-	+	+	+	+	1600	72900	40500	13500	1600
3	МАС-ВМ №2 (1/1000)	+	+	+	+	+	+	900	24300	8100	8100	1600
4	МАС-рек. GP (1/1000)	+	+	-	-	-	-	72900	<100	<100	<100	<100
5	МАС-рек. NP (1/5000)	+	-	+	-	-	-	<100	218700	<100	<100	<100
6	МАС-рек. VP35 (1/5000)	+	-	-	-	+	-	<100	<100	656100	<100	<100
7	МАС-рек. VP40 (1/10000)	+	-	-	+	-	-	<100	<100	<100	1087500	<100
8	МАС-рек. VP24 (1/5000)	+	-	-	-	-	+	<100	<100	<100	<100	202400

Примечания: ПАТ - поликлональные антитела иммунных сывороток; r - рек. белок;

ЧС - сыворотка человека, переболевшего ГЛМ (разведение);

МАС-ВМ №2 - пул сывороток от 3 мышей, иммунизированных АГ ВМ и используемых для гибридизации на 21-е сутки от начала иммунизации в разведении;

МАС-рек. - сыворотки мышей, иммунизированных рек. белками GP, NP, VP40, VP35, VP24 ВМ.

Таблица 5

Исследование антигенных и иммуногенных свойств рекомбинантных белков вируса Эбола

Источник антител	Титры специфических антител (обратные величины) и взаимодействие в ИБ
	Антигены (концентрация для ТИФА 1 мкг/мл )
	Инактивиро-ванный ВЭ	рек.VP35	рек.VP40	рек.NP	рQE
	ИФА	ИБ	ИФА	ИБ	ИФА	ИБ	ИФА	ИБ	ИФА	ИБ
IgG лошади - ВЭ	656100	+	121500	+	656100	+	656100	+	<100	-
МАС - ВЭ	218700	+	218700	+	218700	+	656100	+	<100	-
АС крысы - ВЭ	218700	+	24300	+	218700	+	218700	+	<100	-
АС кролика - ВЭ	218700	+	218700	+	218700	+	656100	+	<100	-
МАС - рек. VP35	729000	+	729000	+	<100	-	<100	-	<100	-
МАС - рек. VP40	656100	+	<100	-	1968300	+	<100	-	<100	-
МАС - рек. NP - ВЭ	656100	+	<100	-	<100	-	1968300	+	<100	-
отрицательные контроли**	<100	-	<100	-	<100	-	<100	-	<100	-

Примечание: МАС - мышиные антисыворотки;

рQE - лизат E.coli (отрицательный контроль для рек. белков);

* - проводили обработку (истощение) исследуемых моноспецифических МАС в присутствии 1%-го раствора лизата E.coli клеток 20 мин при 37⁰С;

** - в качестве отрицательного контроля использовали нормальные сыворотки лошади, мыши, крысы и кролика.

Изучение возможности использования инактивированного вируса Марбург и рекомбинантных белков для выявления специфических иммуноглобулинов класса IgG в сыворотках крови животных и человека

Описанные выше исследования рек. белков - GP, NP, VP35, VP40 и VP24 ВМ показали сходство их антигенных свойств с природными вирусными белками, что указывает на возможность использования данных препаратов в тест-системах для выявления специфических АТ.

Для анализа уровня АТ к каждому вирусному белку использовали в качестве АГ отдельные рек. белки. Это позволило определить уровень и спектр АТ к отдельным белкам ВМ (табл. 6). Наиболее высокая концентрация специфических АТ в сыворотке крови реконвалесцента была зарегистрирована к NP (1/24300) и, по убывающей, к VP40 (1/8100) и к VP35 (1/2700). Уровень специфических АТ к GP был ниже, чем к другим белкам и вообще не определялся в сыворотке, взятой у пациента через шесть лет после болезни. Такая же тенденция, по уровню АТ к индивидуальным белкам, была обнаружена и для АТ в сыворотках крови иммунизированных животных.

В случае применения в качестве АГ комбинации четырех рек. белков ВМ - GP, NP, VP35 и VP40, повышался уровень титров выявления специфических АТ исследуемых сывороток по сравнению с использованием инактивированного АГ ВМ.

Таблица 6

Использование рекомбинантных белков в качестве антигена в ТИФА для выявления IgG, специфичных к вирусу Марбург

Источник антител	Титры специфических IgG (обратные величины)
	Антигены (концентрация нг/лунку)
	вирус Марбург (200)	рек.GP (200)	рек.NP (200)	рек.VP40 (200)	рек.VP35 (200)	рек. Белки (400)***	рQE (400)
ЧС (1990 г.)	24300	900	24300	8100	2700	24300	<100
ЧС (1996 г.)	200	<100	400	400	<100	800	<100
IgG лошади	218700	13500	121500	40500	13500	364500	<100
МАС-ВМ №1	8100	<100	2700	2700	<100	8100	<100
МАС-ВМ №2	24300	900	24300	24300	8100	72900	<100
МАС-рек.GP*	8100	656100	<100	<100	<100	72900	<100
МАС-рек.NP*	72900	<100	72900	<100	<100	24300	<100
МАС-рек.VP35*	24300	<100	<100	<100	656100	218700	<100
МАС-рек.VP40*	72900	<100	<100	1968300	<100	218700	<100
отрицательные контроли**	<100	<100	<100	<100	<100	<100	<100

Примечание: ЧС - сыворотка человека, переболевшего ГЛМ (в скобках указана дата забора крови);

МАС - мышиные антисыворотки;

рQE - лизат E.coli (отрицательный контроль для рек. белков);

* - проводили обработку (истощение) исследуемых моноспецифических МАС в присутствии 1%-го раствора лизата E.coli клеток 20 мин при 37 ⁰С;

** - в качестве отрицательного контроля использовали нормальные сыворотки человека (5 сывороток), лошади (1 сыворотка), мыши (5 сывороток);

*** - смесь рек. белков GP, NP, VP35, VP40 по 100 нг/лунку каждого.

Изучение антигенных свойств рекомбинантных белков вируса Марбург с помощью панели МКА

По исследованию рек. белков ВМ имеется два сообщения - об использовании рек. NP, экспрессированного в виде полноразмерных копий в бакуловирусной системе и в виде С-концевых фрагментов в E.coli, для выявления противовирусных АТ в сыворотках крови реконвалесцентов людей (M. Saijo et al., 2001) и о получении МКА, специфичных к этому рек. белку и выявляющих вирусный АГ в реакции иммунофлюоресценции (M. Saijo et al., 2005). Для изучения рек. белков NP, VP35, VP40 ВМ, получили панель гибридомных МКА, специфичных к гомологичным вирусным белкам. Панель содержит - 3 вида МКА к NP, 3 вида МКА к белку VP35 и 9 видов МКА к VP40 (табл. 7). Для одного вида МКА 3А5 белок-мишень в ИБ не определялся, хотя он имел высокий титр в ТИФА, видимо эпитопы для этого вида МКА имеют конформационную структуру.

Специфическое взаимодействие МКА с рек. белками ВМ оценивали в ТИФА и ИБ. Как видно из представленных данных (см. табл. 7), большинство МКА активно взаимодействовали с рек. белками - аналогами вирусных белков в ТИФА. Специфическое взаимодействие рек. белков с МКА в ИБ для примера представлено на рис. 5-7. Так же было показано, что МКА, специфичные к ВМ, не имеют перекрестного взаимодействия с рек. белками гетерологичного ВЭ в ИБ и ТИФА, в отличие от данных по перекрестному взаимодействию противовирусных ПАТ с гетерологичными вирусными белками, как это было показано ранее (см. табл. 3).

