Структурні основи міжмолекулярного розпізнавання та комплексоутворення серинових протеїназ

Практичне застосування даних щодо локалізації та функціональної ролі ефекторної ділянки серинових протеїназ.

Наведені в попередній частині роботи дані свідчать, що в основі структурного забезпечення спрямованості дії серинових протеїназ лежить синхронна взаємодія зв'язуючої та ефекторної ділянок активного центра фермента з відповідними за лігандною специфічністю та розміщеними в оптимальній конформації амінокислотними залишками функціонально обумовленого пептидного зв'язка білка-мішені, свого роду комплексного ліганду. Порушення конформації подібної структури дорівнює її знищенню та позбавляє білок здатності приймати повноцінну участь у відповідних взаємодіях. З іншого боку, формування подібної структури на поверхні білка перетворює останній на ефективного учасника подібних взаємодій. Усвідомлення наведеного положення дозволяє не лише зрозуміти окремі аномалії міжбілкового комплексоутворення, але й створює ефективні практичні підходи до діагностики та цілеспрямованого втручання в опосередковані цими взаємодіями процеси. Подібне припущення перевірено на прикладі порівняльного дослідження впливу класичного білкового інгібітора трипсину з сої на гідроліз трипсином різних за структурою білкових та синтетичних субстратів. Активність трипсину по відношенню до синтетичних субстратів та денатурованого білка - казеїну - знижувалась лінійно відповідно до зростання внесеного інгібітора та сягала нульового показника при молярному співвідношенні фермент:інгібітор 1.0:1.2. Натомість інгібування гідролізу протаміну мало нелінійний характер і не було повним навіть за співвідношення 1:4 (рис.5).

Активаційна дія трипсину по відношенню до плазміногену зберігалася навіть за надлишку інгібітора, що свідчить про порівняний рівень спорідненостей активного центру трипсину до ділянки активаційного розщеплення профермента та до реактивного центру білкового інгібітора. Наведено окремі приклади прояву та утилізації підвищеної спорідненості серинових протеїназ до комплексних лігандних угруповань, а також вперше висунуто та обгрунтовано практичні підходи до цілеспрямованого втручання в опосередковані подібного роду взаємодіями патогенні процеси.

Ідентифікація ефекторної ділянки та встановлення її впливу на каталітичні та зв'язуючі властивості серинових протеїназ дозволяє пояснити аномальний характер взаємодії останніх з афінними сорбентами, що містять низькомолекулярні гідрофобні ліганди. Згідно класичних положень афінної хроматографії, взаємодії з K_D, більшими за 10^-3М, не здатні забезпечити ефективну сорбцію, оскільки замість зв'язування має відбуватися розтягнута елюція білка у вигляді розтягнутого піку (Graves D.,Wu Y-T., 1974). В той же час для виділення серинових протеїназ давно і успішно застосовуються імобілізовані феніл-бутил-амін та метиловий ефір D-триптофану - речовини, чия взаємодія з хімотрипсином характеризується K_D 2.8 та понад 2 mM, відповідно (Tomlinson G., et al., 1974, Foster D., et al., 1955). Для випадку феніл-бутил-аміну показано, що зв'язуючі властивості сорбенту залежать від концентрації імобілізованого ліганду (Hofstee B., 1973, 1975): до досягнення останньою певної величини спостерігається вкрай слабке зв'язування хімотрипсину, тоді як перевищення цього значення веде до виключно сильної сорбції, котру може бути порушено лише денатурацією сорбованого білка. Не менш цікавими є властивості сорбентів, що містять метиловий ефір D-триптофану: за його імобілізації безпосередньо на BrCN-активовану агарозу спостерігається вкрай слабке зв'язування хімотрипсину, тоді як застосування спейсера - 6-аміногексанової кислоти - різко посилює ефективність зв'язувавння, що може бути наслідком одночасної взаємодії фермента з двома молекулами ліганда. Таке пояснення добре узгоджується з властивостями сорбентів з відносно низькою концентрацією імобілізованого феніл-бутил-аміну та імобілізованим без спейсеру D-триптофаніл-метиловим ефіром, котрі в повній відповідності до теорії виявляють вкрай слабкі зв'язуючі властивості. Іншими словами, спричинений зростанням ефективної концентрації імобілізованого ліганду перехід від афінного до гідрофобного зв'язування є ні чим іншим, як подібним до статистичних синзимів випадком моделювання ділянок підвищеної спорідненості до активного центра фермента.

Діагностика протеолітичного та зумовленого ним активаційного потенціалу фізіологічних систем потребує методів визначення надмалих кількостей протеїназ з чутливістю, що на кілька порядків перевищує традиційні методи з використанням білкових та синтетичних субстратів. Донедавна єдиним методом визначення надмалих кількостей серинових протеїназ був розроблений в нашій країні метод Веремеєнка-Беліцера з застосуванням субстрату протаміну (Weremeenko K.N., Belitzer W.A., 1963). Високий (до 90%) вміст аргініну статистично забезпечує вміщення аргінільних залишків субстрату як до зв'язуючої, так і до ефекторної ділянок ферменту. Чутливість методу дозволяє визначати нанограмові кількості ферменту, що на два порядки перевищує традиційні методи з білковими та синтетичними субстратами. Більшої чутливості вдалося досягти лише нещодавно за допомогою іммобілізованого на нерозчинній поверхні химерного рекомбінантного білка, що містить -галактозидазу, фрагмент ділянки активаційного розщеплення клітинного рецептора та половину авідин-біотинової пари (Altrogge L., 2000). Протеолітичний гідроліз ділянки активаційного розщеплення молекули подібного субстрату вивільняє в розчин молекулу галактозидази, що забезпечує визначення пікограмових кількостей серинових протеїназ. Характерно, що з трьох синтезованих химерних білків ефективним виявився лише один, що зайвий раз підтверджує важливість конформації ділянки активаційного розщеплення.

