Agrobacterium-опосередкована транзієнтна експресія генів рекомбінантних білків (GFP, бета-глюкуронідази та інтерферону альфа 2b) в рослинах роду Nicotiana L.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2009.

Дисертація присвячена розробці протоколу отримання рекомбінантних білків шляхом Agrobacterium-опосередкованої транзієнтної експресії відповідних трансгенів. Розроблено протокол для транзієнтної експресії генів чужорідних білків, що знаходились в генетичних конструкціях різних типів, у рослинах роду Nicotiana, досліджено вплив ряду біологічних факторів на рівень накопичення рекомбінантних білків. Показано, що важливе значення для отримання цільових білків методом Agrobacterium-опосередкованої транзієнтної експресії має вид рослини-продуцента. Серед австралійських представників роду Nicotiana нами були відібрані види рослин, які демонстрували високий вміст накопичення репортерного білка GFP при використанні векторних конструкцій різних типів. В результаті трансформації експлантів N. benthamiana бактерією A. rhizogenes було отримано трансгенну кореневу культуру “hairy roots”, регенеровано з неї рослини та проведено оцінку трансгенних рослини. Продемонстровано, що вміст репортерного білка залежить від стадії розвитку рослини та віку листків, в яких відбувається транзієнтна експресія. Доведено, що супресор сайленсингу генів р19 збільшує вміст репортерного білка GFP, ген якого входить до складу модульної рекомбіназної векторної системи експресії. Показано, що фітогормони (ауксини, цитокінин) в різних концентраціях, метилжасмонат та інгібітори його біосинтезу не впливають на накопичення репортерного білка при транзієнтній експресії. Було розроблено методику двох-стадійного очищення репортерного білка GFP з рослинного екстракту. Було показано транзієнтну експресію гена uidA (кодує білок в-глюкуронідазу) в рослинах видів N. excelsior та N. cavicola і продемонстровано активність даного ферменту. Було отримано інтерферон альфа 2b людини в рослинах виду N. excelsior шляхом транзієнтної експресії гена та доведено біологічну активність даного білка.

Ключові слова: Agrobacterium-опосередкована транзієнтна експресія, рекомбінантні білки, Nicotiana benthamiana, Nicotiana excelsior, GFP, інтерферон альфа 2b людини, Agrobacterium rhizogenes, генетична трансформація.

Синдаровская Я.Р. Agrobacterium-опосредованная транзиентная экспрессия генов рекомбинантных белков (GFP, в-глюкуронидазы и интерферона альфа 2b) в растениях рода Nicotiana L. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук за специальностью 03.00.20 - биотехнология. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертационная работа посвящена разработке протокола получения рекомбинантных белков методом Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии соответствующих трансгенов. Разработан протокол для транзиентной экспрессии генов чужеродных белков, которые находились в генетических конструкциях различных типов, в растениях рода Nicotiana; исследовано влияние ряда биологических факторов на уровень накопления рекомбинантных белков. Показано, что для получения целевых белков методом Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии существенное значение имеет вид растения-продуцента. Среди австралийских представителей рода Nicotiana были отобраны виды растений, которые накапливали репортерный белок GFP в значительных количествах при использовании различных типов векторных систем. В результате трансформации эксплантов N. benthamiana с помощью A. rhizogenes была получена культура трансгенных корней “hairy roots”, из которой были регенерированы растения и проведена их оценка с биотехнологической точки зрения. Продемонстрировано, что содержание репортерного белка зависит от стадии развития растения и возраста листьев, в которых происходит транзиентная экспрессия. Доказано, что вирусный супрессор сайленсинга генов р19 увеличивает содержание репортерного белка GFP, если соответствующий целевой ген находится в составе модульной рекомбиназной векторной системы. Показано, что фитогормоны (ауксины, цитокинин) в различных концентрациях, метилжасмонат и ингибиторы его биосинтеза не влияют на накопление репортерного белка при транзиентной экспрессии. Разработана методика двухстадийной очистки репортерного белка GFP из растительного экстракта. Была показана транзиентная экспрессия гена uidA (кодирует белок в-глюкуронидазу) в растениях видов N. excelsior и N. cavicola и продемонстрирована активность данного фермента. Был получен интерферон альфа 2b человека в растениях вида N. excelsior методом транзиентной экспрессии гена и доказана биологическая активность данного белка.

Ключевые слова: Agrobacterium-опосредованная транзиентная экспрессия, рекомбинантные белки, Nicotiana benthamiana, Nicotiana excelsior, GFP, интерферон альфа 2b человека, Agrobacterium rhizogenes, генетическая трансформация.

