Створення генетично модифікованих рослин родин Compositae та Solanaceae

Проведены эксперименты по слиянию мезофильных протопластов S. tuberosum сортов Луговской и Славянка з геном nptII в ядерной ДНК и транспластомного S. rickii с геном aadА в хлоропластах. На селективной среде с тремя антибиотиками - канамицином, спектиномицином и стрептомицином - получены гибридные растения. Они имели гены aadА и nptII, хлоропластную ДНК S. rickii и S. tuberosum, гибридный ядерный геном. Использование селективного давления при наличии у одного из родителей маркерного гена в хлоропластах, а у другого - в ядерной ДНК, позволяет без инактивации ядерной ДНК донора с высокой вероятностью получить гибридные растения, содержащие оба маркерных гена.

Путем агробактериальной трансформации конструкциями рСВ063 и рСВ064 с селективным геном nptII и целевыми генами белков-антигенов ESAT6 и ESAT6:Ag85В(-ТМД) получены трансгенные растения трех сортов салата. Частота трансформации эксплантов составила 18 - 62%. Анализ геномной ДНК выявил наличие в регенерированных растениях как селективного, так и целевых генов. В то же время, анализ обратных транскриптов показал, что при стабильной транскрипции селективного гена возможно как наличие, так и отсутствие мРНК целевого гена. В четырех из шести анализировавшихся растений детектировалась транскрипция как селективного, так и целевого генов. Анализ наследования селективного гена nptII показал отсутствие расщепления по этому признаку в растениях Т1 та Т2 поколений. Все анализировавшиеся растения Т1 та Т2 имели как селективный, так и целевой гены.

Оптимизированы условия регенерации растений из семядольных эксплантов цикория Cichorium intybus. Частота регенерации на питательной среде MS с 0,5 - 2,5 мг/л кинетина составляла 100%. Методом агробактериальной трансформации конструкцией рСВ124 с селективным nptII и целевым ifn-б2b генами получены трансгенные растения, причем частота трансформации эксплантов составляла 26,9%. По результатам анализа регенерованные растения имели как селективный, так и целевой гены.

Ключевые слова: Lactuca sativa, Cichorium inhybus, Solanum rickii, Solanum tuberosum, Lycopersicon рeruvianum, биолистическая трансформация, агробактериальная трансформация, соматическая гибридизация.

SUMMARY

Matvieieva N.A. Construction of transgenic plants of Compositae and Solanaceae families. Manuscript.

Thesis for a candidate degree on the speciality 03.00.20 - biotechnology. - Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, NASU, Kyiv, 2009.

The thesis is devoted to construction of Solanaceae and Compositae plants (Solanum rickiі, Solanum tuberosum, Lycopersicon peruvianum, Lactuca sativa, Cichorium intybus) with transformed nuclear or chloroplast DNA. For this purpose the methods of somatic hybridization, biolistic and Agrobacterium-mediated transformation have been used.

The biolistic method have been used for Solanum rickii chloroplast transformation with aadA gene. The hybrid plants with transformed plastids were regenerated after PEG fusion of chlorophyll-deficient L. peruvianum leaf mesophyl protoplasts and leaf mesophyl protoplasts from the S. rickii plants, which previously have been transformed. The hybrids were identified by PCR analysis of nuclear and plastid DNA.

The hybrid plants with transformed plastids were regenerated after mesophyl protoplasts fusion of S. rickii with aadA chloroplast selective marker gene and S. tuberosum with nptII nuclear selective marker gene. The analysis have shown that regenerated plants were the somatic hybrids containing aadA, nptII genes, nuclear and chloroplast DNA from S.rickii and S. tuberosum.

Transgenic plants of Lactuca sativa L. with genes of bacterial antigens from Mycobacterium tuberculosis have been obtained by Agrobacterium-mediated transformation. The DNA PCR-analysis has shown the presence of both selective and target genes. At the same time, the RT-PCR has shown, that both presence and absence of a transcription of ESAT6 protein gene at a stable transcription of a nptII gene is possible.

The efficient method for plant regeneration and Аgrobacterium-mediated transformation with interferon - б2b gene has been developed for Cichorium intybus L.. Regeneration with efficiency 100% was induced on the MS medium (0,5-2,5 mg/l kinetin and 0,5 mg/l NAA). Transformed plantlets were recovered at 26,9% frequency. According to PCR-analysis the nptII and ifn-б2b genes were integrated in the genome of transformed plants.

Key words: Solanum rickiі, Solanum tuberosum, Lycopersicon peruvianum, Lactuca sativa, Cichorium intybus, Аgrobacterium-mediated transformation, biolistic transformation, somatic hybridization.

Размещено на Allbest.ru