З'ясування структурних засад високої спорідненості серинових протеїназ трипсинового ряду до функціонально обумовлених зв'язків дає змогу пояснити окремі особливості терапевтичної дії відповідних ферментів та створює передумови до впровадження нового типу терапевтичних та біотехнологічних засобів на їх основі. В останні 20-30 років дедалі ширшого вжитку набувають так звані препарати системної ензимотерапії (СЕТ) - капсульовані форми комплексних препаратів протеїназ тваринного та рослинного походження (Вольф М., Рансбергер К., 1976, К.Н.Веремеенко и В.Н.Коваленко, 2000). Капсулювання захищає комплексні препарати від розщеплення кислими протеїназами шлунку, розчинення ж оболонки в нижній частині тонкого кишечника за рН порядку 8 супроводжується інтратестинальною абсорбцією протеїназ у кровообіг. Однак, незважаючи на виражений терапевтичний ефект, молекулярні механізми системної ензимотерапії залишаються малозрозумілими. Зокрема, вимагають пояснення фізіологічні прояви трипсин-вміщуючих препаратів СЕТ, вірніше - їх якісна відміна від дії трипсину за внутрішньосудинного введення. Як відомо, внутрішньосудинне введення трипсину супровождується цілою низкою важких побічних ефектів, що виключають застосування трипсина внутрішньосудинно у клінічній практиці (Струкова С., Митрошина Н., Кудряшов Б., 1983, Шереметьев Ю., Левин Г., Штыхно Ю., Удовиченко В., 1980). За перорального введення ж яких-небудь побічних ефектів не спостерігається - і це - за вельми значних кількостей введених ферментів, чия присутність в кровообізі реєструється як ферментативними, так і імунологічними методами (Kleine M., 1997). Необхідно також зазначити вражаюче співпадіння направленості терапевтичної дії препаратів СЕТ та внутрішньосудинного введення білкових інгібіторів протеїназ, головним чином - основного панкреатичного інгібітора трипсину (Веремеенко К.Н., 1971, Сыновец А.С., Левицкий А.П., 1985, К.Н.Веремеенко и В.Н.Коваленко, 2000). Отримані в нашій роботі дані щодо структурних засад високої спорідненості серинових протеїназ до функціонально визначених пептидних зв'язків дозволяють пояснити ці аномалії та поставити питання щодо введення в обіг нових терапевтичних та біотехнологічних засобів на основі деградованих форм трипсин-подібних ферментів. Відомо, що окрім основної одноланцюгової форми трипсину (так званого -трипсину), існують принаймні чотирі автолітично деградовані форми - утримувані за рахунок дисульфідних зв'язків молекули з одним чи декількома розщепленнями в вихідному поліпептидному ланцюзі (Maroux S., Desnuelle P., 1969, Schroeder D., Shaw E., 1968, Smith R.L., Shaw E., 1968). Каталітичні властивості деградованих форм трипсину істотно відмінні від вихідної -форми. Для хімотрипсину також відомо кілька ступенів деградації, відмінних між собою як по місцю та кількості розщеплень прошитої дисульфідними зв'язками молекули, так і за ферментативними властивостями відповідних форм (Miller D., Horbett T., Teller D., 1971). Умови нижньої частини тонкого кишечника є чи не ідеальними для автолізу трипсину, тим більше - за введення сумісно з хімотрипсином, папаїном та бромелаїном. Подібне до препаратів СЕТ введення капсульованого інсуліну вимагає застосування значних кількостей білкових інгібіторів для зменшення зумовлених протеолізом втрат пептиду (Платэ Н.А. и др., 1997). Тому припущення про часткову внутрішньокишечну протеолітичну деградацію введених у кровообіг ферментів повною мірою дозволяє пояснити як здатність організму без помітних наслідків витримувати великі дози препарату, так і механізм дії останнього. Подібно до трипсину за внутрішньосудинного введення, деградовані форми трипсину утворюють здатні до довгострокової циркуляції комплекси з ₂_макроглобуліном, що зберігають здатність до зв'язування, але різко поступаються комплексам -трипсину за гідролітичною дією відносно ділянок активаційного розщеплення білкових проформ. Тим самим препарати СЕТ обмежують пов'язану з численими патологіями надмірну активацію проферментів та профакторів, тобто діють як своєрідні інгібітори небажаних реакцій. Зрозуміло, що подібна дія може виявлятися лише за великого надлишку білків-блокувальників, що є необхідною умовою дії препаратів СЕТ (Ноуз К., Масиновски З., 1994, Kleine M., 1997). Тим самим істотно зменшується реальний ступінь утилізації цінних та досить дорогих ферментних препаратів. Більш перспективим підходом видається внутрішньосудинне або місцеве введення попередньо деградованих форм відповідних протеїназ. Не менш цікаві можливості відкриває й застосування похідних ферментів зі збереженими зв'язуючими властивостями за повного знищення гідролітичних, що надає відповідним білкам здатності до конкурентного блокування ділянок активаційного розщеплення білкових проформ. Подібні похідні можуть бути отримані генетичною заміною чи хімічною модифікацією амінокислотних залишків з групи “протонного реле” ферменту (гістидину-57, аспарагінової кислоти-102 та серину-195 згідно послідовності -хімотрипсину) (Craik C., Roczniak S., 1987, Carter P., Wells J., 1988, Ashton R., Sheraga H., 1995, Hokosawa K. et al. 2001.). Подібні похідні можуть бути застосовані у клінічній практиці для лікування та профілактики захворювань, обумовлених дисбалансом тканинного протеолізу, а саме - набряк, запальні процеси, надмірна активність фібринолітичної системи крові, онкозахворювання, тощо. Зокрема, дослідження функціональної складової препарату Фібринолізин (Fibrinolysinum) свідчить про її відповідність деградованим формам трипсин-подібних протеїназ.

В той же час здатність до комплексоутворення з ділянками активаційного розщеплення білкових проформ перетворює попередньо деградовані форми трипсин-подібних протеїназ на вельми перспективний засіб біотехнологічних процесів. Каталітична активація білкових проформ в активні форми становить важливу стадію отримання багатьох біологічно активних білків, що потребує застосування високоочищеного фермента-активатора та пов'язане з істотними втратами перетворюваного білка. Застосування автолітично деградованих форм створює принципову можливість різкого зменшення непродуктивного гідролізу та істотного збільшення виходу цільового продукту. З іншого боку, введення білкових препаратів за методом СЕТ дає змогу виключити з технологічного циклу стадію активації білкової проформи з відповідною активацією у нижній частині тонкого кишечника та внутрішньосудинної абсорбції активованого білка подібно до введення капсульованої форми інсуліну (Платэ Н.А и др., 1997).