Размещено на http://www.Allbest.ru/

Размещено на http://www.Allbest.ru/

Рис. 5. Иммуноблоттинг рекомбинантных белков NP вируса Марбург с МКА, специфичными к вирусному нуклеопротеину

Цельная мембрана, содержащая:

1 - лизат клеток 293 (отрицательный контроль);

2 - лизат клеток 293, инфицированных vTF7-3 (отрицательный контроль);

3 - инактивированный ВМ;

4 - рек. NP, экспрессированный в эукариотических клетках 293;

5 - рек. NP, экспрессированный в прокариотических клетках E.coli;

6 - лизат клеток E.coli (отрицательный контроль);

обработана смесью МКА 5F1, 5H7 и 9С7 в разведении 1/1000 каждого.

Рис. 6. Иммуноблоттинг рекомбинантного белка VP40 с МКА, специфичными к матриксному вируса Марбург, обработан МКА 7Н10 (положительный контроль);

2 - препарат ВМ, обработан МКА 7D8 (положительный контроль);

3 - рек. белок VP40, обработан МКА 7Н10;

4 - рек. белок VP40, обработан МКА 7D8;

5 - препарат ВЭ, обработан МКА 7Н10 (отрицательный контроль);

6 - препарат ВЭ, обработан МКА 7D8 (отрицательный контроль);

7 - лизат E.coli, обработан МКА 7Н10 (отрицательный контроль);

8 - лизат E.coli, обработан МКА 7D8 (отрицательный контроль); МКА использовали в разведении (1/500).

Таблица 7

Анализ специфичности рекомбинантных белков вируса Марбург

№ п/п	Название МКА	Иммуноген	Вирусный белок-мишень в ИБ	Взаимодействие с рек. белком-аналогом в ИБ	Титры антител в ТИФА с вирусными антигенами и рекомбинантными аналогами
					вирус Марбург	рек. NP - ВМ	рек. VP40-ВМ	рек. VP35-ВМ
1	3F9	ВМ	VP35	+	656100	-	-	729000
2	9D8	ВМ	VP35	+	729000	-	-	656100
3	8G3	ВМ	VP35	-	218700	-	-	72900
4	5G9	ВМ	VP40	+	729000	-	72900	-
5	7H10	ВМ	VP40	+	729000	-	729000	-
6	9G6	ВМ	VP40	+	218700	-	218700	-
7	6B7	ВМ	VP40	+	656100	-	656100	-
8	1C12	ВМ	VP40	+	24300	-	24300	-
9	10E11	ВМ	VP40	+	24300	-	24300	-
10	7D8	ВМ	VP40	+	2187000	-	243000	-
11	5G8	ВМ	VP40	+	656100	-	656100	-
12	7С4	ВМ	VP40	+	2187000	-	729000	-
13	5F11	ВМ	NP	+	2187000	24300	-	-
14	9C7	ВМ	NP	+	6561000	6561000	-	-
15	5H7	ВМ	NP	+	2187000	2187000	-	-
16	3A5	ВМ	NP (?)	-	218700	-	-	-

Примечания: для иммунизации мышей-доноров иммунных спленоцитов был использован инактивированный ВМ; NP (?) - белок - мишень не определяется этим видом МКА в ИБ и не взаимодействует с рек. белком, но по результатам КИФА имеет сродство к NP ВМ (Е.И. Казачинская, 2002); + есть реакция в данном методе; - нет реакции в данном методе; 100 нг/лунка - концентрация антигенов.

Изучение антигенных свойств рекомбинантных белков вируса Эбола с помощью МКА

Рек. белки VP35, NP и VP40 ВЭбыли исследованы с помощью панели гибридомных МКА, специфичных к гомологичным вирусным белкам. Специфическое взаимодействие МКА с рек. белками VP35, NP и VP40 ВЭ оценивали в ТИФА и ИБ (табл. 8). Специфическое взаимодействие рек. белков NP и VP40 ВЭ с МКА в ИБ для примера представлено на рис. 8, 9.

Рис. 7. Иммуноблоттинг с вирусных и рекомбинантных белков VP35 вируса Марбург с моноклональными антителами

1 - препарат ВМ (10 мкл), стрелкой обозначен вирусный белок VP35;

2 - препарат ВЭ (отрицательный контроль на антиген);

3 - лизат E.coli. (отрицательный котроль для рек. белка);

4 - очищенный рек. белок VP35 ВМ (10 мкл) обозначен стрелкой; все полоски мебраны обработаны препаратом очищенных МКА 3F9 в разведении 1/500;

5 - значения молекулярной массы белковых маркеров.

Было выявлено, что МКА, специфичные к ВЭ, не имели перекрестного взаимодействия с рек. белками ВМ в ИБ и ТИФА, в отличие от перекрестного взаимодействия ПАТ с вирусными белками, как это было показано ранее (см. табл. 3).

Так как вирусные белки, с которыми взаимодействовали АТ, выявляли методом ИБ, это позволо предположить, что данные эпитопы являются конформационно стабильными и, видимо, представлены “линейной” структурой как на вирусных белках, так и на их рек. аналогах. Для того чтобы выяснить, существуют ли подобные антигенные структуры на белках вириона исследовали взаимодействие МКА с инфекционным вирусным препаратом в ТИФА в условиях 4 уровня биозащиты (табл. 9). Результаты проведенного анализа демонстрируют наличие исследуемых эпитопов на белках VP35 и NP очищенных вирионов ВЭ и сохранность этих эпитопов после инактивации. Высокая специфичность взаимодействия АТ иммунной сыворотки против рек.VP35 ВЭ с очищенными инфекционными вирионами, подчеркивает подобие эпитопов рек. белка и природного VP35 ВЭ.

До начала исследований всей панели МКА методом двухцентрового ИФА в формате “сэндвич” для выявления не конкурирующих за антигенные эпитопы МКА, пригодных для конструирования тест-ситемы по выявлению филовирусных АГ, пара МКА (4А8 и 6F7 из первой коллекции), были использованы при разработке метода экспресс-выявления антигена ВЭ (А.А. Чепурнов и др., 2007). Основой тест-системы служит нитроцеллюлозная мембрана с нанесенными на нее МКА 4А8 (в концентрации 0,1 мг/мл) для захвата антигена. МКА 6F7, сорбционно связанные с коллоидным золотом, служили детектирующими. Было показано выявление АГ ВЭ на вторые сутки после инфицирования в сыворотке крови сотрудника, фатально заболевшего при лабораторной аварии. Чувствительность выявления вирусного АГ составила 3 нг/мл, при титре вирусемии в сыворотке крови 10⁵ БОЕ/мл. Эти данные служат достаточным основанием использования МКА, которые строго специфичны к внутренним вирусным белкам NP, VP40 и VP35 ВЭ и не имеют перекрестной активности c гетерологичным АГ, для разработки ИФА тест-систем для выявления АГ ВЭ.