Sindarovska Y.R. Agrobacterium-mediated transient expression of genes of recombinant proteins (GFP, в-glucuronidase and interferon alpha 2b) in plants of Nicotiana L. genus. - Manuscript.

Thesis for PhD degree in biology by specialty 03.00.20 - biotechnology. - Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

The thesis focuses on protocol development for recombinant protein production in plants of Nicotiana L. genus by Agrobacterium-mediated transient expression using different types of expression cassettes. The first cassette contained gene of interest driven by 35S promoter of cauliflower mosaic virus (35S- system). The second one (module recombinase system) consisted of two vectors (modules) included virus genome elements. Their recombination inside of plant cell with site-specific recombinase (the third module) produced mature transcript.

It was tested the suitability of seven Australian species of Nicotiana L. genus and common American species of this genus (N. tabacum cv. Wisconsin 38) for Agrobacterium-mediated transient expression. It was demonstrated the importance of correct choice of plant species for production of recombinant proteins using Agrobacterium-mediated transient expression. It was selected plant species with high level of accumulation of reporter protein GFP (green fluorescent protein). The best results we observed for species N. cavicola, N. excelsior and N. exigua (6.0%, 3.7% and 3.1% of total soluble proteins (TSP), respectively) if 35S- vector system was used. Additionally N. excelsior and N. cavicola had shown the best results when module recombinase system was used (up to 60% TSP and 12% TSP, respectively). The level of reporter protein accumulation in N. cavicola, N. excelsior and N. exigua was comparable with that in model species commonly used for Agrobacterium-mediated transient expression: N. benthamiana (3.8% and 16% TSP for 35S- system and module recombinase system, respectively) and N. tabacum (2.6% TSP for 35S- system). The additional advantage of N. excelsior is high biomass yield: the raw weight of one N. excelsior leaf is approximate 3.6 g while the raw weight of one N. benthamiana leaf is only 0.5 g. This advantage allows of harvesting more recombinant protein from one experimental plant. Using 35S- vector system we demonstrated the transient expression of uidA (GUS) gene (coding for reporter protein в-glucuronidase) in N. cavicola and N. excelsior.

After transformation of N. benthamiana leaf explants with A. rhizogenes A4 we obtained transgenic root culture (“hairy roots”). Transgenic plants were regenerated from “hairy roots” using nutrient medium Murashige-Skoog supplemented with phytohormones - indolylacetic acid (IAA) (0.1 mg/l) and benzilaminopurine (1 mg/l). Biomass of transgenic plants surpassed twice the biomass of wild type N. benthamiana plants (in vitro conditions). The content of GFP after transient expression of gene was similar in transgenic and non-transgenic plants.

We demonstrated that the content of reporter protein after Agrobacterium-mediated transient expression depends on the plant development stage and leaf age. The best results for the both types of expression systems were shown for adult plants before flowering. GFP accumulation levels in N. benthamiana plants were 3.8% TSP and 16% TSP for 35S- system and module recombinase system, respectively. Flowering plants had statistically lower GFP content (Р < 0.05): 0.5% TSP and 2.3% TSP for 35S- system and module recombinase system, respectively. The best level of reporter protein accumulation was observed in younger leaves. In N. benthamiana high level of reporter protein was found in the 2^nd-6^th leaves from the apical meristem if 35S- vector system was used. When module recombinase system was used (in N. excelsior) good GFP accumulation was observed in the 2^nd-4^th leaves from the apical meristem.

We demonstrated the importance of p19 (gene cording for suppressor of PTGS) coexpression with module recombinase system. The level of reporter protein reached 50% TSP in the presence of p19 and was about 14% TSP without p19.

Plant hormones (auxins (IAA and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid) and cytokinin (kinetin)) as well as methyljasmonate or inhibitors of jasmonate biosynthesis (diethyldithiocarbamic acid or phenidone) in the tested range of concentrations did not affect reporter protein accumulation if 35S- vector system was used.

In order to obtain preparative amounts of standard GFP we developed the scheme for its purification from crude protein extract. The scheme included of two steps: ammonium sulfate precipitation and anion-exchange chromatography. As a result we obtained recombinant reporter protein with 85% purity and 75% yield of initial GFP level.

Under the developed optimal conditions we carried out agroinfiltration in N. excelsior and demonstrated transient expression of human interferon alpha 2b gene (replacing GFP in the module recombinase system). It was resulted accumulation of biologically active recombinant interferon. The maximal activity of recombinant interferon reached 32x10² IU/ml, approximately 30-50 ng/g fresh weight.

Key words: Agrobacterium-mediated transient expression, recombinant proteins, Nicotiana benthamiana, Nicotiana excelsior, GFP, human interferon alpha 2b, Agrobacterium rhizogenes, genetic transformation.

Размещено на Allbest.ru