2. Хромосомные болезни (см. фото). Механизм образования

транслокационной формы б.Дауна (кариотип 46; trs 15⁺²¹).

3. Генные мутации. Стр. 50, №1, 3(2).

8. Задание для самостоятельной работы студентов.

См. Сборник задач по медицинской биологии и генетике, 2004

1. Геномные мутации. Стр. 54, № 4, 5, 7.

3. Генные мутации. Стр. 51, № 3(1), 4.

Практическое занятие №12

(Итоговый контроль по освоению учебного раздела «Основы общей генетики».

4. Вид занятия: итоговое.

5. Продолжительность занятия - 2 часа.

см. вопросы для подготовки к практическим занятиям №№ 6-11

Практическое занятие № 13

1. Тема:

Медицинская генетика. Методы изучения генетики человека (генеалогический, близнецовый)

2. Учебные цели:

Знать:

- методы изучения генетики человека;

- основные типы наследования признаков у человека;

- сущность генеалогического метода;

- сущность близнецового метода.

Уметь:

- составлять родословные для анализа характера наследования и прогнозирования вероятности проявления признаков;

- рассчитывать показатели конкордантности для моно- и дизиготных близнецов.

- использовать формулу Хольцингера для определения вклада наследственных и средовых факторов в развитие заболевания.

Владеть:

- методикой составления и анализа родословных;

- методикой вычисления вклада наследственности и среды в развитие многофакторных сложно наследуемых признаков и заболеваний человека.

3. Вопросы для самоподготовки к освоению данной темы:

1. Основные методы изучения генетики человека.

2. Генеалогический метод. Возможности метода.

3. Условные обозначения и правила составления родословной.

4. Типы наследования признаков: аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный, сцепленный с Х-хромосомой доминантный и рецессивный, сцепленный с Y-хромосомой. Особенности родословных при разных типах наследования.

5. Сущность близнецового метода. Оценка доли наследственности с применением формулы Хольцингера.

4. Вид занятия: практическое

5. Продолжительность занятия - 2 часа.

6. Оснащение. Таблицы: №74 «Методы диагностики хромосомных болезней »; №79 «Условные обозначения при составлении родословной» ;

№83 «Доминантный тип наследования»; №84 «Аутосомно - доминантный тип наследования»; №85 «Аутосомно - рецессивный тип наследования»; №84 «Х - сцепленный доминантный тип наследования. Х - доминантный и Х - рецессивный тип наследования»; №96 «Рецессивный тип наследования, сцепленный с полом»; №102 «Дерматоглифика»; №104 «Наследственность, сцепленная с полом по гемофилии»; №108 «Наследственность и среда. Близнецы»; №109 «Близнецовый метод».

7. Содержания занятия:

7.1. Контроль исходного уровня знаний и умений.

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия.

7.3. Демонстрация преподавателем методики практических приемов по данной теме.

1. Анализ родословных

Не все методы генетики применимы к анализу наследования тех или иных признаков у человека. Однако по исследованию фенотипов нескольких поколений родственников можно установить характер наследования признака и генотипы отдельных членов семей, определить вероятность проявления и степень риска для потомства по тому или иному заболеванию. Метод анализа родословных получил название генеалогического. Он служит основой для проведения медико-генетического консультирования.

Составление родословных имеет свои правила. Лицо, по отношению к которому составляется схема, называется пробанд. Схема составляется при помощи условных обозначений, приведенных в таблице (приложение). Каждое поколение исследуемых лиц располагается в одну строчку и нумеруется римскими цифрами. Члены одного поколения нумеруются арабскими цифрами. После составления схемы проводится анализ, состоящий из нескольких этапов:

1. Определение, наследуемый ли данный признак

2. Определение типа наследования

3. Определение генотипов членов родословной

4. Определение вероятности проявления признаков у потомков

Рассмотрим основные признаки родословных схем для определения типа наследования:

1. Аутосомно-доминантный тип наследования:

· наследование по вертикали

· передача заболевания от больных родителей детям

· здоровые члены родословной имеют здоровых детей

· признак одинаково проявляется у лиц обоего пола

1. Аутосомно-рецессивный тип наследования:

· больные дети рождаются от фенотипически здоровых родителей

· наследование по горизонтали

· признак одинаково проявляется у лиц обоего пола

2. Х-сцепленный тип наследования (рецессивный):

· Болеют преимущественно лица мужского пола

· Больные дети рождаются от фенотипически здоровых родителей, но мать является носительницей гена

· Заболевания женщин возможно, если отец болен, а мать - носительница.

3. Х-сцепленный тип наследования (доминантный):

· Заболевание прослеживается в каждом поколении

· У больного отца все дочери больны

· Больны как мужчины, так и женщины

· У здоровых родителей все дети здоровы

5. Сцепленное с Y-хромосомой наследование (голандрическое) характеризуется тем, что признак встречается у мужчин во всех поколениях

2. Близнецовый метод исследования генетики человека

Близнецовый метод позволяет оценить относительную роль генетических и средовых факторов в развитии конкретного признака или заболевания. Близнецы бывают монозиготные (однояйцевые) и дизиготные (разнояйцевые).

Монозиготные близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки (зиготы) в результате ее разделения надвое с образованием двух эмбрионов. Монозиготные близнецы имеют одинаковые генотипы и различие их признаков обусловлено только факторами внешней среды. Дизиготные близнецы рождаются, когда образуется одновременно две яйцеклетки, оплодотворяемые двумя сперматозоидами. Дизиготные близнецы имеют различные генотипы. Но благодаря одновременному рождению и совместному воспитанию у них будут общие средовые факторы.

Для доказательства роли наследственности в развитии признака необходимо сравнить долю (%) конкордантных пар (одинаковых по конкретному признаку) в группах моно- и дизиготных близнецов. Конкордантность однояйцевых близнецов обозначается КОБ, двуяцевых - КДБ.

Для вычисления используется формула Хольцингера.

7.4. Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя.