Таблица 8

Анализ специфичности рекомбинантных белков вируса Эбола

№ п/п	Название МКА	Специфичность (вирус)	Белок-мишень	Взаимодействие с рек. белком-аналогом в ИБ	Титры антител в ТИФА с вирусными антигенами и рекомбинатными аналогами
					вирус Эбола	рек. VP35-ВЭ	рек. NP - ВЭ	рек. VP40-ВЭ
1	1C7	ВЭ-IS	VP35	+	2187000	729000	<100	<100
2	6F7	ВЭ -IS	VP35	+	729000	218700	<100	<100
3	1B2	ВЭ-IS	NP	+	2187000	<100	2187000	<100
4	7B11*	ВЭ-IS	NP	+	512000	<100	656100	<100
5	1E5	ВЭ-IS	NP	+	218700	<100	243000	<100
6	4B9	ВЭ-IS	NP	+	656100	<100	2187000	<100
7	9A7	ВЭ-IS	NP	+	24300	<100	72900	<100
8	4А8	ВЭ-IS	NP	+	2187000	<100	121500	<100
9	10В4	ВЭ-IS	NP	+	2187000	<100	729000	<100
10	6G8	ВЭ-IS	NP	+	24300	<100	243000	<100
11	6A8	ВЭ-IS	NP	+	72900	<100	40500	<100
12	10A8	ВЭ-IS	NP	+	218700	<100	218700	<100
13	1C1	ВЭ-8МС	VP40	+	6561000	<100	<100	6561000
14	4A2	ВЭ-IS	VP40	+	6561000	<100	<100	6561000
15	1E6	ВЭ-8МС	VP40	+	72900	<100	<100	656100
16	3D9	ВЭ-8МС	VP40	+	729000	<100	<100	218700
17	1B5	ВЭ-8МС	VP40	+	72900	<100	<100	656100
18	5С10	ВЭ-IS	VP40	+	24300	<100	<100	13500
19	2E12	ВЭ-IS	VP40	+	24300	<100	<100	24300

Примечания: ВЭ-IS - исходный штамм ВЭ-Заир; 8МС - штамм ВЭ-Заир, адаптированный к морским свинкам, на 8 пассаже вызвал гибель животных (V.E. Volchkov et al., 2000) МКА 7B11* - продукт секреции гибридомы крысиного происхождения (автор гибридомы А.В.Перебоев); + есть реакции в данном методе; 100 нг/лунка - концентрация антигенов.

Рис. 8. Иммуноблоттинг. Выявление вирусного белка VP35 в составе вирусного препарата ПАТ мышиной моносыворотки, специфичной к рек. белку VP35 ВЭ

1 - очищенный препарат ВЭ обработан моносывороткой к рек.VP35;

2 - рек. белок VP35 обработан нормальной АС мыши (отрицательный контроль);

3 - рек. белок VP35 обработан моносывороткой к рек.VP35 (положительный контроль); антитела использовали в разведении (1/3000).

Рис. 9. Иммуноблоттинг. Взаимодействие МКА, специфичных к вирусному белку VP40 с рекомбинантным белком-аналогом вируса Эбола

1 - препарат ВЭ, обработан МКА 4А2;

2 - препарат ВЭ, обработан МКА 1С1;

3 - рек. белок VP40, обработан МКА 4А2;

4 - рек. белок VP40, обработан МКА 1С1;

5 - препарат ВМ, обработан МКА 4А2 (отриц. контроль);

6 - препарат ВМ, обработан МКА 1С1 (отриц. контроль);

7 - лизат E.coli., обработан МКА 4А2 (отриц. контроль);

8 - лизат E.coli., обработан МКА 1С1 (отриц. контроль);

МКА использовали в разведении (1/10000).

Рис. 10. Иммуноблоттинг. Взаимодействие МКА, специфичных к вирусному нуклеопротеину вируса Эбола с рекомбинантным белком

1 - препарат ВЭ, обработан МКА 1В2;

2 - препарат ВЭ, обработан МКА 7В11;

3 - рек. NP, обработан МКА 1В2;

4 - рек. NP, обработан МКА 7В11;

5 - препарат ВМ, обработан МКА 1В2 (отриц. контроль);

6 - препарат ВМ, обработан МКА 7В11 (отриц. контроль);

7 - лизат E.coli, обработан МКА 1В2 в разведении 1/500 (отриц. контроль);

8 - лизат E.coli, обработан МКА7В11 в разведении (отриц. контроль); МКА использовали в разведении (1/500).

Таблица 9

Взаимодействие МКА, специфичных к инактивированному вирусу Эбола с нативными вирионными белками

Источник антител	Титр антител
	Очищенный ВЭ* (до инактивации)	Инактивированный ВЭ**
МКА 1С7 - VP35	н.о.	2187000
МКА 6F7 - VP35	н.о.	729000
Cмесь МКА к VP35 (1С7+6F7)	1562500	312500
МАС - рек.VP35	3125000	729000
Cмесь МКА к NP (10А8 + 4B9+10В4+1Е5+6А8)	3125000	3125000
МКА 10А8	н.о.	218700
4В9	н.о.	656100
10В4	н.о.	2187000
1Е5	н.о.	218700
6А8	н.о.	72900

Примечания: Данный эксперимент провел доктор А.А. Чепурнов в условиях 4 уровня биозащиты; МАС - рек.VP35 - сыворотка мыши, иммунизированной рек. белком VP35 ВЭ; ВЭ* - инфекционный вирусный препарат; ВЭ** - вирусный АГ инактивирован 1%-ным раствором SDS; сорбция антигенов в концентрации 100 нг/лунку; н.о - не определяли.

Отбор парных МКА не конкурирующих за антигенные эпитопы вирусных и рекомбинантных белков вируса Марбург и Эбола

Метод ИФА в формате “сэндвич” с ПАТ применяли при разработке лабораторных ИФА тест-систем для выявления ВМ в работах (А.С. Владыко и др., 1991; Н.В. Кизимов, 1993). В одной работе описаны МКА, специфичные к GP, которые были использованы в качестве “индикаторных” для выявления вирусного АГ (С.В. Ручко и др., 2001), а в другой (M. Saijo et al., 2005) для “захвата” АГ использовали МКА, специфичные к определенным перекрывающимся эпитопам (634-647 а.о. и 643-695 а.о.) рек. NP ВМ.

При разработке первых лабораторных ИФА тест-систем для выявления АГ ВЭ применяли метод ИФА в формате “сэндвич” в основном с ПАТ разных видов животных (Н.В. Мерзликин и др., 1995; T.G. Кsiazek et al., 1992) или сочетано с МКА, специфичными к вирусному белку VP40 (G. Kallstrom et al., 2005) или рек. NP (M. Niikura et al., 2001).

В недавней работе зарубежных исследователей показано практическое применение двух видов МКА, специфичных к матриксному белку VP40, при исследовании проб сывороток крови, мочи, слюны и пота людей, собранных при вспышке ГЛЭ в Республике Конго в 2003 г. (A. Lucht et al., 2007). Принцип метода иммунофильтрации состоит в “сэндвиче” из МКА, один вид которых нанесен на матрицу колонки с открытым сужающимся дном, что обеспечивает хорошую промывку.

Второй вид МКА, меченных биотином, реагирует с конъюгатом стрептовидина и пероксидазы. Иммунохимическую реакцию АТ с АГ проявляли раствором ТМБ. Для учета ОП реакции используют портативный фотометр или учитывают результат визуально. Данный метод для выявления вирусного АГ пригоден для полевых испытаний без использования электричества и дорогого оборудования. Время проведения анализа составляет 30 минут. Чувствительность выявления нативного вирусного АГ составила 10⁵ БОЕ/мл.

Инактивация исследуемых проб с 1% SDS, повышашало чувствительность системы до 10⁴ БОЕ/мл.