Проведено дослідження молекулярного складу фібринолітичного препарату Фібринолізин. Отримані дані свідчать про повну відсутність в досліджуваних препаратах білків з лізин-зв'язуючими властивостями та молекулярною масою, відповідною плазміногену чи плазміну. Навпаки, отримана картина відповідає трипсинові, причому не одноланцюговій в-формі, а частково гідролізованим похідним, що утримуються за рахунок дисульфідних зв'язків. Беручи до уваги роль лізин-зв'язуючих ділянок плазміногену (плазміну) в регуляції фібринолізу, можна заключити, що про аналогію ферментативного гідролізу фібрину подібними препаратами з фізіологічним фібринолізом не може бути й мови. З іншого боку, оскільки показано, що діючу складову препарату становлять автолітично деградовані форми трипсину, а не активований трипсином плазмін, то отримані результати добре узгоджуються з висловленим припущенням про можливе терапевтичне використання попередньо деградованих форм трипсин-подібних протеїназ.

Таким чином, усвідомлення структурних засад високої спорідненості трипсин-подібних протеолітичних ферментів до функціонально визначених структурних угруповань не лише дозволяє пояснити окремі аномалії у дії ферментів, але й створює нові підходи до розробки перспективних терапевтичних та біотехнологічних засобів.

Відомо, що надмірна активаційна дія серинових протеїназ зумовлює числені патології - запальні процеси, панкреатити, порушення системи гемостазу, онкозахворювання, тощо (Сыновец А.С., Левицкий А.П., 1979). Один з практичних наслідків встановленого в даній роботі принципу структурної подоби реактивних центрів білкових інгібіторів протеїназ та ділянок активаційного розщеплення білкових проформ полягає в необхідності великого надлишку білкових інгібіторів для ефективного пригнічення надмірної активаторної дії, що за умов in vivo є практично недосяжним. З іншого боку, терапевтичне застосування значної кількості відомих низькомолекулярних синтетичних інгібіторів є практично неможливим через зумовлену високою мембранотропністю низькомолекулярних сполук клітинну токсичність. Чи не єдиний синтетичний інгібітор активних центрів серинових проеїназ, що набув широкого терапевтичного вжитку - Аргатробан-7 (Шандер А., 1999) - є похідним аргініну з жорстко орієнтованою до ефекторної ділянки ферменту об'ємною гідрофобною групою. Вибір даної сполуки став наслідком систематичного перебору великої кількості потенційно придатних сполук та їх оцінки з точки зору як інгібіторних властивостей, так і мінімально припустимої побічної дії (Kikumoto R., et al., 1984). Подібний підхід є класичним, однак потребує синтезу та дослідження величезної кількості сполук. З'ясування локалізації та ролі ефекторної ділянки серинових протеїназ значно спрощує проблему та дозволяє проводити синтез інгібіторів з передбачуваними властивостями, істотно спрощуючи вибір досліджуваних сполук (Okada Y., Matsumoto Y., 2000). Ще перспективнішим рішенням видається комбінація подібного підходу зі зменшенням клітинної токсичності синтетичних інгібіторів внаслідок їх кон'югації з високомолекулярними та малоіммуногенними полімерами, що дозволяє різко зменшити мембранотропність отримуваної сполуки з відповідним зниженням її цитотоксичності.

Для практичної перевірки подібного рішення обрано та синтезовано регулярний співполімер N-вініл-пірролідону та малеїнового ангідриду з наперед заданою кількістю ангідридних груп (Conix A., Smets G., 1955), що застосовується для синтезу гранульованих макросітчастих носіїв для твердофазного синтезу пептидів (Самойлова Н.А. та інші, 1981), кон'югації нерозчинних у воді високомолекулярних хромо- та флуорогенних груп з лабільними у неводному середовищі білками (Gershkovich A., 2000), а також для зв'язування L-лізину при синтезі афінного сорбенту для виділення плазміногену (Кудинов С.А, Мацуй С.П., Бабенко И. и др., 1983). Одержаний у такий спосіб білий порошок є регулярним співполімером малеїнового ангідриду з N-вініл-пірролідоном за молекулярного співвідношення компонентів 1:2-1:3. Середньостатистична молекулярна маса коливається у межах 270-320 кДа. Вихід співполімеру становив 47-64 відсотків від теоретичного. Кон'югацію співполімеру з низькомолекулярним інгібітором серинових протеїназ провадили у дві стадії - ковалентним зв'язуванням за -аміногрупу L-лізину та утворенням відповідного етерифікованого похідного по карбоксильних групах амінокислоти за стандартною методикою етерифікації амінокислот розчином хлористого водню в розчині відповідного спирту в абсолютному діоксані. Вміст активної компоненти визначили за даними амінокислотного аналізу гідролізату наважки кінцевого препарату.

Антиангіогенну дію отриманого препарату визначали на прикладі пригнічення неоваскуляризації хоріоналантоїсної мембрани курячих ембріонів (Ausprunk D., Folkman J., 1977). У ембріонів 9-10-ї доби розвитку за допомогою ангіогенного фактору, виділеного з тканини пухлини (Лисняк И.А., 1986), у дозі 10 нг/мл індуковано високу ангіогенну активність порівняно з контролем. Додаванням препарату у дозі 20 та 40 мкг досягнуто дозозалежне пригнічення ангіогенної активності, індукованої ангіогенним фактором (на 50% і 90%, відповідно).

Антифібринолітичну дію препарату оцінювали за часом лізису фібринового згустку (Muramatu M., Onishi T., Makino S., 1965). Введення до системи препарату в концентрації 2 mM за вмістом лізину призводило до збільшення часу лізису в 24 рази порівняно з контролем (530±34 та 12720±415 секунд, відповідно).

Оцінку гострої токсичності препарату проводили згідно до ГОСТ 12.1.007-76. Розрахунок значень токсичності проводили з використанням методу Лігфільда-Уілкінсона (Беленький М.Д., 1963). ЛД₅₀ становила 280 мг/кг, ЛД₁₆ - 200 мг/кг, ЛД₉₉ встановити не вдалося.

Протипухлинну та антиметастатичну дію препарату досліджували на прикладі пригнічення метастазування та росту карциноми Льюїс (Dumont P., Abessi G. and Jeger R., 1983). Мишам лінії C57Bl/6 з перещепленою карциномою Льюїс вводили препарат у дозі 125 мг/кг внутрішньовенно з інтервалом 48 годин 10 разів, починаючи з сьомої доби після перещеплення. Як свідчать отримані результати (Таблиця 3), досягнуто гальмування росту первинної пухлини на 61.1% порівняно з контролем, пригнічення метастазування на 86.5% за кількістю та 87.2% за сумарним об'ємом метастатичного ураження. Побічних імуногенних ефектів не спостерігалось.