Практическая работа

1. Разбор родословных и определение типа наследования:

1- аут-дом, 2 - аут-дом, 3 - комплементарность (Д-глухота, ЕЕ-глухота, Д_Е_ - норма (Д+Е-норма); 5 - Y-сцепл, 6 - Y-сцепл, 7 - Х-сц, рец, 8 - аут-дом.

3. Решение типовых и ситуационных задач

См. Сборник задач по медицинской биологии и генетике, 2004

Генеалогический метод. Стр. 58-61, №№1, 6, 8.

Близнецовый метод. Стр. 63, №1(1), 2.

3. Лабораторная работа

8. Задание для самостоятельной работы студентов.

См. Сборник задач по медицинской биологии и генетике, 2004

Генеалогический метод. Стр. 58, №№ 2, 4, 8.

Близнецовый метод. Стр. 63, №№1 (2, 4), 3, 4.

Практическое занятие № 14

1. Тема:

Методы изучения генетики человека: биохимический, дерматоглифический и цитогенетический).

2. Учебные цели:

Знать:

- возможности цитогенетического, биохимического и дерматоглифического методов изучения генетики человека;

- этапы цитогенетического анализа;

- способы рутинной и дифференциальной окраски хромосом;

- классификацию хромосом человека согласно Денверской и Парижской номенклатуре,

- механизм формирования полового хроматина.

Уметь:

- проводить цитогенетический анализ кариотипа человека;

- проводить анализ полового хроматина..

Владеть:

- методикой изучения дерматоглифических признаков;

- методикой проведения цитогенетического анализа кариотипа человека;

- методикой приготовления препаратов эпителия слизистой щеки для изучения полового хроматина.

3. Вопросы для самоподготовки к освоению данной темы:

1. Биохимический метод. Примеры выявления гетерозиготных носителей ферментопатий (фенилкетонурия) и лиц предрасположенных к ряду заболеваний (сахарный диабет, атеросклероз, гипертония) с нагрузочными тестами).

2. Дерматоглифический метод. Ладонные линии, их значимость при наследственных синдромах. Гребневые линии пальцев (дуги, петли, завитки). Гребневый счет и его значимость при наследственных синдромах.

3. Изучение полового хроматина в интерфазных ядрах (тельца Барра, барабанные палочки).

4. Цитогенетический метод. Прямые и непрямые методы цитогенетического анализа. Основные этапы культивирования периферической венозной крови. Методы окраски хромосом (рутинная, дифференциальная, FISH - флуоресцентная).

5. Изучение кариотипа человека с применением Денверской классификации рутинно окрашенных хромосом.

6. Использование рутинной окраски для выявления нарушения числа хромосом.

7. Использование дифференциальной окраски для точной идентификации хромосом и выявления хромосомных перестроек.

8. Классификация дифференциально окрашенных хромосом согласно Парижской номенклатуре.

9. FISH - метод - современный метод молекулярной цитогенетики.

4. Вид занятия: практическое

5. Продолжительность занятия - 3 часа.

6. Оснащение. Таблицы: №74 «Методы диагностики хромосомных болезней »; № 158 «Биохимические методы в клинической генетике»

7. Содержания занятия:

7.1. Контроль исходного уровня знаний и умений.

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия.

7.3. Демонстрация преподавателем методики практических приемов по данной теме.

1. Дерматоглифический метод исследования генетики человека

Дерматоглифический анализ -- это изучение папиллярных узоров пальцев, ладоней и стоп. На этих участках кожи имеются крупные дермальные сосочки, а покрывающий их эпидермис образует гребни и борозды. Дерматоглифические узоры обладают высокой степенью индивидуальности и остаются неизменными в течение всей жизни. Поэтому их используют для определения зиготности близнецов, для идентификации личности в криминалистике и установления отцовства в судебной медицине. Трудности использования дерматоглифического анализа в медицине заключаются в отсутствии специфических изменений дерматоглифики при определенных заболеваниях. В медико-генетических консультациях дерматоглифический анализ чаще используется в качестве экспресс-метода диагностики некоторых геномных мутаций (болезни Дауна), реже - хромосомных мутаций.

	Схема флексорных борозд и главного ладонного угла (atd). Б - большого пальца, К - косая, П - поперечная

Папиллярные гребни на различных участках гребешковой кожи образуют узоры разного типа и ориентации. Узоры изучают на отпечатках, сделанных на бумаге, после нанесения на кожу типографской

краски. На пальцевых подушечках имеются узоры трех типов: дуги (А - arch), петли (L - loop) и завитки (W - whorl).

Для большинства узоров характерна дельта (трирадиус) - место схождения трех разнонаправленных папиллярных линий. Дуга представляет собой открытый, бездельтовый узор; петля - замкнутый с одной стороны, однодельтовый узор; завиток - полностью замкнутый, двухдельтовый узор. Иногда встречаются комбинированные сложные узоры. Количественным показателем узора является гребневый счет - число папиллярных линий между дельтой и центром узора. Гребневый счет дугового узора равен нулю. Узоры, аналогичные пальцевым, имеются и на ладонях - в области тенора и гипотенора и на II, III, IV и V межпальцевых промежутках.

В межпальцевых проме-жутках имеются трирадиусы (a, b, c, d), а вблизи брас-летной складки расположен главный ладонный трирадиус t. Если соединить трирадиусы a, d и t, то получим главный ладонный угол atd, который в норме не превышает 57°. На ладони различают три главные флексорные (сгибательные) борозды: борозды большого пальца, косая и поперечная. Иногда косая борозда сливается с поперечной в одну четырехпальцевую борозду (ЧПБ). Частота ее встречаемости в норме не превышает 5%. Совокупность радиальных петель на IV и V пальцах, четырехпальцевой борозды и главного ладонного угла свыше 60°-80° свидетельствует о врожденной компоненте наследственного заболевания.

2. Цитогенетический метод в исследовании генетики человека

Среди многих методов изучения наследственной патологии человека цитогенетический метод занимает существенное место. С помощью цитогенетического метода возможен анализ материальных основ наследственности и кариотипа человека в норме и патологии, изучение некоторых закономерностей мутационного и эволюционного процессов.