Создание представительной панели МКА, специфичных к трем филовирусным белкам - NP, VP40 и VP35, позволило использовать метод двухцентрового ИФА в формате “сэндвич” для выявления МКА, не конкурирующих за антигенные эпитопы, то есть способных эффективно “захватывать” вирусный или рек. АГ из исследуемой пробы.

МКА, имеющие высокий титр в ТИФА в виде культуральной жидкости от гибридных культур клеток, наработали in vivo. Асцитические жидкости очищали каприловой кислотой (H. Bazin et al., 1990) с последующим высаливанием 50%-ным раствором сульфата аммония и оценивали степень чистоты полученных препаратов МКА в ЭФ.

На рисунке 11, для примера, представлены несколько из использованных в исследовании очищенных МКА. Данный метод позволяет получать очищенные МКА с четко выраженными на электрофореграмме тяжелыми (на уровне 50-55 кДа) и легкими (20-25 кДа) цепями IgG.

Хорошая очистка МКА важна для исключения неспецифического фона при иммунохимических взаимодействиях, для сорбции на полистироловую поверхность планшетов большего количества IgG, несущих специфические паратопы для АГ и приготовления универсальных конъюгатов с ферментами.

Рис. 11. Электрофореграмма МКА, очищенных каприловой кислотой

1 - белковые маркеры молекулярной массы (10 мкл), (Bio-Rad);

2, 3 4 - препараты очищенных мышиных МКА 3F9, 7D8, 7H10, специфичные к ВМ (по 1 мкл);

5, 6, 7 - препараты очищенных мышиных МКА 1C1, 4A2, 1В2, специфичные к ВЭ (по 1 мкл); стрелками обозначены цепи IgG.

Методом двухцентрового ИФА в формате “сэндвич” было исследовано 16 видов МКА, специфичных к белкам. На их основе было сформировано 224 сочетания пар МКА. Из 74 пар МКА, выявляющих инактивированный АГ ВМ (при ОП субстратно-индикаторной смеси в тестируемых лунках >1,0) - 15 пар МКА выявляли рек. белки: 11 пар выявляли рек. VP40 и 4 пары - рек.VP35 (табл. 10).

Так же был исследован 21 вид МКА, специфичных к белкам ВЭ - два к VP35; девять к VP40; десять к нуклеопротеину. Из них было сформировано 399 различных сочетаний пар МКА. Инактивированный антиген ВЭ удовлетворительно выявляли 115 пар МКА (при ОП субстратно-индикаторной смеси в тестируемых лунках >1,0), из них 29 пар МКА выявляли рек. белки: 17 пар выявляли рек.VP40 и 14 пар - рек.NP (см. табл. 10).

Интересен был факт выявления инактивированных АГ парами МКА, специфичных к разным вирусным белкам. Эти данные предполагают высокое белок - белковое взаимодействие вирусных протеинов в вирионе, несмотря на жесткую инактивацию. По литературным данным, при исследовании структуры филовирусов методом электронной микроскопии было зафиксировано, что NP и VP40 ВЭ-Заир тесно связаны в течение вирусного морфогенеза, что является важной деталью при постановке диагноза филовирусных заболеваний (T.W. Geibert et al., 1995). При исследовании вклада филовирусных белков в формирование вирусоподобных частиц (VLPs) было показано, что NP ВЭ самостоятельно, без помощи VP40, не выходит из клеток и поэтому была предположена важная связь между этими белками (J. Licata et al., 2004).

Использование рек. белков позволяет более точно определять чувствительность выявления индивидуальных АГ. Так, по литературным данным, очищенный АГ ВЭ выявляли парой МКА, специфичных к белку VP40, до концентрации 1-2 нг/мл, что соответствовало инфекционному титру 10³-10⁴ БОЕ/мл (A. Luch et al., 2003). При использовании МКА для “захвата” АГ была показана чувствительность выявления рек. VP40 ВЭ в концентрации 2 нг/100 мкл (G. Kalstrom et al., 2005) и рек. NP в концентрации 30 нг/100 мкл (M. Niikura et al., 2001).

В данном исследовании чувствительность выявления рек. АГ разными парами МКА находилась в диапазоне концентраций от 150 до 1 нг/мл). Были выбраны четыре пары МКА, которые наиболее эффективно выявляли как очищенные вирусные АГ, так и рек. белки с чувствительностью 1 нг/мл. Это пара МКА 1В2 и 7В11, специфичные к NP ВЭ (рис. 12) и пара МКА 4А2 и 1С1, специфичные к белку VP40 ВЭ (рис. 13). Для белка VP40 ВМ это пара МКА очищенных 7D8 и меченных биотином 7H10 (рис. 14).

МКА 3F9, специфичные белку к VP35, можно одновременно эффективно использовать как в качестве “захватывающих” АГ, так и в качестве меченных биотином МКА для выявления АГ VP35 ВМ (рис. 15). В двух известных коллекциях мышиных гибридом, продуцирующих МКА к ВМ, штамм Musoke (M. Hevey et al., 1997) и штамм Рорр (С.В. Ручко и др., 2001), отсутствуют гибридомы, продуцирующие МКА к белку VP35. Это делает МКА 3F9, специфичные к VP35 ВМ особенно перспективными для дальнейшего практического использования.

Выбранные пары МКА строго специфичны к внутренним структурным вирусным белкам NP, VP40 и VP35 филовирусов, не имеют перекрестной реактивности с гетерологичными вирусными и рек. АГ. Кроме того, по результатам двухцентрового ИФА все эти 7 видов МКА, специфичные к структурным внутренним филовирусным белкам NP, VP40 и VP35, конкурируют с IgG лошадей, иммунизированных инфекциоными вирусами, за антигенные эпитопы вирусных и рек. белков. В связи с этим, показана ценность препаратов МКА при использовании их в качестве диагностических реагентов для выявления маркеров филовирусов.

Исследование иммунохимических свойств рек. белков NP, VP40 и VP35, полученных в результате экспрессии полноразмерных генов NP, VP35 и VP40 в клетках E.coli методами ИФА и ИБ, показало, что они антигенно схожи с нативными вирусными АГ и могут быть успешно применены для конструирования иммунодиагностических тест-систем в качестве положительного контроля на антиген.

Таблица 10

Данные по количеству пар МКА, исследованных в двухцентровом ИФА формата “сэндвич” для выявления антигенов вирусов Марбург и Эбола

Общее количество исследованных видов МКА	Количество исследованных сочетаний пар	Количество пар МКА, выявляющих инактивированный АГ	Количество пар МКА, выявляющих рекомбинантный VP40 ВМ (совпадающих по выявлению АГ ВМ)	Количество пар МКА, выявляющих рекомбинантный VP35 ВМ (совпадающих по выявлению АГ ВМ)	Количество пар МКА, выявляющих рекомбинантный VP40 ВЭ (совпадающих по выявлению АГ ВЭ)	Количество пар МКА, выявляющих рекомбинантный NP ВЭ (совпадающих по выявлению АГ ВЭ)
Из 16 видов МКА, специфичных к вирусу Марбург: 3 - к белку VP35; 9 - к белку VP40; 3 - к NP; 1 - NP (?)	224	74	33 (11)	5 (4)	-	-
Из 21 вид МКА, специфичных к вирусу Эбола: 2 - к белку VP35; 9 - к белку VP40; 10 - к NP	399	115	-	-	51 (17)	42 (14)

иммунодиагностический моноклональный антитело инфекция



Рис. 12. Титрование антигена вируса Эбола и рекомбинантного нуклеопротеина парой МКА 1B2 и 7B11*

Примечания: исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 7B11* - индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 9С7 и 5F11*, специфичных к NP ВМ; концентрация МКА для “захвата” антигенов - 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином - 1 мкг/мл.