Наведені дані свідчать, що створений кон'югат низькомолекулярного інгібітору серинових протеїназ з високомолекулярним водорозчинним полімером має виражену антиметастатичну, антиангіогенну та антифібринолітичну дію за низької імуногенності та токсичності. Побічна дія отриманого у даний спосіб високомолекулярного інгібітору обмежується помірним збільшенням кровонаповнення печінки. Запропонований підхід видається перспективним для подальшої розробки ефективних терапевтичних засобів лікування та профілактики захворювань, пов'язаних з дисбалансом в регуляції активності протеолітичних ферментів. Варто зазначити відносну простоту розробленого препарату порівняно до об'ємних макрополімерів з інкорпорованими білковими інгібіторами протеїназ (Платтэ Н.А. и др., 2000).

Таблиця 3

Вплив полімерного інгібітора на зростання та метастазування карциноми Л'юїс на мишах лінії C57Bl/6

* - різниця по відношенню до контрольної групи є статистично вірогідною (p<0.05).

Не менш важливий наслідок розглянутого підходу полягає в можливості створення повноцінних синтетичних замінників білкових препаратів, що має гостру актуальність через зумовлені повільними вірусними хворобами обмеження та заборони щодо сировини тваринного та донорного походження (Anderson R., Donelly C., Ferguson N., 1996, Willkommen H., 2003, Hayes T., 2003).

Порушення клітинного фолдингу білків як причина молекулярних дисфункцій та зумовлених ними патологій

Встановлення комплексного характеру будови ділянок підвищеної спорідненості до ферментів не лише пояснює числені аномалії у функціонуванні серинових протеїназ та опосередкованих ними фізіологічних та патогенних процесів, але й певною мірою дає змогу наблизитися до розуміння молекулярних механізмів спонгіформних енцефалопатій. Як відомо, головна особливість захворювань цієї групи полягає в унікальному характері інфекційного агенту - так званої патогенної форми пріонового білка (PrP^Sс), що викликає складний та незворотній нейродегенераційний процес зі 100%-ковою летальністю (Prusiner S., 1998). Єдина відміна патогенної форми пріонового білка від присутньої у всіх без винятку ссавців клітинної форми (PrP^C) полягає у конформаційній укладці поліпептидного ланцюга: в нормальній формі домінує -спіралізація і лише 3% ланцюга мають -укладку, тоді як в патогенній формі доля останньої зростає до 43% (Pan K., et al., 1993). В генетичному та хімічному відношенні обидві форми ідентичні. Доведення інфекційної дії чисто білкового агенту може служити хрестоматійним прикладом коректної перевірки незвичного та незрозумілого факту, однак відсутність пояснення основних моментів пріон-зумовленого патогенезу закономірно породжує сумніви щодо чисто білкової природи переносника захворювання чи, принаймі, щодо механізмів його дії. В основі найбільш визнаної - так званої “чисто білкової” - гіпотези пріонового патогенезу лежить припущення щодо зумовленої патогенною формою пріонового білка асоціативної трансформації клітинної форми в патогенну (Horiuchi M. et al., 2000) Дійсно, за сумісної інкубації обох форм протеїназостійкість PrP^C істотно зростає, що розглядається як свідоцтво про трансформацію в більш стійку до протеолізу патогенну ізоформу. Однак числені спроби досягти збільшення кількості інфекційного матеріалу (так званого пріонового титру) лишилися безуспішними (Hill A., Antonioni M., 1999, Caughey B., et al., 2001). Тобто ключове положення “чисто білкової” гіпотези - трансформація клітинної ізоформи в патогенну - лишається недоведеним. Не має пояснення й динаміка перебігу патогенного процесу з його протяжним латентним періодом та переходом до незворотньої та прогресуючої деградації нервових тканин. Не мають пояснення й такі особливості пріон-обумовлених захворювань, як існування міжвидового бар'єру (Prusiner S., et al., 1990), мінімальної інфекційної дози, відмінних між собою ліній захворювання в межах одного виду тварин та їх здатність до взаємної трансформації при повторних інфекційних пасажах (Peretz D., et al., 2001). Для пояснення цих особливостей постульовано існування так званого фактора Х, що буцімто відіграє роль шаперона у трансформації клітинної ізоформи в патогенну (Telling G., Scott M., 1995), однак інтенсивні пошуки цього, як припускається - білкового, фактора лишаються безрезультатними. Здатність до напрацювання власного пріонового білка визнається необхідною передумовою для розвитку патогенезу, однак подібно до механізму самовідтворювання патогенної ізоформи, механізм її нейродегенеративної дії також лишається нез'ясованим (Dormont D., 2002). Наведені міркування змушують заключити, що уявлення про механізми перебігу пріон-зумовленого патогенезу являють собою рідкісне нагромадження недоведених припущень та гіпотез.