Методы цитогенетического анализа:

1. Изучение хромосомного набора (кариотипа) в делящихся клетках.

2. Экспресс-метод определения полового хроматина в ядрах интерфазных клеток.

1. Изучение хромосомного набора

Может проводиться двумя способами:

1) прямым методом - исследование метафазных хромосом в делящихся клетках, например, костного мозга (используется редко, в основном при новообразованиях крови), фибробластов кожи, ворсинчатой оболочки хориона (используется для анализа кариотипа плода на самых ранних сроках беременности).

б) непрямым методом - исследование метафазных хромосом в неделящихся в норме, но стимулированных к делению клетках. Это наиболее широко распространенный метод цитогенетического анализа, позволяющий анализировать кариотип в легко доступных клетках (периферическая кровь, клетки различных тканей и др.).

Проведение цитогенетического анализа хромосом непрямым методом осуществляется в несколько этапов:

1. Культивирование клеток периферической крови на искусственных питательных средах с добавлением фитогемагглютинина (ФГА) - стимулятора митотического деления клеток. В норме лимфоциты (ядерные клетки) периферической крови, как правило, не делятся, находясь в стадии покоя (интерфазы). Под действием ФГА происходит их иммунологическая трансформация и они начинают активно делится.

2. Добавление в среду культивирования колхицина для разрушения нитей веретена деления и остановки митоза на стадии метафазы, когда наблюдается максимальная степень конденсации (спирализации) хромосом.

3. Обработка клеток гипотоническим раствором хлорида натрия, вследствие чего мембрана клеток лопается и хромосомные наборы каждой клетки (пластинки) свободно лежат в плазме крови.

4. Окрашивание хромосом рутинным методом или методом дифференциальной окраски (см. ниже), в результате чего хромосомы становятся хорошо различимыми при микроскопировании.

5. Анализ кариотипа после зарисовки хромосом. В настоящее время используются современные микроскопы, способные выводить с помощью ряда компьютерных программ изображение на монитор компьютера для последующего анализа.

В случае рутинной (равномерной) окраски для окрашивания препаратов хромосом используются основные красители (азур-эозин, краситель Романовского-Гимзы, основной фуксин, орсеин и др.). После рутинной окраски хромосомы можно распределить по группам (от А до G) в соответствии с международной Денверской классификацией. Денверская классификация хромосом позволяет проанализировать общее число хромосом, определить их принадлежность к той или иной группе, а также выявить грубые хромосомные нарушения (поломки, перемещения участков хромосом, нетипичные конфигурации и др.).

Для более точного анализа хромосом используются методы дифференциального окрашивания, которые позволяют идентифицировать хромосомы внутри определенной группы. При дифференциальном окрашивании каждая пара хромосом имеет свой строго специфический рисунок!, заключающийся в чередовании окрашенных и неокрашенных полос разной толщины. Рисунок дифференциально окрашенных хромосом является специфической характеристикой кариотипа данного вида организмов. Для точной идентификации дифференциально окрашенных хромосом используется Парижская номенклатура.

С целью получения дифференциальной окраски цитогенетических препаратов применяют специальные красители - флюрохромы в сочетании с основными красителями, использующимися для рутинной окраски.

Существуют следующие методы дифференциального окрашивания хромосом:

Самым популярным способом является G-окрашивание - это стандартный метод цитогенетического анализа. Применяется при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы).

Q-окрашивание - окрашивание акрихин-ипритом с исследованием под флуоресцентным микроскопом. Чаще всего применяется для исследования Y-хромосом (быстрое определения генетического пола, выявление транслокаций между X- и Y-хромосомами или между Y-хромосомой и аутосомами, скрининг мозаицизма с участием Y-хромосом). При Q-окраске число, величина и расположение сегментов в хромосоме аналогично рисунку при G-окраске.

R-окрашивание - используется акридиновый оранжевый и подобные красители, при этом окрашиваются участки хромосом, нечувствительные к G-окрашиванию. R-сегменты окрашиваются после контролируемой тепловой денатурации. Используется для выявления деталей гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.

C-окрашивание - применяется для анализа околоцентромерных районов хромосом, содержащих конститутивный гетерохроматин, а также дистальной части Y-хромосомы.

Запомните! Рисунок каждой пары хромосом при дифференциальной окраске специфичен по числу, положению и размерам окрашенных сегментов.

FISH-метод окраски хромосом

Метод FISH-окраски (fluorescent in situ hybridization) разработан в Ливерморской национальной лаборатории (США) в 1986 г. Это принципиально новый метод изучения хромосом - метод флюоросцентного выявления ДНК путем гибридизации in situ со специфическими молекулярными зондами. Метод основан на способности хромосомной ДНК связываться при определенных условиях с фрагментами ДНК (ДНК-зондами), которые включают нуклеотидные последовательности комплементарные хромосомной ДНК. ДНК-зонды предварительно метят специальными веществами (например, биотином или дигоксигенином). Меченные ДНК-зонды наносят на цитогенетические препараты подготовленных для гибридизации метафазных хромосом. После того как произошла гибридизация, препараты обрабатывают специальными флюросцентными красителями, конъюгированными с веществами, способными избирательно присоединяться к биотину или дигоксигенину. Каждая хромосома имеет специфическую окраску. Гибридизация может проводиться также с зондами меченными радиоактивной меткой. Цитогенетический анализ проводится под люминесцентным микроскопом в ультрафиолетовом свете.

FISH-метод используется для выявление мелких делеций и транслокаций. Хромосомные обмены (транслокации и дицентрики) между разноокрашенными хромосомами легко определяются как разноцветные структуры.

2. Экспресс-метод определения полового хроматина

Метод заключается в анализе X-полового хроматина в интерфазных ядрах клеток слизистой оболочки полости рта. Для выявления полового хроматина клетки окрашиваются с применением основных красителей (орсеин, краситель Романовского-Гимзы и др.).