Рис. 13. Титрование антигена вируса Эбола и рекомбинантного белка VP40 парой МКА 4А2 и 1С1*

Примечания: Исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 1C1* - индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 7D8 и 7Н10*, специфичные к белку VP40 ВМ; концентрация МКА для “захвата” антигенов - 10 мкг/мл; концентрация индикаторныхМКА, меченных биотином - 1 мкг/мл.

Рис. 14. Титрование антигена вируса Марбург и рекомбинантного белка VP40 парой МКА 7D8 и 7H10*

Примечания: Исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 7H10* - индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 4A2 и 1C1*, специфичные к белку VP40 ВЭа; концентрация МКА для “захвата” антигенов - 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином - 1 мкг/мл.

Рис. 15. Титрование антигена вируса Марбург и рекомбинантного белка VP35 парой МКА 3F9 и 3F9*

Примечания: Исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 3F9* - индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали захватывающие антиген МКА 1С7, специфичные к белку VP35 ВЭ; концентрация МКА для “захвата” антигенов - 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином - 1мкг/мл.

Применение МКА и антигенов в иммунодиагностике лихорадки Западного Нила

В серодиагностике ЛЗН используют метод ИФА для выявления специфических АТ (В.В. Распопин и др., 2007; S. Feinstein et al., 1985; W.R. Hogrefe et al., 2004). Но выраженные перекрестные реакции между ВЗН и ВКЭ, ареалы которых в России перекрываются (Д.К. Львов и др., 2000; В.А. Терновой и др., 2004; В.А. Терновой и др., 2006), затрудняют его иммунохимическую диагностику (В.В. Распопин и др., 2007). Методы выявления вируса на культуре клеток москитов или Vero (I. Samina et al., 1986; K.A. Bernard et al., 2001; R.S Nasci. et al., 1999) или внутримозговым заражением новорожденных мышей (Д.К. Львов, 2000; I. Samina et al., 1986), а так же ПЦР для выявления вирусной РНК (Д.К. Львов, 2000; В.А. Терновой и др., 2004; В.А. Терновой и др., 2006; R.S. Lanciotti et al., 2000; G.L. Surtherland et al., 2007) требуют много времени и/или дороги.

Для наблюдения вирусной активности в естественных циклах передачи и предотвращения инфекции у людей Hunt A.R. и соавт. (2002) предлагают проводить выявление вирусного АГ методом ИФА в лабораториях, не имеющих оборудования для выполнения ПЦР. Для захвата антигена в этой системе использованы МКА, специфичные к южно-африканскому штамму ВЗН, полученные T.G. Besselaar и соавт. (1988), а для детекции - группоспецифические к флавивирусам МКА, конъюгированные с пероксидазой. Чувствительность выявления очищенного АГ ВЗН (штамм NY99) в этой системе составила 320 пг/мл, а в пуле лабораторно инфицированных москитов и мозговой суспензии мышей-сосунков 10³-10⁴ PFU/мл.

В России в настоящее время выпускается только одна коммерческая тест-система ИФА на основе ПАТ для выявления АГ ВЗН (ЗАО ЭКОлаб, Московская область, г. Электрогорск).

Получение и характеризация МКА, специфичных к российскому штамму вируса Западного Нила (LEIV--VL99-27889-human)

Для получения гибридом, продуцирующих МКА специфичные к структурным белкам ВЗН, было проведено 3 гибридизации и в результате наблюдения в световой микроскоп было выявлено 853 лунки с гибридами, размножающимися на селективной среде ГАТ. Из них 771 гибридная популяция была оценена в ТИФА и после 2-кратного тестирования было выявлено 119 позитивных популяций гибридом, растущих в лунках. Методом предельных разведений было проведено клонирование 75 гибридом. Заморожена позитивная популяция 32 гибридом.

Выход позитивных клонов гибридом, после клонирования, составил 24 гибридомы. Позитивные клеточные линии, по данным ИФА, были размножены (1-3 клона) и заложены в жидкий азот на хранение.

Препаративные количества очищенных 15-ти видов МКА, полученные из асцитических жидкостей мышей с привитыми гибридомными клетками, тестировали методом ТИФА с использованием в качестве АГ очищенного ВЗН (штамм Vlg99-27889). Результаты анализа представлены в табл. 11.

Все исследованные препараты содержали высокий уровень специфических МКА. Методом ИБ показана специфичность полученых МКА (рис. 16).

Проведенные ранее исследования показали, что эти МКА позволяют нейтрализовать семь штаммов ВЗН (LEIV-VLG99-27889-human; LEIV-VLG00-27924-human; LEIV-Tur73-2914-ticks; LEIV-Az70-72-ticks; LEIV- Az67-1640-nuthatch; Ast63-94-ticks; Eg101) на культуре клеток Vero (Razumov I.A., Каzachinskaia E.I. et al., 2005).

Использование РНК из мышиных гибридом, продуцирующих самые активные МКА 9Е2, позволило создать нашим коллегам в США химерную конструкцию МКА мышь/IgG1 человека, способную к протективному действию у мышей, зараженных американским штаммом NY-99 (A. Pereboev et al., 2008).

Таблица 11

Свойства МКА, специфичных к вирусу Западного Нила

№ п/п	МКА	Белок-мишень в ИБ	Субтип IgG	Титр МКА в ТИФА	Концентрация очищенных МКА (мг/мл)
				В асцитных жидкостях	В очищенных препаратах
1	9Е2	Е (53 кДа)	IgG1	>27000000	21870000	14,3
2	5Н6	н.о.	IgG1	729000	656100	6,0
3	4D10	н.о.	IgG1	243000	72900	7,0
4	7E6	Е (53 кДа)	IgG3	243000	243000	8,3
5	5F11	67 кДа	IgG3	243000	243000	8,9
6	11G3	Е (53 кДа)	IgG3	729000	810000	5,0
7	7B9	Е (53 кДа)	IgG2b	729000	729000	6,3
8	3A9	Е (53 кДа)	IgG1	72900	72900	4,5
9	5F7	н.о.	IgG1	72900	24300	1,7
10	4F11	Е (53 кДа)	IgG3	243000	243000	5,7
11	3F4	Е (53 кДа)	IgG2b	656100	656100	6,5
12	1B7	Е (53 кДа)	IgG3	656100	243000	4,5
13	2G12	Е (53 кДа)	IgG3	24300	24300	2,5
14	7G9	Е (53 кДа)	IgG3	>27000000	2430000	13,5
15	7B2	Е (53 кДа)	IgG1	24300	24300	2,5
16	АС мыши*	Е (53 кДа); 67 кДа	все	729000	2430000	н.о.
17	АС здоровой мыши	<100	<100	н.о.

Примечания:

в качестве АГ в ТИФА использован очищенный препарат ВЗН (штамм Vlg99-27889);

* сыворотка мышей, клетки селезенки которых были взяты для гибридизации; н.о. - не определяется.



Рис. 16. Иммуноблоттинг исследования белков очищенного вируса Западного Нила (штамм Vlg99-27889) с применением:

1 - сыворотки мышей, иммунизированных инфекционным вирусом;

2, 3, 4 - сывороток мышей, иммуннизированных инактивированным вирусным препаратом, селезенки которых были взяты в гибридизацию;

5 - 10 - очищенных препарататов МКА 9Е2,7G9, 11G3, 7F9 и 7B9, соответственно;

11, 12 - очищенных препаратов МКА 5H6 и 4D10.