Отримані в нашому дослідженні експериментальні дані та зроблені на їх підставі висновки певною мірою дають змогу пояснити окремі моменти пріонового патогенезу на підставі відомих і вже доведених для випадку спонгіформних енцефалопатій процесів без введення припущень про невідтворювані трансформації та білки, котрі неможливо виявити. За умов складної послідовності взаємообумовлених процесів визначення причинно-наслідкових зв'язків являє собою складну, якщо не нерозв'язувану, задачу. Якимось фактам надається надмірна увага, інші ж незаслужено лишаються у затінку. Мабуть, саме надмірна увага до зростання протеїназостійкості клітинної ізоформи пріонового білка в присутності патогенної зумовила принципово хибне припущення про асоціативну трансформацію клітинної ізоформи в патогенну (Mc Kinley M., et al., 1983). Однак кількість інфекційного матеріалу лишається незмінною (Hill A., et al., 1999, Oesch B., et al., 1985), а пріоновий білок - далеко не єдиний, що піддається в умовах in vitro прогресуючій агрегації, індукованій -структурованою білковою матрицею (Koga T., et al., 2002). Агрегація білків сама по собі веде до збільшення протеїназостійкості через чисто геометричне зменшення доступності поверхні білка до контакту з протеїназами, однак значно важливішим видається доведений факт остаточного формування патогенної конформації під час вбудови новосинтезованого пріонового білка в зовнішню клітинну мембрану (Caughey B., Raymond G., 1991). Нативне формування функціонально активної структури білка є складним процесом, що проходить у взаємодії з шапероновими компонентами фолдингової системи клітини. Пріонове інфікування пов'язане зі значним пошкодженням останньої (Tatzelt J., et al., 1995, Horvich A., Weissman J., 1997, Harrison P., et al., 2000). Альтернативою нативному фолдингу новосинтезованих білкових молекул може бути мембранний фолдинг - структурування поліпептидного ланцюга у взаємодії з фосфоліпідним подвійним шаром клітинних мембран (Rodionova N.A., et al., 1995, Kleinschmidt J., Tamm L., 1996). Перебіг мембранного фолдингу відбувається за своїми законами та призводить до формування структур, що мають істотні відміни від сформованих системою клітинного фолдингу. Подібним білкам притаманні високий ступінь стабілізації структури, підвищена гідрофобність поверхні, підвищена доля -складчастих структур, а також підвищена концентрація заряджених амінокислотних залишків на внутрішньоклітинній частині молекули (von Heine G., 1992, Ладохін О.С., 2001). За своїми структурними та фізико-хімічними властивостями патогенна форма пріонового білка є типовим продуктом мембранного фолдингу. Остання обставина не лише пояснює невдачу числених спроб формування патогенної форми пріонового білка in vitro, але й дозволяє пояснити основні моменти пріон-зумовленого патогенезу. Так, формування структури пріонового білка у взаємодії з мембранним фосфоліпідним подвійним шаром вичерпно пояснює високу мембранотропність інфекційного агенту, його здатність до циркуляції в кровотоці у складі фрагментів фосфоліпідних мембран, високу спорідненість до гідрофобної металевої поверхні та схильність до агрегації. Не менш важливий наслідок мембранного фолдингу PrP^Sc полягає в статистично забезпеченій можливості формування на поверхні білка ділянок високоспецифічної взаємодії з функціонально чужородними білками. За високої мембранотропності патогенної форми та високої стабілізації її структури наявність подібних детермінант перетворює білок на трансмембранний транспортер позаклітинних ферментів у внутрішньоклітинній простір. Тим самим створюються передумови для порушення основного принципу регуляції біологічних процесів - компартменталізації дії біологічно активних молекул. Зрозуміло, що за такого порушення про нормальний перебіг клітинних процесів, зокрема - фолдингу новосинтезованих білків - не може бути й мови, що й забезпечує самопідтримку та незворотній характер фолдингового патогенезу. Наведена послідовність пріон-зумовленого патогенезу була сформульована та опублікована автором за три роки до виявлення в патогенній формі пріонового білка структурних груп, що ефективно зв'язуються лізин-зв'язуючими ділянками плазміногену (Fischer M., Roecki C., et al., 2000).

З іншого боку, можливість трансмембранного переносу позаклітинних протеїназ далеко не вичерпує зумовлені патогенною формою пріонового білка шляхи порушення нормального клітинного фолдингу новосинтезованих білків. Як відомо, шаперонові білки практично інертні по відношенню до білків, що знаходяться в нативній конформації, однак енергійно взаємодіють з денатурованими білками (Demchenko A.P., 2000, 2001). Патогенна форма пріонового білка - як сама по собі, так і в асоціаті з протеолітичними ферментами - являє собою варіант денатурованого білка, що гарантовано розпізнається відповідними компонентами фолдингової системи з невідворотнім блокуванням або пошкодженням останніх. Мабуть, саме цими причинами може бути пояснено як формування змішаних PrP^Sс-HSP-70 агрегатів (Ma J., Lindquist S., 2001), так і токсичність окремих фрагментів пріонового білка (Forloni G., Angeretti N., 1993). Подібно до будь-якої біологічної системи, ємність фолдингової системи клітини не є безмежною і після її перевищення новосинтезований білок не може отримувати завершеного фолдингу, що добре пояснює схильність трансгенних мишей, що оверекспресують пріоновий білок хом'яка, до спонтанної форми захворювання (Westway D., et al., 1994). Альтернативний шлях мембранного фолдингу веде до формування патогенної ізоформи, при чому дефіцит чи відсутність нормальної форми не зумовлює негайну смерть клітини, оскільки позбавлені гена пріонового білка трансгенні миші є достатньо життєздатними (Bueler H., Aguzzi A., Sailer A., 1993). Перетворення інфікованої клітини на відносно довгоживучий брідер PrP^Sс добре пояснює як залежність швидкості розвитку захворювання від швидкості біосинтезу власного пріонового білка, так і нелінійний характер залежності латентного періоду від розміру вихідної інфекційної дози. Пріон-опосередкований перенос позаклітинних протеїназ веде до незворотнього та прогресуючого пошкодження клітини як внаслідок прямого протеолізу, так і фізіологічно недоречної активації внутрішньоклітинних проферментів та профакторів, що дає змогу пояснити як прогресуючу деградацію та загибель клітини, так і пов'язаний з пріоновим патогенезом астроцитоз. Залежність ступеню порушення функціонування фолдингової системи клітини від ступеню відповідності первинних структур власного та інфекційного пріонових білків не лише вичерпно пояснює існування міжвидового бар'єру, але й робить його природною та невід'ємною рисою пріон-зумовленого патогенезу. Також стає зрозумілим подолання міжвидового бар'єру зі збільшенням кількості інфекційного матеріалу як різновиду класичного випадку зміщення рівноваги за збільшення концентрації малоспецифічного компоненту. Як існування мінімальної інфекційної дози, так і аномальна динаміка перебігу пріонових захворювань можуть бути пояснені необхідністю концентрування в клітині певної критичної кількості інфекційного матеріалу, необхідної для порушення фолдингу новосинтезованого білка та перетворення клітини на довгоживучий брідер PrP^Sc. Можливість різного ступеня пошкодження фолдингу пріонового білка пояснює формування відмінних між собою патогенних ізоформ і, як наслідок, появу різних ліній захворювання. Нещодавно виявлена можливість безпріонового запуску пріон-опосередкованого патогенезу (Ma J., Wollmann R., Lindquist S., 2002, Ma J., Lindquist S., 2002) може розцінюватися як прямий доказ наведеного механізму. Одна з основних умов енергетичного забезпечення та постійного оновлення білкового складу клітини полягає в розщепленні протеасомними комплексами денатурованих білків (Кордюм В.А., 2002). Інгібування протеїназ протеасом зумовлює накопичення “клітинного сміття”, що є рівноцінним конкурентному інгібуванню шаперонових компонентів клітини з подальшим мембранним фолдингом новосинтезованого білка. Бувши запущеним, пріоновий патогенез розвивається за своїми власними законами навіть після реактивації протеасом. Остання обставина змушує підняти питання про додаткові фактори ризику, пов'язані з порушенням клітинного фолдингу білків та необхідності розробки належних методів для оцінки та моделювання можливостей формування відповідних білкових структур.