7.4. Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя.

Практическая работа

1. Просмотр демонстрационного препарата «Кариотип человека» в цитогенетической лаборатории

При увеличении Х90 в поле зрения видны лейкоциты, которые имеют округлую форму, компактное округлой формы темноокрашенное ядро, окруженное широким ободком светлоголубой цитоплазмы. Среди них найдите хромосомы, лежащие вне клеток в виде скопления - метафазная пластинка. Найдите метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы.

2. Анализ кариотипа у больных с хромосомными болезнями (по фотографиям)

№ 1. трисомия по 13 хромосоме (синдром Патау). Кариотип 47, +13.

№ 2. трисомия по 18 хромосоме (синдром Эдвардса). Кариотип 47, +18.

№ 3. трисомия по 21 хромосоме (болезнь Дауна). Кариотип 47, +21.

№ 4. делеция короткого плеча одной из хромосом 5 пары (синдром «кошачьего крика»). Кариотип 46, 5р-

№ 5. полисомия Х-хромосомы у женщин. Кариотип: 47, ХХХ или 48, ХХХХ

№ 6. полисомия Х-хромосомы у мужчин (синдром Клайнфельтера). Кариотип: 47, ХХУ, 48, ХХХУ -

№ 7. моносомия по Х-хромосоме (синдром Шершевского -Тернера). Кариотип: 45, ХО.

Разобрать с преподавателем механизм возникновения транслокационной формы болезни Дауна (кариотип 46, 15⁺²¹).

3. Проведение дактилоскопического анализа

Для изготовления собственных отпечатков пальцев необходимо следующее оборудование: фотографический каток, стекло площадью 20х20 см², кусок поролона, типографская краска (или аналогичный материал), листы бумаги, ручная лупа (не менее 10 см в диаметре).

Метод приготовления отпечатков пальцев

На стекло наносят небольшое количество краски и тщательно раскатывают катком до тонкого равномерного слоя. Пальцы испытуемого поочередно прижимаются к стеклу, а затем прикладываются к бумаге, под которой лежит поролон. Палец ставится на ребро радиальной стороны и поворачивается так, чтобы отпечаталась вся поверхность пальцевой подушечки, вплоть до его ульнарной стороны. Поднимать палец надо осторожно, чтобы не сместить бумагу и не смазать рисунок. На листках подписывают фамилию, пол и возраст. Далее производится определение рисунка узора на каждом пальце левой и правой руки, записывается формула каждой из рук. Рассчитывается показатель TRG по двум индексам из предложенных выше, и определяется дельтовый показатель.

Таблица

Пальцы	I	II	III	IV	V	Всего
Правая рука
Левая рука

Аналогичную таблицу составить для определения дельтового показателя.

Пальцы	I	II	III	IV	V	Всего
Правая рука
Левая рука

Выводы:

4.Цитогенетический анализ кариотипа (по микрофотографиям метафазных пластинок).

1. Зарисовать метафазную пластинку.

2. Подсчитать общее количество хромосом.

3. Идентифицировать хромосомы групп A (3 пары крупных метацентрических хромосом), В (две пары крупных субметацентрических хромосом), Д (3 пары средних акроцентрических хромосом), G (две пары мелких акроцентрических хромосом).

4. Определить половую принадлежность обследуемого индивида. При наличии 4-х мелких акроцентрических хромосом (2 пары G-хромосом) устанавливается женский кариотип. При наличии 5 мелких акроцентрических хромосом (2 пары G-хромосом и Y-хромосома) устанавливается мужской кариотип.

5.Экспресс-метод исследования Х-полового хроматина в ядрах эпителия слизистой оболочки полости рта

Перед взятием соскоба пациента просят обкусать зубами слизистую оболочку щеки и внутреннюю поверхность щеки протереть марлевой салфеткой. Эта процедура необходима для удаления разрушенных клеток, где половой хроматин не выявляется. При помощи щпателя или предметного стекла, предварительно обработанного спиртом, проводят легкий соскоб слизистой оболочки щеки. Беловатый налет наносят тонким слоем на обезжиренное предметное стекло. Препарат окрашивают краской ацет-орсеин (уксусная кислота фиксирует клетки, орсеин хорошо окрашивает ядерные структуры), покрывают покровным стеклом., представляя краске равномерно распределятся по мазку. Большим пальцем придавливают покровное стекло к предметному, предварительно положив на покровное стекло фильтровальную бумагу. Препарат рассматривают под микроскопом (90Ч). В поле зрения видны эпителиальные клетки слизистой оболочки полости рта с хорошо окрашенными ядрами. В ядрах половой хроматин располагается около внутренней ядерной оболочки в виде полулуния, зубчика, треугольника. Половой хроматин следует учитывать в клетках с неповрежденным ядром. Подсчет полового хроматина ведут на 100 клеток. В 100 соматических клетках здоровых женщин Х-половой хроматин выявляется в 40-60% ядер.

8. Задание для самостоятельной работы студентов.

См. Сборник задач по медицинской биологии и генетике, 2004, Стр. 54-55

Практическое занятие № 15

1.Тема:

Медицинская генетика. Методы изучения генетики человека: популяционно-статистический и молекулярно-генетический. Медико-генетическое консультирование. Пренатальная диагностика наследственных заболеваний и врожденных пороков развития.

2. Учебные цели:

Знать:

- возможности и задачи популяционно-статистического метода;

- различия между идеальными и реальными популяциями человека;

- факторы и движущие силы эволюции;

- сущность молекулярно-генетического метода анализа ДНК;

- задачи, принципы и методы медико-генетического консультирования;

- показания для медико-генетического консультирования;

- основные способы пренатальной диагностики.

Уметь:

- применять закон Харди-Вайнберга для характеристики генетической структуры популяции;

- проводить анализ электрофореграмм, полученных при молекулярно-генетическом анализе;

Владеть:

- способом оценки генетической структуры популяций;

- методикой вычисления наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности и отклонением от закона Харди-Вайнберга;

- методикой анализа электрофореграмм.