Справа приведены обозначения молекулярной массы по маркерам (Life technology).

Все антитела использовали в разведении (1/1000); cтрелками показаны белки вирусного препарата

Изучение антигенных свойств препаратов ВЗН с применением МКА

МКА были получены при иммунизации мышей-доноров иммунных спленоцитов очищенным вирусным препаратом из мозговой ткани инфицированных ВЗН мышей-сосунков.

Приготовление очищенного АГ трудоемкий и затратный процесс, так на приготовление 1 мг АГ было использовано 40 животных. Чтобы исключить наработку вирусного препарата на инфицированных животных, для дальнейших исследований использовали концентрированный АГ из инфицированных клеток Vero. С монослоя инфицированных клеток Vero (до появления явного ЦПД вируса в виде лизиса инфицированных клеток) удаляли поддерживающую среду, а клеточный дебрис в небольшом объеме среды без сыворотки осаждали низкоскоростным центрифугированием при 1000 об/мин. Осадок клеток в объеме 1 мл среды без сыворотки обрабатывали ультразвуком при 50 Вт в течение 30 секунд на тающем льду. Лизат клеток освобождали от осадка клеточных мембран центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. К аликвотам полученного лизата клеток или очищенного вирусного препарата добавляли 50% глицерина и 1% Nonidet P40. Супернатанты для учета инфекционного титра вируса на культуре клеток Vero получали центрифугированием (при 10000 об/мин, 4⁰С) трехкратно замороженной и размороженной среды вместе с клетками, после наблюдаемого не менее 80% ЦПД вируса на монослой зараженных клеток. Работа с инфекционным ВЗН проводилась в изолирующем боксе, так как он относится к агентам II группы патогенности по биобезопасности.

Оценку эффективности взаимодействия МКА с белками очищенного и неочищенного АГ проводили методами ТИФА и ИБ. Результаты титрования очищенного вируса и лизата инфицированных клеток Vero в ТИФА с МКА 9Е2 приведены на рис. 17. В лизате инфицированных клеток белок Е выявляется методом ИБ с МКА без фоновых полос, так же как и в очищенном вирусном препарате (рис. 18). МКА, специфичные к ВЗН не выявляли этот белок в препаратах ВКЭ и ВЯЭ.

Данные ИБ и данные титрования очищенного вируса и лизата инфицированных клеток в ТИФА свидетельствуют о высокой специфичности МКА к белку Е и возможности использования неочищенного вирусного препарата в качестве положительного контроля на АГ. Высокий уровень урожая вируса при наработке на культуре клеток Vero позволяет не использовать животных.



Рис. 17. Титрование вирусных препаратов в ТИФА с МКА 9Е2

Примечания:

ВЗН - вирус Западного Нила;

ВКЭ - вирус клещевого энцефалита; ВЯЭ - вирус японского энцефалита.

Рис. 18. Иммуноблоттинг препаратов вируса Западного Нила с МКА 9Е2

1. очищенный, концентрированный вирусный препарат в градиентах 30% глицерина - 40% тартрата калия - натрия, приготовленный из гомогената мозга мышей,

2. инфицированных ВЗН (штамм LEIV-VLG99-27889-human); лизат клеток Vero, инфицированных ВЗН (штамм Eg101);

3. лизат не инфицированных клеток Vero;

4. очищенный, концентрированный препарат ВКЭ;

5. очищенный, концентрированный препарат ВКЭ.

Все полоски мембраны обработаны очищенными МКА 9Е2 в разведении (1/500).

Выбор пар МКА для эффективного выявления антигена ВЗН

Оценку конкуренции МКА за эпитопы белка Е проводили в двухцентровом ИФА формата “сэндвич”. На очищенные для “захвата” АГ МКА, сорбированные на полистироловую поверхность микропланшета наносили вирусный препарат и затем вторые МКА меченные биотином (индикаторные). После отмывки выявляли связанную биотиновую метку конъюгатом стрептавидина с пероксидазой. Результаты представлены в табл. 12. Выявлено несколько пар МКА специфичных к удаленным друг от друга эпитопам и не конкурирующих между собой за места связывания с АГ: 9Е2+5Н6*; 9Е2+7G9*; 5H6+7G9*; 5H6+7E6*; 7E6+5H6*; 7E6+7G9* (звездочками обозначены индикаторные антитела). По результатам титрования АГ разными парами МКА, наиболее перспективной для использования в иммунохимических тестах представлялась пара МКА 9Е2+5Н6*, которая и была использована в дальнейших экспериментах.

Иммунохимическое выявление вируса Западного Нила в биопробах

С использованием пары МКА (9Е2 для захвата АГ и 5Н6, связанных с биотином для детекции и конъюгата стрептавидина с пероксидазой) исследован ряд вируссодержащих субстанций с целью оценки эффективности данных АТ для выявления АГ ВЗН. На рис. 19 представлены результаты выявления очищенного антигена и лизата инфицированных клеток. Очищенный АГ ВЗН (с концентрацией по белку 1 мг/мл) эта система достоверно определяет в разведении 1/51200. Таким образом, лимит выявления АГ составляет 1-2 нг/мл. Выбранная пара МКА позволяет выявлять в ростовой среде инфицированных клеток Vero вирусный АГ семи исследованных штаммов ВЗН, выделенных от разных хозяев - людей, птиц и нескольких видов клещей в разное время (рис. 20).

Для оценки эффективности обнаружения АГ ВЗН в биопробах от животных была моделирована ЛЗН (штамм Египет-101) на белых беспородных мышах при внурибрюшинном заражении, как описано Писаревым В.Б. и соавт. (2007). Биологический материал забирали в разгар заболевания (активность резко снижена, шерсть взъерошена, живот асцитный, паралич задних конечностей). Животным под эфирным наркозом проводили декапитацию и забор биологического материала проводили с соблюдением требований инструкций, разработанных для работы с вирусами II группы патогенности и правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Из крови получали сыворотку, а из органов готовили 10%-е гомогенаты мозга, печени, селезенки, почек, легкого и сердца. В качестве положительного контроля на АГ использовали ростовую среду от инфицированных клеток Vero. Результаты представлены на рис. 21. По данным титрования было выявлено, что в цельной крови АГ практически не обнаруживается, а наибольшее его количество сконцентрировано в мозговой ткани и клетках печени. В клетках сердца, селезенки, почек и легкого мышей ВЗН так же продуктивно реплицируется, что говорит широком диапазоне его тропности.

На основании этих данных совместно с ЗАО “Вектор-Бест” была разработана экспериментальная тест-система “ВектоНил-антиген”. Для “захвата” АГ использовались иммобилизованные высокоспецифичные МКА 9Е2, а в качестве конъюгата применялись меченые пероксидазой хрена МКА 5Н6. Сотрудниками лаборатории ООИ ФГУЗ «ЦГиЭ в Волгоградской области» были проведены полевые испытания этой тест-системы. Результаты представлены в табл. 13. Было исследовано 264 пробы из внешней среды на наличие антигена АГ ВЗН, в том числе суспензии из органов 62-х птиц (видовой состав - грачи, вороны, дрозды), 114 комаров (рода Aedes, Culex, Anopheles); 36 клещей (виды H. Morginatum и D. Reticulatum), органов 52-х мелких мышевидных грызунов. Положительный результат на АГ был получен в 15 пробах (5,6%): комаров - 14 (12,2%) и клещей - 1 (2,7%). Комары рода Aedes и Culex пойманы в Камышинском районе Волгоградской области и г. Волгограде. Клещ H. morginatum был снят с грача (Октябрьский район Волгоградской области).