Заключення

Результати проведеного дослідження дозволяють зробити ряд висновків як теоретичного, так і практичного харктеру. Порівняльне дослідження властивостей групи новостворених сорбентів дозволило не лише досягти успішного рішення практичної задачі - виявлення нових патентоспроможних лігандів для афінно-хроматографічного очищення хімотрипсин-трипсинподібних серинових протеїназ - але й відмітити цікаву закономірність: в ряді сорбентів з лігандами гідрофобної природи за наявності в молекулі ліганду двох гідрофобних груп зростання ступеню доступності цих груп для контакту з білком та збільшення відстані між ними веде до падіння видової селективності сорбенту, тоді як загальна сорбційна здатність по відношенню до протеїназ зростає. Дана закономірність не могла бути пояснена зв'язуючими властивостями "гідрофобної кишені" ферменту, що змусило припустити участь в сорбційному процесі додаткової ділянки міжмолекулярної взаємодії. Аналіз даних про числені аномалії в субстратних та інгібіторних властивостях низькомолекулярних сполук дозволив визнати найбільш вірогідним місцем знаходження цієї ділянки зону взаємодії з "відходячою групою" субстрату. Відмова від дещо штучного поділу даних по взаємодії серинових протеїназ з низькомолекулярними сполуками та білковими інгібіторами зумовила припущення про ідентичність цієї ділянки S2'-локусу найближчого оточення гідролітичного центра. Статистична обробка даних про комплементарні S2'-ділянці фермента P2'-положення реактивних центрів білкових інгібіторів свідчила про подібність лігандної специфічності досліджуваної ділянки "гідрофобній кишені" хімотрипсину, тобто виявлено спорідненість до амінокислотних залишків гідрофобних та - рідше - позитивно заряджених амінокислот. Для експериментальної перевірки припущення про роль S2'-ділянки серинових протеїназ розроблено принципи та застосовано принципово новий, що не має аналогів, метод дослідження активності ферменту за допомогою фермент-фіксованого зонду. Досліджено вплив на активність -хімотрипсину групи ефекторів, що містять дві гідрофобні групи, одна з котрих гарантовано зв'язується "гідрофобною кишенею" ферменту, що зумовлює високу вірогідність вміщення другої групи в досліджувану S2'-ділянку. Отримані результати не лише підтвердили обгрунтоване автором припущення щодо ідентичності невідомої додаткової ділянки міжмолекулярної взаємодії S2'-ділянці активного центру, але й дозволили ідентифікувати її як давно відому, але не досліджену ні за локалізацією в молекулі фермента, ні за функціональною роллю ефекторну ділянку, обгрунтувати положення про виключно важливе значення цієї ділянки як складової частини механізму регуляції протеолізу. Заповнення S2'-ділянки адекватним за специфічністю лігандом призводить до посилення як каталітичних властивостей гідролітичного центру, так і зв'язуючих властивостей "гідрофобної кишені" ферменту. Показано щонайменше три види фізіологічно важливих проявів S2'-стимуляції серинових протеїназ. За взаємодії з реактивними центрами білкових інгібіторів протеїназ S2'-стимуляція забезпечує утворення стабільних фермент-інгібіторних комплексів, тобто є невід'ємною складовою частиною нативного механізму обмеження протеолізу. У випадку ділянок активаційного розщеплення білків-попередників S2'-стимуляція фермента-активатора забезпечує ефективне розпізнавання та швидкий гідроліз строго визначеного зв'язку, що є необхідною передумовою активаційного процесу. За взаємодії з "приманочною ділянкою" ₂-макроглобуліну S2'-стимуляція протеїнази сприяє конформаційним змінам в глобуліні, котрі ведуть до комплексоутворення з ферментом. Іншими словами - участь ефекторної ділянки в перебізі каталітичного процесу є не чимось надзвичайним, а становить обов'язкову та невід'ємну умову ефективного розпізнавання ферментом фізіологічно обумовлених пептидних зв'язків білка-цілі. Показано існування структури підвищеної спорідненості до активного центру фермента, що складається з адекватними за лігандною специфічністю та розміщеної в суворо заданій (так званій канонічній) конформації пари амінокислотних залишків (Gils A., Knockaert I., Declerk P., 1996). Будь-які фактори, що зумовлюють порушення цієї конформації, призводять до різкого падіння спорідненості білка до протеїнази (Potempa J., 1980, 1991, Burch M., 1988, Holmes W., 1987, та інші). З іншого боку, статистичне формування подібного роду структур забезпечує як надзвичайне зв'язування серинових протеїназ (гідрофобна хроматографія), так і посилену гідролітичну дію останніх (протаміновий метод). Розглянуто окремі випадки проявів S2'-стимуляції в штучних умовах, а саме - субстратну активацію протеїназ, промотування гідрофобними сполуками гідролізу ацил-ферментних комплексів, тощо.