3. Вопросы для самоподготовки к освоению данной темы:

1. Основные понятия популяционной генетики: популяция, генофонд, генетический груз.

2. Характеристика популяций человека: большие и малые (демы, изоляты).

3. Идеальные популяции. Закон Харди-Вайнберга.

4. Реальные популяции.

5. Движущие силы эволюции: 1 - мутации (генетический груз), 2 - популяционные волны (причины: малые численности, уменьшение ресурсов в результате стихийных бедствий, миграции населения), 3 - дрейф генов (генетико-автоматические процессы), 4 - изоляция (географическая, генетическая, морфофизиологическая, экологическая, этологическая, социальная), 5 - естественный отбор (движущий, стабилизирующий, дизруптивный).

6. Популяционно-статистический метод. Возможности метода.

7. Молекулярно-генетический метод. Возможности метода. Сущность метода полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР). Этапы ПЦР. Практическая значимость ПЦР-анализа в современной медицине (генетике человека, гинекологии, стоматологии и др.). Секвенирование ДНК.

8. Медико-генетическое консультирование: показания, цель, задачи, методы.

9. Пренатальная диагностика (прямая и непрямая). Неинвазивные методы пренатальной диагностики (УЗИ плода). Инвазивные методы пренатальной диагностики (доимплантационная (до 7 дней при искусственном оплодотворении), биопсия ворсин хориона (7-12 нед), амниоцентез (16-22 нед), кордоцентез (22-25 нед).

4. Вид занятия: практическое

5. Продолжительность занятия - 2 часа.

6. Оснащение. Мультимедиа

7. Содержания занятия:

7.1. Контроль исходного уровня знаний и умений.

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия.

7.3. Демонстрация преподавателем методики практических приемов по данной теме.

1. Популяционно-статистический метод

Популяция - это совокупность особей одного вида, длительно населяющих одну территорию, относительно изолированных от других групп особей данного вида, свободно скрещивающихся между собой и дающих плодовитое потомство.

Возможности популяционно-статистического метода:

1. Метод позволяет охарактеризовать генофонд популяции. Генофонд - это совокупность всех аллелей и генотипов в конкретной популяции.

2. Метод позволяет охарактеризовать генетический груз популяции. Генетический груз - это совокупность мутантных аллелей, генотипов, а также распространенность наследственных заболеваний в конкретной популяции.

3. Дает возможность охарактеризовать мутационный процесс, оценить роль наследственности и среды в формировании генетической структуры популяции, в возникновении болезней.

4. Позволяет охарактеризовать демографические процессы в популяциях человека, выявить источники происхождения мутаций (по градиенту частот), определить основные направления миграций населения по спектру мутаций.

Основой для выяснения генетической структуры популяций является закон Харди-Вайнберга, 1908 (Дж.Г.Харди - английский математик, В.Вайнберг - немецкий врач). Это закон поддержания генетического равновесия в популяции: в идеальной популяции частоты генов и генотипов находятся в равновесии и сохраняются неизменными в ряду поколений.

Основные положения з-на Харди-Вайнберга:

1. Частота аллелей в популяции - величина постоянная, p+q=1, где р - частота аллеля А; q - частота аллеля а.

2. Частота генотипов также величина постоянная и может быть выражена формулой: (p+q)² = p²+2pq+q²=1, где p² - частота генотипа АА; 2pq - частота генотипа Аа; q² - частота генотипа аа.

Особенности идеальной популяции:

1. Бесконечно большая численность.

2. Абсолютная панмиксия, т.е. отсутствие ограничений в выборе партнера и наличие условий для случайной встречи гамет.

3. Отсутствие мутационного процесса.

4. Отсутствие притока (иммиграция) и оттока (эммиграция) аллелей.

5. Отсутствие отбора.

В природе идеальных популяций не существует.

Реальные популяции по численности особей могут быть большими и малыми. Большие популяции включают более 4 тыс. чел. Малые подразделяются на демы и изоляты. Демы - имеют численность от 1,5 до 4 тыс. человек. Изоляты - наименьшие популяции людей численностью до 1,5 тыс. человек.

В реальных популяциях происходят различные генетические процессы, изменяющие частоты доминантных и рецессивных аллелей. Основные факторы, приводящие к смещению равновесия Харди-Вайнберга: 1 - мутации, 2 -популяционные волны, 3 - изоляция, 4 - дрейф генов, 5 -отбор. Эти 5 факторов - основные движущие силы эволюции. Поскольку в больших популяциях эти факторы незначительно меняют частоты аллелей и генотипов, в них сохраняется закон Харди-Вайнберга.

1. Мутации - изменяют частоту генов в популяции. Доминантные мутации проявляются уже в первом поколении и сразу же подвергаются действию естественного отбора. Рецессивные мутации сначала накапливаются в популяции (т.к. не проявляются в гетерозиготном состоянии) и только с появлением рецессивных гомозигот подвергаются действию естественного отбора.

2. Популяционные волны - случайные колебания частот генов

Причины:

1) Небольшие по численности популяции. Пример: теоретически рождение мальчика или девочки равновероятно, но в малых популяциях (семья) в силу случайных причин это равновесие может нарушаться.

2) Резкое снижение численности популяции в результате стихийных бедствий (эпидемии, наводнения, землетрясения, пожары, войны).

3) Миграции населения в малых популяциях. Иммиграции и эммиграции поставляют или устраняют какие-то аллели, изменяя соотношение частот генотипов.

3. Изоляция - это ограничение свободы скрещивания.

Различают несколько типов изоляции: географическая (горы, реки, проливы, большие расстояния), генетическая (неполноценность гибридов), экологическая (обитание в различных экологических нишах, например, при разных температурах), морфофизиологические (различия в строении половых органов), социальная (принадлежность к определенному слою общества, национальные традиции), этологическая (религиозные мотивы ограничения браков) и т.д. В малых популяциях часто наблюдается инбридинг - кровно-родственные браки между родственниками. Эти браки нежелательны, т.к. они приводят к инбредной депрессии, поскольку у родственников высокая вероятность гетерозиготности по одному и тому же рецессивному патологическому аллелю.