Таким образом, разработанная на основе двух видов МКА, тест-система “ВектоНил-антиген”, может применяться при проведении эпидемиологических исследований на присутствие АГ ВЗН в биологических образцах, собранных в природе.

Таблица 12

Результаты оценки МКА, специфичных к разным эпитопам белка Е вируса Западного Нила методом двухцентрового ИФА в формате “сэндвич”

№	МКА захвата	Индикаторные МКА, меченные биотином
		9Е2	5Н6	4D10	7E6	5F11	11G3	4F11	3F4	7G9
1	9Е2	0,23	3,83	0,56	0,84	0,66	0,06	0,78	0,60	2,51
2	5Н6	0,55	0,80	2,53	2,72	3,17	0,99	0,94	0,89	3,09
3	4D10	0,04	0,48	0,62	0,03	1.03	0,06	0,66	0,61	0,54
4	7E6	0,01	3,57	0,65	0,19	0,86	0,04	0,79	0,67	3,20
5	5F11	0,05	0,43	0,70	0,01	0,97	0,03	0,51	0,64	0,45
6	11G3	0,01	0,43	0,84	0,05	1,45	0,04	0,62	0,52	0,38
7	7B9	0,01	0,29	0,94	0,01	1,64	0,02	0,44	0,51	0,27
8	3A9	0,01	0,41	1,64	0,09	3,30	0,05	0,79	0,49	0,33
9	5F7	0,09	0,24	1,19	0,06	2,60	0,03	0,42	0,70	0,47
10	4F11	0,08	0,19	1,53	0,09	2,80	0,07	0,38	0,53	0,31
11	3F4	0,09	0,27	1,33	0,09	2,63	0,07	0,43	0,53	0,33
12	1B7	0,10	0,09	0,43	0,09	0,62	0,05	0,39	0,54	0,21
13	2G12	0,08	0,08	0,52	0,09	0,62	0,05	0,39	0,54	0,21
14	7G9	0,06	0,99	1,04	0,24	1,62	0,02	0,52	0,57	0,81
15	7B2	0,07	0,11	0,71	0,05	1,19	0,05	0,48	0,52	0,29
16	АС мыши*	0,16	1,49	1,50	0,79	2,71	0,21	0,67	0,62	1,88
17	контроли	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1

Примечание: В качестве антигена использован лизат клеток Vero инфицированных ВЗН (штамм Eгипет-101); МКА для сорбции в ячейках планшета использовали в концентрации 10 мкг/мл; ндикаторные МКА использовали в концентрации 1 мкг/мл; жирным шрифтом выделены результаты для неконкурирующих МКА, т.е. активно “захватывающих” АГ; АС мыши* - сыворотка мыши, иммунизированной инфекционным вирусом. В качестве отрицательных контролей использовали лизат не инфицированных клеток Vero и очищенные препараты вирусов клещевого и японского энцефалитов.

Рис. 19. Результаты исследования серий двукратных разведений вирусных препаратов в двухцентровом ИФА с использованием пары МКА 9Е2 для захвата и 5Н6 для детекции

Рис. 20. Титрование антигена в вируссодержащей ростовой среде от инфицированных клеток Vero в двухцентровом ИФА парой МКА 9Е2 и 5Н6*

Примечания: стрелками обозначен диапазон чувствительности ИФА при сравнении инфекционного титра вируса в супернатантах при параллельном их титровании на культуре клеток Vero.

Разведение супернтанта (-3) соответствует в данном эксперименте 100 ТЦД50/100 мкл; Eg -101 - штамм Египет 101, выделен в 1951 г. в Египте из сыворотки больного ребенка; Hp-94 - штамм Ast63-94-ticks, выделен в 1963 г. из клещей Hyalomma marginatum в дельте Волги (Астраханская область); Vlg-27924 - штамм LEIV-VLG00-27924-human, выделен в 2000 г. в г. Волгограде из мозга человека 74 лет, погибшего от ЛЗН; А-72 - штамм LEIV-Az70-72-ticks, выделен в 1970 г. из клещей Ornithodoros capensis в Азербайджане; Vlg-27889 - штамм LEIV-VLG99-27889-human, выделен в 1999 г. в г. Волгограде из мозга человека 15 лет, погибшего от ЛЗН; А-1640 - штамм LEIV-Az67-1640-nuthatch, выделен в 1967 г. из мозга птицы Sitta europaea в Азербайджане; Tur-2914- штамм LEIV-Tur73-2914-ticks, выделен в 1973 г. из клещей Hyalomma detritum в Туркмении.

Рис. 21. Выявление вирусного антигена в биологических пробах от инфицированных мышей методом двухцентрового ИФА парой МКА 9Е2 и 5Н6*

1 - супернатант от инфицированных клеток Vero (положительный контроль); 2 - 10% гомогенат мозговой ткани; 3 - 10% гомогенат печени; 4 - 10%-й гомогенат легкого; 5 - 10%-й гомогенат селезенки; 6 - 10% гомогенат cердца; 7 - 10% гомогенат почек; 8 - цельная сыворотка крови; 9 - ростовая среда от клеток Vero (отрицательный контроль).

Таблица 13

Результаты полевого испытания ИФА тест-системы “ВектоНил-антиген”

Пробы	Количество исследованных проб	Результаты, полученные при использовании тест-системы “ВекторНил-антиген”
		Положительных	Отрицательных
Суспензии из органов птиц (грачи, вороны, дрозды)	62	0	62
Суспензии из комаров родов Aedes, Culex, Anopheles	114	14	100
Cуспензии из органов мелких мышевидных грызунов	52	0	52
Суспензии из клещей H.morginatum, D.reticulatum	36	1	35
Всего	264	15	249

Примечания: для конструирования диагностической ИФА тест-системы” ВектоНил-антиген” для “захвата” антигена использовали очищенные МКА 9Е2; в качестве конъюгата применялись меченые пероксидазой хрена МКА 5Н6. Биологические образцы были собраны в очагах инфекции ЛЗН в Волгоградской области сотрудниками ООО ФГУЗ “ЦГ и Э в Волгоградской области”.

Применение моноклональных антител в диагностике цитомегаловирусной инфекции

Получение коллекции мышиных гибридом, продуцирующих МКА к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типа (ВГЧ-5, ЦМВ)

Очищенные частицы ЦМВ содержат от 30 до 40 полипептидов с молекулярной массой в диапазоне 20 - 300 кДа (S. Landolfo et al., 2003). В матриксном (тегументном) слое вириона расположены, предположительно, 25 белков (W. Gibson, 1996). В связи сэтим, провести отбор гибридом, продуцирующих МКА к белку рр65, при иммунизации животных нативным АГ, достаточно проблематично.

Для иммунизации мышей - доноров иммунных спленоцитов целенаправленно был использован рек. белок рр65, полученный в результате биосинтеза в клетках E.coli (И.М. Суслопаров и др., 2005). Исследование антигенных и иммуногенных свойств рек. белка рр65 не проводили, в связи с очевидностью этих характеристик. Ранее было описано применение кроличьих ПАТ, полученных к рек. белку рр65 для выявления продуктивной ЦМВИ в тканях сердца пациентов, после операции аортокоронарного шунтирования (М.А. Суслопаров и др., 2005). Кроме того, для формирования отечественной стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих АТ к ЦМВ человека, были использованы рек. белки - рр150, р52 и белок рр65 (С.Н. Ивченко, 2008).