Отримані дані та зроблені на їх підставі висновки добре узгоджуються з найновітнішими даними щодо загальних принципів міжбілкового розпізнавання та комплексоутворення. Так, за великого різноманіття високоспецифічних міжбілкових комплексоутворень розмірність площин міжмолекулярного контакту підпадає вираженій подобі, що для більшості випадків з боку зв'язуваного білка забезпечується 2-3 компактно розміщеними амінокислотними залишками (Janin J., 1995, Lo Conte L., Chotia C., Janin J., 1999, Stites W., 1997). Тобто доведено пряму аналогію як з розглянутим в даній роботі випадком структур, комплементарних активним центрам серинових протеїназ, так і з раніше встановленою автором структурою лігандів лізин-зв'язуючих ділянок плазміногену (Веревка С.В., 1988). Останнім часом структурне обгрунтування високоспецифічних комплексоутворень набуло назви концепції наріжних взаємодій (keystone interactions), при чому зона безпосереднього контакту розглядається як якісно новий структурний субдомен (Smith W., Nassar N., Bretesher A., et al., 2003). Тобто отримані в даній роботі дані та зроблені на їх підставі висновки повною мірою підтверджуються найновітнішими здобутками в галузі дослідження міжбілкових взаємодій та являють собою розвиток класичного положення Кошланада про взаємну індуковану відповідність фермента та субстрата. Подібна точка зору дозволила пояснити аномалії, що спостерігаються за терапії методами системної ензимотерапії як наслідку формування відповідних комплексів абсорбованих у кровообіг деградованих форм трипсину, а також запропонувати низку методичних підходів на його основі.

Обгрунтований в роботі принцип структурної подоби ділянок активаційного розщеплення білкових проформ реактивним центрам білкових інгібіторів протеїназ дозволив сформулювати структурні вимоги та провести синтез ковалентного кон'югата водорозчинного та малоіммуногенного полімера з низькомолекулярними інгібіторами серинових протеїназ, чим досягнуто збереження інгібіторних властивостей з істотним зменшенням мембранотропності, а отже - і цитотоксичності. Результати дослідження властивостей отриманої сполуки на прикладі карциноми типу Л'юїс дають змогу говорити про перспективність застосованого підходу.

Отримані при виконанні роботи дані щодо принципів міжбілкового розпізнавання та комплексоутворення дають змогу пояснити основні особливості пріон-зумовленого патогенезу як наслідку замкнутого та самопідтримуючого циклу порушень клітинних процесів, зумовлених пошкодженням клітинного фолдингу пріонового білка. Практичні наслідки подібної точки зору видаються досить вагомими. Наявність в PrP^Sс ділянок ефективної взаємодії з функціонально чужородними білками перетворює препарати компонентів фібринолітичної системи донорного походження (плазміноген, плазмін, їх похідні, тканинний активатор плазміногену та інші) на об'єкти підвищеного інфекційного ризику, особливо - за офтальмологічного введення, що гарантує ініціацію патогенезу за найменших інфекційних доз (Fraser H., 1982). Тому розробка методів гарантованого очищення білкових препаратів від можливої домішки PrP^Sс становить виключно актуальну задачу, що може бути практично вирішена на основі наукових здобутків даної роботи. Так, афінно-хроматографічний підхід до очистки білкових розчинів від домішки компонентів фібринолітичної системи та асоційованої з ними PrP^Sс з застосуванням іммобілізованого пара-аміно-бензамідину може бути істотно розширений, оскільки доведена тотожність бензамідин-зв'язуючих ділянок плазміногену з аргініл-зв'язуючими (Веревка С.В., 1988) розширює асортимент лігандів та сорбентів, придатних до плазміноген-опосередкованої очистки білкових препаратів від домішку PrP^Sс. Не менш перспективним видається застосування синтетичних моделей лізин-зв'язуючих ділянок - подібних до регулярних синзимів дипольних молекул, здатних до ефективного комплексоутворення з дипольними компонентами відповідної ділянки пріонового білка. Підвищена спорідненість PrP^Sс до гідрофобних поверхонь (Brown P. et al., 1992) також перетворюється з чергової загадки пріонів на наслідок формування гідрофобної поверхні білка під впливом мембранного фолдингу, що, в свою чергу, може бути утилізовано для гарантованого забезпечення білкових розчинів від пріонової інфекції. Та ж сама спорідненість створює передумови для розробки методів реєстрації найменших кількостей PrP^Sс за допомогою сучасних біофізичних методів. Таким чином, усвідомлення молекулярних механізмів перебігу пріон-зумовленого патогенезу створює необхідну основу для вирішення цілої низки практичних проблем.

Особливої уваги заслуговує фолдинговий аспект пріонової пароблеми, оскільки будь-які фактори, здатні до порушення нормального перебігу клітинного фолдингу створюють ризик утворення альтернативних конформацій новосинтезованого білка з подальшим розвитком відповідної патології. Для пріон-зумовленого патогенезу існують принаймні три шляхи безпріонової ініціації захворювання - через стресове порушення функціонування шаперонової системи (Miller M.W., Williams E.S., 2003), внаслідок перевищення її ємності за оверекспресії пріонового білка (Hsiao K., Scott M., Foster G., et al., 1990, Westway D., De Armond S., Cayetano-Canals J., et al., 1994) та внаслідок токсичного отруєння ферментативного комплексу протеасом (Ma J., Wollmann R., Lindquist S., 2002, Ma J., Lindquist S., 2002). Необхідна умова реалізації подібного механізму патогенезу полягає в захисті клітин-продуцентів PrP^Sс від дії імунної системи організму. Для клітин центральної нервової системи подібний захист забезпечується гемато-енцефалічним бар'єром. Відсутність подібного захисту може призвести до розвитку аутоімунної реакції на місфолдингові білки, а за більш широкого ушкодження фолдингової системи - й на клітину-продуцент, аж до знищення останньої включно. З іншого боку, зменшення швидкості біосинтезу може створити умови для нормалізації фолдингових процесів, а отже - й для припинення чи обмеження відповідної патології. Співпадіння подібного сценарію з перебігом відомих аутоімунних захворювань - в першу чергу цукрового діабету І та ІІ типів (Lernmark A., 1999, Notkins A.L., Lernmark A., 2001) - навряд чи є випадковим та заслуговує на подальше дослідження.

Внаслідок проведеної роботи отримано нові дані щодо структурних засад забезпечення міжбілкового розпізнавання та комплексоутворення, локалізації в молекулі ділянок міжмолекулярної взаємодії серинових протеїназ, їх функціональної ролі. Запропоновано нові підходи до рішення ряду практичних задач, пов'язаних з порушенням регуляції міжбілкових процесів.

Висновки

1. Вперше встановлено локалізацію ефекторної ділянки серинових протеїназ та з'ясовано її роль як обов'язкової та невід'ємної складової частини молекулярних механізмів регуляції протеолізу та опосередкованих протеолізом процесів. Показано, що за місцем знаходження ефекторна ділянка серинових протеїназ відповідає S2'-позиції моделі Шехтера-Бергера. Лігандна специфічність ефекторної ділянки подібна до "гідрофобної кишені" хімотрипсин-трипсинподібних протеїназ, тобто виявляє виражену спорідненість до гідрофобних та - рідше - позитивно заряджених амінокислотних залишків. За силою зв'язування адекватних лігандів ефекторна ділянка значно поступається "гідрофобній кишені" ферменту, що найхарактерніше для -хімотрипсину.