4. Дрейф генов (генетико-автоматические процессы) - случайное резкое увеличение частот каких-либо аллелей. Этот эффект наблюдается при резком увеличении численности какой-либо небольшой группы особей, частоты генов в которой существенно отличаются от исходной популяции. Этот феномен получил название «эффект горлышка бутылки» или «эффект основателя».

5. Отбор. Различают искусственный и естественный отбор. В результате естественного отбора из популяции устраняются менее удачные комбинации генов и генотипов и избирательно сохраняет наиболее выгодные для существования комбинации, тем самым изменяя частоту генов. Интенсивность естественного отбора даже в современных человеческих популяциях довольно высокая. Только 25% людей вносят вклад в генофонд будущих поколений! Это связано с тем, что спонтанные аборты составляют около 50% всех зачатий, мертворождения - 3%, ранняя детская смертность - 2%, не вступает в брак около 20% людей, бесплодны - 10% браков.

2. Биохимический метод

Биохимические методы основаны на изучении активности ферментных систем (либо по активности самого фермента, либо по количеству конечных продуктов реакции, катализируемой этим ферментом). Биохимические методы позволяют выявить генные мутации, которые являются причиной заболевания обмена веществ (например, фенилкетонурия). Фенилкетонурия наследуется по аутосомно-рецессивному типу больные являются рецессивными гомозиготами (аа). Ген (картирован 12q22-q24), мутации которого приводят к заболеванию, кодирует фермент фенилаланин-гидроксилазу, катализирующей превращение фенилаланина в тирозин. В результате у больного происходит накопление фенилаланина, который превращается фенилпировиноградную кислоту, которая в больших концентрациях является нейротропным ядом. С помощью нагрузочных тестов можно выявлять гетерозиготных носителей патологических генов, например фенилкетонурии. Исследуемому вводят внутривенно определенное количество аминокислоты фенилаланина и через равные промежутки времени определяют его концентрацию в крови. Если человек гомозиготен по доминантному аллелю (генотип АА), то концентрация фенилаланина быстро возвращается в контрольному значению, а если гетерозиготен (генотип Аа), то снижение концентрации фенилаланина идет вдвое медленнее. Аналогично проводят тесты, выявляющие предрасположенность к гипертонии, сахарному диабету и т.д.

3. Молекулярно-генетический метод

В основе всех молекулярно-генетических методов лежит изучение структуры ДНК.

Этапы анализа ДНК:

1. Выделение ДНК из клеток, содержащих ядра (крови, тканей, спермы, костей, волос и др. биологических материалов), включая трупный материал и ископаемые останки;

2. Обнаружение и размножение (копирование) небольшого интересующего фрагмента из тотальной ДНК методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР);

3. Анализ последовательности нуклеотидов интересующего фрагмента ДНК: регистрация результатов ПЦР обычно с помощью электрофореза.

Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации (размножения) ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выявить и размножить интересующий фрагмент ДНК размером от 80 до 3000 пар нуклеотидов (пн).

Исходные компоненты ПЦР:

1. ДНК-матрица (тотальная ДНК);

2. Праймеры (однонитевые синтетические фрагменты ДНК размером 20-30 нуклеотидов), строго комплементарные правой и левой границам интересующего фрагмента ДНК).

3. Нуклеотиды, являющиеся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК);

4. Фермент - ДНК-полимераза, катализирующий удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидов к растущей цепи синтезируемой ДНК.

ПЦР-анализ включает 30 циклов амплификации. Каждый цикл состоит из трех стадий:

1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, разрыв водородных связей между комплементарными нуклеотидами). Проходит при температуре 93-95^оС в течение 1 мин.

2. Отжиг (присоединение) праймеров (50-60^оС, 1 мин).
3. Синтез ДНК - достраивание одноцепочечных участков ДНК по принципу комплементарности (72^оС, 1 мин).

К концу ПЦР происходит накопление нужного участка ДНК до 2ⁿ фрагментов, где n-число циклов амплификации. Этого количества достаточно для точной детекции этого фрагмента методом электрофореза.

7.4. Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя.

Практическая работа

1. Применение закона Харди-Вайнберга для расчета частот генотипов, аллелей и характеристики генетической структуры популяции (группы), используя тест на праворукость и леворукость

1. Используя тесты на праворукость и леворукость, составляем таблицу и определяем свой генотип (табл. 1.1).

Таблица 1.1

Порядковый номер теста	Наименование теста	Результаты 3-х кратного повторения каждого теста
	«Аплодисменты»	«Поза Наполеона»	«Скрещенные пальцы»	Пр. рука	Лев. рука
1	правая	левая	лев	1	2
2	правая	левая	лев	1	2
3	правая	левая	лев	1	2
Сумма				3	6

2. Проводим анализ результатов тестирования. Помня, что праворукость является доминантным признаком, определяем генотип каждого индивида.

Гомозиготный генотип устанавливается в случае преобладания одной из рук более, чем в 2 раза: при соотношениях (пр.рука) : (лев.рука) равных 7:2; 8:1; 9:0, устанавливается генотип «АА», при обратных соотношениях, т.е. 2:7; 1:8; 0:9 устанавливается генотип «аа». В остальных случаях устанавливается гетерозиготный генотип «Аа».

Полученное в нашем примере соотношение равно 3:6, следовательно, у данного индивида гетерозиготный генотип «Аа».

2. Составляем суммарную таблицу генотипов всех студентов группы (табл. 1.2):

Таблица 1.2

Наблюдаемые частоты генотипов и аллелей

№ п/п	ФИО	Генотип
1	Иванов	АА
2	Петров	Аа
3	Кузнецов	аа
4	Николаев	Аа
5…	Семенов	Аа

4. Определяем наблюдаемые частоты генотипов и аллелей (табл. 1.3):

Запомните! Частоты аллелей и генотипов в уравнении Харди-Вайнберга выражаем только в долях от единицы!

