Андрогенез та ембріокультура у кукурудзи in vitro

Розроблено методичні основи пророщування незрілих зародків кукурудзи в ембріокультурі in vitro, яка використовується при переведенні ліній кукурудзи на цитоплазматичну чоловічу стерильність та в інших селекційних програмах.

Створено біологічні технології отримання андрогенних рослин кукурудзи в культурі пиляків in vitro та одержання додаткових генерацій рослин протягом року за рахунок використання ембріокультури in vitro.

Ключові слова: андрогенез, культура пиляків in vitro, ембріоїдогенез, калусогенез, регенерація, ембріокультура, кукурудза.

Сатарова Т.Н. Андрогенез и эмбриокультура у кукурузы in vitro. -- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.20 -- биотехнология. -- Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2002 г.

Экспериментальный андрогенез в культуре пыльников -- это комплекс процессов, связанных с переходом пыльцевого зерна с гаметофитного на спорофитный путь развития. Он заключается в получении новообразований из гаплоидных пыльцевых зерен, а из них -- растений-регенерантов, которые после диплоидизации превращаются в гомозиготные диплоидные растения, которые могут использоваться в селекции как инбредные линии. Эмбриокультура или культивирование изолированных зародышей с целью проращивания на различных этапах их развития способна сократить затраты времени на выращивание растений в селекционных программах перевода линий на мужскую цитоплазматическую стерильность, проведения насыщающих скрещиваний и других. Целью работы была определена разработка теоретических основ андрогенеза и эмбриокультуры у различных генотипов кукурузы in vitro и создание биологических технологий получения растений в культуре пыльников и зародышей.

Было установлено, что способность к индукции андрогенеза имеет генотипическую специфичность. Донорные растения гибридной природы более чувствительны, чем самоопыленные линии. Охарактеризовано андрогенетическую способность более 80 генотипов кукурузы. Сравнение показателей индукции новообразований у линии андрогенетического происхождения и родительского гибрида свидетельствует об эффективности отборов на повышенную андрогенетическую способность в культуре пыльников. Показана возможность расширения генетической базы андрогенеза за счет гибридов между исходным материалом андрогенетического происхождения и самоопыленными линиями. Установлено, что в определении способности к индукции андрогенеза главная роль принадлежит ядерным генам. Комплексный анализ компонентов генетической вариации, графика Хеймана и генетических параметров в системе диаллельных скрещиваний и в расщепляющихся поколениях показал, что способность к андрогенезу определяется различным соотношением аддитивных и доминантных эффектов, а также взаимодействием неаллельных генов, причем условия внешней среды способны влиять на наличие и силу проявления эффектов генов. По оценкам общей и специфической комбинационной способности донором генов индукции андрогенеза при создании высокоотзывчивых гибридов может служить линия And44, а при закладке синтетических популяций для выведения линий с высокой способностью к андрогенезу-- линии B14 и Wf9.

Реакция в культуре пыльников определяется генотипом, факторами среды и взаимодействием генотип х фактор. При этом наибольшей силой влияния на индукцию андрогенеза обладает генотип. Установлена связь между показателями индукции пыльцевых новообразований и погодными условиями, складывающимися в период развития донорных растений. Оптимальной стадией эксплантации является стадия молодого 2-клеточного пыльцевого зерна. Жидкая консистенция питательной среды способствует возникновению большего числа новообразований, а 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота в концентрациях от 0,01 до 1 мг/л ингибирует процесс индукции. Амипрофосметил (5 м/л) в составе индуктивной среды в зависимости от генотипа и консистенции среды ингибирует, стимулирует или не влияет на индукцию и не затрагивает регенерацию.

Установлено, что такие проандрогенетические события как деление генеративной и вегетативной клеток, а также равное деление в пыльцевом зерне наблюдаются еще в период холодовой предобработки. При эксплантации пыльников на стадии 1-клеточного вакуолизированного пыльцевого зерна преимущественно развивается вегетативная клетка по ценоцитному пути с переходом к клеткообразованию. При эксплантации на стадии молодого 2-клеточного пыльцевого зерна превалирует развитие генеративной клетки. Основным типом новообразований в культуре пыльников кукурузы являются эмбриоиды, которые на твердой индуктивной питательной среде становятся плотными, белыми или желтыми, а на жидкой -- бесцветными обводненными. Формирование андрогенетического зародыша кукурузы в целом подобно развитию полового зародыша за исключением ранних этапов. Зрелый андрогенетический зародыш имеет щиток и зародышевую ось с эпикотилем и зародышевым корнем. Отмечены нарушения строения зрелых андрогенных зародышей.

Постиндуктивный период развития пыльцевых эмбриоидов кукурузы характеризуется многовариантностью путей морфогенетических преобразований. Пыльцевые эмбриоиды могут переходить к прямой регенерации за счет прорастания или развития растений из клеток щитка, щиткового каллусогенеза различных типов и непрямой регенерации в культуре каллусной ткани. Интенсивность регенерации путем прорастания эмбриоидов зависела от их размера, консистенции и генотипа, а также от состава питательной среды. Среди полученных на пыльцевых эмбриоидах каллусов выделены короткоживущие и долгоживущие. Дана морфобиологическая характеристика регенерантов поколения А0. Проведенная морфологическая и биохимическая оценка андрогенетической линии And44 подтверждает ее гомозиготность.

Исследования влияния генетических, онтогенетических и внешних факторов на процессы индукции новообразований и регенерации растений в культуре пыльников легли в основу представленной технологии получения андрогенных растений в культуре пыльников кукурузы.

В исследованиях по эмбриокультуре кукурузы in vitro установлено влияние генотипа, возраста и размера зародыша, состава питательной среды и условий культивирования на показатели роста и развития проростков из незрелых зародышей. На основе метода эмбриокультуры разработана технология получения дополнительных генераций растений кукурузы в течение года. Показано, что предложенная технология позволяет значительно сокращать время перевода линий кукурузы на цитоплазматическую мужскую стерильность и может использоваться в других селекционных программах.

Thesis for a Doctor of biological science degree on speciality 03.00.20 -- biotechnology. -- Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2002.

The genetical, ecological, cytological and morphological peculiarities of androgenic induction in anther culture of different maize genotypes have been determined, the processes of callusogenesis and regeneration in culture of pollen embryoids and the peculiarities of regenerants of androgenic origin are characterised. It has been shown that the androgenic ability in maize anther culture is determined by the different ratios of additive and dominant effects and by the interaction of non-allelic genes, environmental conditions being able to affect the presence and the strength of manifestation of gene effects.

The methodical grounds of the germination of maize immature embryos in embryoculture in vitro have been worked out, that is used in transferring maize inbred lines to cytoplasmic male sterility and within other breeding programs.

The biological technologies of the obtaining of maize androgenic plants in anther culture in vitro and the receiving of additional generations of plants during a year due to embryoculture in vitro are created.

Key words: androgenesis, anther culture in vitro, embryoidogenesis, callusogenesis, regeneration, embryoculture, maize.