2. Вміщення в ефекторну ділянку відповідного за специфічністю ліганда призводить до посилення як зв'язуючих, так і каталітичних властивостей фермента (S2'-стимуляції), причому доведено, що активація відбувається на всіх трьох стадіях процесу - нековалентному зв'язуванні субстрату, утворенні ацил-ензиму та гідролізі останнього. S2'-стимуляція відіграє ключову роль щонайменше в трьох видах фізіологічно важливих регуляційних процесів - обмеженні протеолізу за рахунок утворення фермент-інгібіторних комплексів, активаційних розщепленнях в проформах біологічно активних білків та протеолітично активованих рецепторів, забезпеченні "пасткового" механізму інактивації протеїназ ₂-макроглобуліном.

3. Вперше обгрунтовано положення про будову єдиної для всіх серинових протеїназ комплексної структури, що складається з адекватної за лігандною специфічністю S1- та S2'-ділянкам активного центру та розміщеної в оптимальній конформації пари амінокислотних залишків як необхідної умови високоефективного розпізнавання та взаємодії серинових протеїназ з білком-ціллю.

4. Вперше показано структурну аналогію між комплементарними активним центрам серинових протеїназ комплексними структурами, лігандами лізин-зв'язуючих ділянок та рецепторними групами RGD-типу. Порушення конформації подібної структури рівноцінне її знищенню та позбавленню білка-цілі здатності до ефективної взаємодії з відповідною протеїназою, тоді як її формування, навпаки, надає білкові здатності до ефективної участі в опосередкованих цими взаємодіями процесах.

5. Запропоновано новий, що не має аналогів, метод дослідження ділянок міжбілкової взаємодії з використанням фермент-фіксованого зонду, котрий базується на забезпеченні високої ймовірності вміщення потрібної структури в слабозв'язуючу ділянку за рахунок створення високої локальної концентрації ліганду гарантованим захопленням частини його молекули сильнозв'язуючою ділянкою фермента.

6. Показано, що числені випадки ефекторного впливу на каталітичні та зв'язуючі властивості серинових протеїназ в штучних умовах - субстратна активація при гідролізі низькомолекулярних субстратів, промотування гідрофобними сполуками гідролізу ацил-ферментних комплексів, гідрофобна хроматографія серинових протеїназ - є проявом дії ефекторної ділянки в нефізіологічних штучних умовах.

7. Досліджено нову групу афінно-хроматографічних лігандів та доведено придатність сорбентів на їх основі для афінно-хроматографічного виділення трипсин- та хімотрипсин-подібних протеїназ. Сформульовано принципи створення сорбентів з наперед заданою лігандною специфічністю. Показано, що перетворення афінних лігандів на гідрофобні визначається можливістю захоплення двох молекул імобілізованого ліганду як зв'язуючою, так і ефекторною ділянками ферменту. Показано, що у випадку афінної сорбції серинових протеїназ на сорбентах з низькомолекулярними лігандами роль спейсера полягає не стільки в забезпеченні стеричної доступності ліганда, скільки в збільшенні ймовірності реалізації S2'-стимульованого стану сорбованого фермента.

8. На основі положення про структурну подібність ділянок активаційного розщеплення білкових проформ та реактивних центрів білкових інгібіторів протеїназ обгрунтовано структурні вимоги, синтезовано та досліджено за впливом на перебіг патогенного процесу принципово новий тип інгібітора трипсин-подібних протеїназ зі зменшеною мембранотропністю та цитотоксичністю. Показано перспективність подібного підходу для створення внутрішньосудинних препаратів для терапії патологій, пов'язаних з дисбалансом активаційних та інгібіторних процесів.

9. Обгрунтовано пояснення аномалій, що спостерігаються у дії ферментних препаратів системної ензимотерапії. Сформульовано припущення, що найбільш ймовірною дійовою складовою частиною препаратів СЕТ є протеолітично деградовані форми трипсину, що істотно відрізняються від вихідної форми за зв'язуючими та гідролітичними властивостями. Запропоновано групу методичних підходів, що базуються на формуванні міжбілкових комплексів між активним центром подібних похідних та комплексною ділянкою високої спорідненості.

10. Співставлення отриманих даних та зроблених на їх підставі висновків з класичними положеннями міжбілкового комплексоутворення та клітинного процесингу білків дозволило пояснити основні особливості механізму патогенезу пріон-опосередкованих захворювань як прогресуючого та самопідтримуючого циклу порушень клітинних процесів, зумовлених порушенням нормального клітинного фолдингу новосинтезованого пріонового білка. Запропонований механізм грунтується на відомих особливостях пріон-зумовленого патогенезу, що розглядається як клітинний, а не виключно міжбілковий, процес.

11. Формування патогенної конформації пріонового білка під впливом гідрофобного ліпідного подвійного шару клітини (мембранний фолдинг) дає змогу пояснити більшість з відомих властивостей цього унікального за своєю чисто білковою природою патогенного агента та запропонувати ряд методичних підходів до його виявлення та вилучення з сировини тваринного та донорного походження.

12. Обгрунтування положення про клітинний характер пріон-зумовленого патогенезу дозволяє відмовитись від загальновизнаної точки зору про його унікальність та відвести йому належне місце серед досить широкої групи місфолдингових та аутоімунних захворювань. Обговорено фактори ризику, зумовлених порушенням нормального клітинного фолдингу новосинтезованих білків.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Колодзейская М.В., Веревка С.В., Кудинов С.А. Хроматография трипсин-химотрипсинподобных протеаз лососевых на древесных опилках // Прикладная биохимия и микробиология. 1989. 25, N5. С. 624-627.

2. Колодзейская М.В., Веревка С.В. Гидрофобные взаимодействия -химотрипсина с низкомолекулярными соединениями // Укр.биохим.журн. 1990. 62, N 5. С. 3-14.

3. Колодзейская М.В., Веревка С.В. Сравнительное исследование свойств сериновых протеиназ низших и высших позвоночных // Укр.биохим.журн. 1990.62, N 6. С. 31-37.