В результате слияния и клонирования получены, тестированы и заложены на хранение в Банк гибридом ГНЦ ВБ “Вектор” (в жидком азоте) 11 гибридных клеточных линий, стабильно продуцирующих МКА, специфичных к рек. белку рр65.

Характеризация МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65 ЦМВ

Характеризацию АТ проводили методом ТИФА с использованием рек. белка и нативного вирусного АГ, полученного в виде лизата инфицированных клеток Vero. Определяли класс IgG, концентрацию АТ в очищенных препаратах и титры специфического взаимодействия с АГ. Результаты представлены в табл. 14. Все гибридные клетки продуцировали МКА класса IgG_1,. взаимодействовали в ТИФА с рек. белком в диапазоне разведений от 1/24300 до 1/1968000, а с нативным вирусным белком в диапазоне от 1/1600 до 1/25600 и выявляли оба белка в ИБ. Наибольшую активность при взаимодействовии с вирусным белком рр65 в ТИФА проявляли МКА 5F10.

Таблица 14

Характеристика МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65 ЦМВ

№ п/п	Название гибридомы и МКА	Класс IgG	Титры МКА в ТИФА (обратные величины) к антигенам*	Концентрация очищенных МКА (мг/мл)	Иммуноблоттинг с использованием антигенов**
			Рекомби-нантному	Нативному		Рекомбинантного	Нативного
1	5F10	IgG1	1968000	25600	10,3	+	+
2	1F9/H11	IgG1	1968000	12800	8,7	+	+
3	1F9/E8	IgG1	1968000	12800	7,25	+	+
4	I/A	IgG1	218700	12800	7,0	+	+
5	I/G	IgG1	24300	3200	5,3	+	+
6	I/C5	IgG1	24300	1600	4,0	+	+
7	I/H	IgG1	24300	3200	4,7	+	+
8	I/В10	IgG1	24300	3200	6,0	+	+
9	I/D4	IgG1	24300	3200	4,5	+	+
10	II/H10	IgG1	1968000	12800	7,6	+	+
11	II/C12	IgG1	1968000	12800	8,1	+	+

Примечание: * В ТИФА для сенсибилизации планшетов использовали рек. рр65 с концентрацией 1 мкг/мл, а нативный АГ (лизат инфицированных клеток Vero) в разведении 1/20. ** В ИБ рекомбинантный и нативный белки использовали в объемах по 10 и 20 мкл на дорожку, соответственно.

Выявление вирусного белка рр65 в клетках, инфицированных цитомегаловирусом человека

Для исследований ЦМВ человека используют, главным образом, диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека, так они переживают продуктивную инфекцию с характерным для этого вируса цитопатическим эффектом - округление, увеличение размеров, многоядерность (Н.Е. Федорова и др., 2005; Л.К. Эмралидзе и др., 2005). Было показано, что ЦМВ человека стимулирует клетки Vero к вступлению в фазу митоза. Инфицированные клетки Vero могут нормально завершать цикл деления, так как прирост числа клеток в этой популяции обычно не ниже уровня контрольных незараженных клеток. С помощью МКА показана экспрессия сверхраннего белка р72 ЦМВ в инфицированных клетках этого вида (Н.Е. Макарова, 1995).

Для оценки продуктивной ЦМВИ исследовали уровень синтеза белка рр65 в нескольких культурах клеток - L-68, Vero, RH и 293. Характерное ЦПД вируса (набухание и лизис) наблюдалось только на чувствительной культуре клеток L-68, остальные инфицированные культуры не отличались визуально от контрольных незараженных клеток. На рис. 22 приведены результаты ПААГ-ЭФ лизатов инфицированных клеток перечисленных выше культур.

Визуально белок рр65 в большом количестве присутствует во всех вирусных препаратах. Однако этот белок сложно отличить от сходного с ним по молекулярной массе бычьего сывороточного альбумина (БСА, 66 кДа), содержащегося в ростовой среде от инфицированных клеток. Отмывание клеточного монослоя при получении лизатов не обеспечивает полного избавления от этого белка. В связи с этим, далее наличие специфического АГ в лизатах оценивали методом ИБ. На рисунке 23 видно, что очищенные МКА 5F10 активно выявляют нативный вирусный белок рр65 в препаратах, полученных при инфицировании ЦМВ разных культур клеток - Vero, RH и L-68.

Растворы меркаптоэтанола и SDS, использующиеся при выполнении процедуры ЭФ могут вызывать нарушение структуры вирусных белков. Для оценки эффективности взаимодействия полученных МКА с нативными вирусными белками, выращивали инфицированную культуру клеток Vero в лунках 96-луночного культурального планшета и спустя 7 суток клетки фиксировали на поверхности планшета этанолом. Инфицированные клетки обрабатывали очищенными МКА и антивидовыми антителами, меченными пероксидазой. Окрашивание проводили с использованием субстрата на основе 3-amino-9-ethylcarbazole. Результаты иммуноцитохимического анализа приведены на рис. 24. Видно, что МКА 5F10, специфичные к рек. белку рр65, интенсивно окрашивают нативный вирусный белок рр65 в виде мелких и крупных конгламератов в персистентно инфицированных клетках Vero.

Результаты исследования в ТИФА серий двукратных разведений герпесвирусных АГ показали, что применение МКА 5F10 позволяет определять рек. белок рр65 в концентрации 2,5 нг/мл (на рис. 25). Вирусный АГ, приготовленный из лизата инфицированных клеток Vero, выявляется на порядок хуже, что пропорционально относительно небольшой доле целевого белка в общем массиве лизатных протеинов. В качестве отрицательных контролей в этих экспериментах использовали нативный ВПГ-2 (М.А. Суслопаров и др., 2004), так же приготовленный из лизата инфицированных клеток Vero, и рек. белок gG вируса ВПГ-2 (М.А. Суслопаров, 2009), который является типоспецифическим маркером для этого вируса. Исследованные МКА не вступали в перекрестные реакции ни с тем, ни с другим контрольным образцом, что свидетельствует об их типовой специфичности.

Проведенные эксперименты показали, что полученные МКА обладают высокой специфичностью и активностью, позволяющей эффективно применять их для ранней диагностики ЦМВИ.

К сожалению, отсутствие животной модели для ВГЧ-5 (ЦМВ) не позволяют исследовать протективное или лечебное действие полученных МКА. Но получение МКА может иметь потенциальное терапевтическое значение. Так как в настоящее время нет препаратов широкого антивирусного действия, идет активное исследование препаратов и подходов к лечению ЦМВИ. На том факте, что основной белок тегумента рр65 может самостоятельно доставляться из инфицированных клеток в ядра соседних клеток (S. Schmolke et al., 1995; С.С. Ряскина и др., 2006), может быть сконцентрирован подход антивирусной терапии против ЦМВИ. Есть данные о том, что рр65 оказывает негативное влияние на развитие интерферонового сигнала на начальных стадиях инфицирования после проникновения вируса в клетку, до начала синтеза остальных вирусных белков (E. Browne et al., 2003). Показан вакцинный потенциал белков ВГЧ-5, синтезированных альфавирусными репликонами, несущими гены белков IE1, gB и рр65 (E.A. Reap et al., 2007; M.R. Schleiss, 2008).

Рис. 22. Результаты электрофоретического анализа белковых препаратов