Таблица 1.3

Наблюдаемые частоты генотипов и аллелей

Генотипы, аллели	Число случаев	Частота (в долях)
АА	1	1 / 5 = 0,2
Аа	3	3 / 5 = 0,6
аа	1	1 / 5 = 0,2
Аллель А	2 (АА)+3 (Аа)=5	5 : 10 = 0,5
Аллель а	2(аа)+3(Аа)=5	5 : 10 = 0,5

4. Используя формулу Харди-Вайнберга вычисляем ожидаемые частоты генотипов и аллелей:

В нашем примере частота генотипа аа, т.е. q² = 0,2 (см. табл. 3).

1. Зная q2, можно вычислить q=vq ² т.е.v0,2=0,45

2. Зная q, можно вычислить p=1-q, т.е. p=1-0,45=0,55

3. Зная p, можно вычислить p² =0,55*0,55=0,30

4. Зная p и q можно вычислить 2pq=2*0,55*0.,45=0,50

5. Генетическая структура популяции, т.е. частота всех генотипов, выражается формулой 0,30+0,50+0,2=1

5. Произведя вычисления, указываем в таблице ожидаемые частоты генотипов и аллелей (табл.1.4).

Таблица 1.4

Наблюдаемые и ожидаемые частоты генотипов и аллелей

	Наблюдаемое число случаев	Наблюдаемая частота	Ожидаемая частота
АА (p2)	1	0,2	0,30
Аа (2pq)	3	0,6	0,50
аа (q2)	1	0,2	0,20
Аллель А(p)	2 (АА)+3 (Аа)=5	0,50	0,55
Аллель а(q)	2(аа)+3(Аа)=5	0,50	0,45

6. Делаем заключение: Наблюдается небольшое смещение от равновесия Харди-Вайнберга, что объясняется малочисленностью изученной выборки - эффект колебания частот аллелей (популяционные волны) в малых популяциях.

3. Применение закона Харди-Вайнберга для расчета частот генотипов, аллелей и характеристики генетической структуры популяции (группы) по умению сворачивать язык в трубочку (аутосомно-доминантный признак)

1. Поскольку умение сворачивать язык в трубочку - аутосомно-доминантный признак, следовательно, лица с доминантным признаком могут быть гомозиготными (генотип АА), или гетерозиготными (генотип Аа). Составляем суммарную таблицу студентов группы (табл. 2.1):

Таблица 2.1

Наблюдаемые частоты генотипов и аллелей

№ п/п	Умение сворачивать язык в трубочку	Генотипы
1	Умею (да)	А_
2	Не умею (нет)	аа
3	Нет	аа
4	Да	А_
5…	Да	А_

2. Подсчитываем число индивидов с гомозиготным рецессивным генотипоми «аа» (в нашем примере 2 случая из 5 проанализированных):

4. Вычисляем частоту генотипа «аа», т.е. q²=2:5=0,4

5. Используя формулу Харди-Вайнберга, вычисляем ожидаемые частоты генотипов и аллелей в следующей последовательности:

1. Зная q2, можно вычислить q=vq ² т.е.v0,4=0,63

2. Зная q, можно вычислить p=1-q, т.е. p=1-0,63=0,37

3. Зная p, можно вычислить p² =0,37*0,37=0,14

4. Зная p и q можно вычислить 2pq=2*0,37*0,63=0,46

5. Генетическая структура популяции, т.е. частота всех генотипов, выражается формулой 0,14+0,46+0,4=1

3. Молекулярно-генетический метод: моделирование ПЦР-анализа делеции F508 гена CFTR при диагностике муковисцидоза

1. Конструирование праймеров размером 10 нуклеотидов для правого и левого участков интересующего фрагмента ДНК размером 30 пн:

смысловая цепь ДНК - 5' act gcg agc tta cgg ttt cat ggg cga gat 3'

антисмысловая цепь ДНК - 3' tga cgc tcg aat gcc aaa gta ccc gct cta 5'

Праймеры:

Прямой

5' act gcg agc t 3'

антисмысл. ДНК - 3' tga cgc tcg aat gcc aaa gta ccc gct cta 5'

Обратный

смысловая ДНК - 5' act gcg agc tta cgg ttt cat ggg cga gat 3'

3'a ccc gct cta 5'

2. Проведение ПЦР и интерпретация результатов.

1) В норме у здорового человека размер искомого фрагмента ДНК равен 30 пн. Это нормальный аллель, обозначаемый как А.

2) При делеции 3-х пар нуклеотидов в 13-м, 14-м и 15-м положениях смысловой цепи ДНК триплет cgg) будет амплифицироваться фрагмент размером 27 пн. Это мутантный аллель, обозначаемый как а.

3) Идентификация результатов амплификации путем разделения фрагментов ДНК на электрофорезе (см. рис. 1):

Рис 1. Электрофореграмма и интерпретация результатов амплификации образцов ДНК индивидов с генотипами АА, Аа, аа.

Интерпретация полученных результатов:

Генотип «АА» - норма - поскольку оба аллеля имеют одинаковый размер, на электрофореграмме будет выявляться одна полоса размером 30 пн - аллели А (см. рис. 1).

Генотип «Аа» - гетерозиготный носитель - на электрофореграмме будет выявляеться две полосы, соответствующие размерам фрагментов 27 и 30 пн (аллели А и а).

Генотип « аа» - гомозигота по мутантным аллелям - поскольку оба фрагмента ДНК имеют одинаковый размер, на электрофореграмме будет выявляться одна полоса размером 27 пн.

8. Задание для самостоятельной работы студентов.

См. Сборник задач по медицинской биологии и генетике, 2004

Стр. 54-55.

Практическое занятие №16

(Итоговый контроль по освоению учебного модуля 2. Основы общей и медицинской генетики)

см. вопросы для подготовки к практическим занятиям №№6-14.

4. Вид занятия: итоговое.

5. Продолжительность занятия - 2 часа

Практическое занятие №17

1. Тема:

Мейоз как процесс образования гаплоидных клеток (гамет). Биологическое значение мейоза. Размножение организмов как механизм, обеспечивающий смену поколений. Гаметогенез.

2. Учебные цели:

Знать:

- основные закономерности и биологическое значение мейоза;

- механизм кроссинговера;

- способы размножения организмов;

- биологическое значение полового размножения;

- особенности сперматогенеза и овогенеза;

- менструальный цикл;

- строение половых клеток млекопитающих.

Уметь:

- анализировать закономерности преобразования и формулу хромосом в разные периоды мейоза;

- решать цитологические задачи.

Владеть:

- техникой микроскопирования при малом и большом увеличениях микроскопа;

- методикой решения цитологических задач.

3. Вопросы для самоподготовки к освоению данной темы:

1. Мейоз. Особенности интерфазы, предшествующей мейозу.

2. Редукционное деление мейоза. Стадии: профаза I (лептотена, зиготена, пахитена, диплотена, диакинез), метафаза I, анафаза I, телофаза I.

3. Интеркинез.

4. Эквационное деление.

5. Отличие мейоза I от мейоза II.

6. Отличие мейоза от митоза.

7. Биологическое значение мейоза.

8. Способы размножения организмов.

9. Отличие полового размножения от бесполого.

10. Основные формы бесполого размножения: деление на два (митоз), множественное деление (шизогония), почкование, фрагментация, спорообразование, вегетативное размножение, полиэмбриония).

11. Основные формы полового размножения у одноклеточных организмов (конъюгация, копуляция) и у многоклеточных организмов (без оплодотворения (партеногенез) и с оплодотворением).

12. Биологическое значение полового размножения.

13. Сперматогенез.

14. Овогенез. Понятие о менструальном цикле.

15. Морфология половых клеток (сперматозоиды, яйцеклетки).

16. Этапы оплодотворения.

4. Вид занятия: практическое.

5. Продолжительность занятия - 3 часа.

6. Оснащение. Таблицы: №23 «Схема мейоза»; №24 «Гаметогенез», №25 «Мейоз. Сперматогенез. Овогенез» №26 «Сперматогенез у морской свинки», №27 «Половые клетки (муж.)», №28 «Строение яйцеклетки», №29 «Типы яйцевых клеток», №30 «Различие геномов у прокариот и эукариот», №31 «Цитологический мейоз», микроскопы, постоянные микропрепараты, фотографии.

7. Содержания занятия:

7.1. Контроль исходного уровня знаний и умений.

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия.

7.3. Демонстрация преподавателем методики практических приемов по данной теме.

Преподаватель знакомит студентов с планом и методикой проведения практической работы.

7.4. Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя.

Практическая работа

1. Сперматозоиды млекопитающего

Рассмотрите при малом, а затем большом увеличении микроскопа сперматозоид млекопитающего (быка).

2. Яйцеклетка крольчихи

Изучите при малом и большом увеличении микроскопа яйцеклетку млекопитающего (срез яичника крольчихи). В демонстрационном препарате обратите внимание на зоны развития половых клеток в срезе яичника.

3. Синкарион яйцеклетки аскариды

При малом увеличении микроскопа найдите срез матки аскариды, заполненной фолликулами с яйцеклетками. Рассмотрите препарат при большом увеличении. Цитоплазма в яйцеклетках сжимается и отслаивается от толстой оболочки, на внутренней стороне которой можно увидеть первое редукционное тельце, расплывшееся в виде черточки. Иногда можно встретить и второе редукционное тельце, расположенное в виде точки на поверхности цитоплазмы.

Вращая микровинт, рассмотрите внутри цитоплазмы два сблизившихся ядра пронуклеуса, одно из которых - ядро яйцеклетки с гаплоидным набором хромосом, другое - ядро сперматозоида, тоже с гаплоидным набором. Вслед за сближением пронуклеусов происходит их слияние, образуется новое ядро уже с диплоидным набором отцовских и материнских хромосом (синкарион), и образовавшаяся зигота начинает делиться.

Решение задач

см. Сборник задач по биологии и медицинской генетике, 2004.

Раздел 2. Цитогенетика

Стр. 12-14, Задачи №№ 1, 5, 8, 9, 11, 13.

Просмотр видеофильма «Гаметогенез» - 20 мин.

8. Задание для самостоятельной работы студентов.

см. Сборник задач по биологии и медицинской генетике, 2004.

Раздел 2. Цитогенетика

Задачи №№ 2-7, 10, 18.

Практическое занятие № 18

1.Тема:

Введение в биологию развития. Сущность онтогенеза. Периодизация и основные закономерности внутриутробного развития позвоночных.

2. Учебные цели:

Знать:

- основные закономерности и этапы онтогенеза и эмбриогенеза;

-опыты по эмбриональной индукции;

- особенности эмбрионального развития человека;

- провизорные органы хордовых;

- критические периоды внутриутробного развития человека.

Уметь:

- моделировать с помощью рисунков ранние стадии эмбрионального развития (оплодотворение, дробление, гаструляция, нейруляция)

Владеть:

- терминологией.

3. Вопросы для самоподготовки к освоению данной темы:

1) Основные этапы онтогенеза.

2) Оплодотворение - начальный этап развития нового организма.

3) Дробление как процесс образования многоклеточного зародыша.

4) Типы дробления.

5) Связь строения яйца с типом дробления.

6) Гаструляция как процесс формирования многослойного зародыша.

7) Способы гаструляции.

8) Первичный органогенез.

9) Дифференцировка зародышевых листков.

10) Особенности раннего эмбрионального развития человека.

11) Провизорные органы хордовых.

4. Вид занятия: практическое

5. Продолжительность занятия - 2 часа

6. Оснащение. Мультимедиа

7. Содержания занятия:

7.1. Контроль исходного уровня знаний и умений.

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия.