Функціональна компартменталізація апарату трансляції у вищих еукаріот

Рис.8 Активність валіл-тРНК синтетази в комплексі з EF-1H в присутності EF-1 (50 пмоль/100 мкл суміші) та GTP (1), GMPPNP (2) або GDP (3). (4) - активність фермента в присутності GMPPNP без EF-1. Концентрація валіл-тРНК синтетази 2.1 нМ. Концентрації нуклеотидів: 100 мкМ GTP, 140 мкМ GMPPNP, 100 мкМ GDP.

Специфічність ефекту EF-1 була перевірена заміною у вищеописаній системі еукаріотичного фактора EF-1 на прокаріотичний EF-Tu. Оскільки, як виявилося, EF-1 не прискорює обмін нуклеотидів в молекулі EF-Tu, спеціальну увагу було приділено переведенню EF-Tu в GTP-зв'язану форму, використовуючи фосфоенолпіруват та його кіназу. Виявилося, що EF-Tu-GTP не впливає на активність валіл-тРНК синтетази навіть у концентрації, що була в чотири рази більше за концентрацію EF-1 в аналогічному експерименті (рис.9). Отже, просто спорідненості до аміноацил-тРНК виявилося недостатньо для активації валіл-тРНК синтетази.

Рис.9 Швидкість синтезу валіл-тРНК валіл-тРНК синтетазою в комплексі з EF-1H в присутності бактеріального фактора елонгації EF-Tu.

Одним із факторов, що має вплив на стимуляторний ефект EF-1, виявився ступінь збагачення сумарного препарату тРНК валіновою тРНК. При порівнянні препаратів тРНК, які містили 2.5% або 20,4% тРНКVal, виявилося, що активація валіл-тРНК синтетази фактором елонгації спостерігається тільки при використанні збагаченого по тРНКVal препарату сумарної тРНК (рис.10).

Ми пояснюємо це явище 10-кратним зменшенням (з 22000 до 2500 пмоль на точку прямої) кількості деацильованої тРНК в збагаченому препараті. Якщо EF-1 здатний формувати неканонічний комлекс з деацильованою тРНК (про що буде сказано нижче), її значний надлишок в порівнянні з аміноацил-тРНК в системі призводить до того, що майже всі молекули фактора перебувають в комплексі з деацильованою тРНК, тобто не здатні впливати на активність валіл-тРНК синтетази за рахунок формування класичного потрійного комплексу з аміноацил-тРНК.

Іншим контролем було використання валіл-тРНК синтетази із дріжджів. Для цього ферменту раніше було встановлено, що стадією, яка лімітує швидкість, є дисоціація синтезованої аміноацил-тРНК. (Kern et al., 1981).

Рис. 10 Активність валіл-тРНК синтетази в присутності EF-1 (1,3) та без нього (2,4) при використанні як субстратів препаратів тРНК з різним вмістом тРНКVal. В одному препараті тРНК містилося 20,4% тРНКVal (1,2), в іншому - 2.5% тРНКVal (3,4). Для збагаченого препарату кількість тРНКVal на точку прямої була 13.1 мкг, для сумарного - 13.8 мкг.

Рис.11. Активність валіл-тРНК синтетази з дріжджів в присутності (1) та без (2) EF-1. Концентрація валіл-тРНК синтетази - 1.6 нМ. Кількість EF-1 50 пмоль/100мкл суміші. Кінцева концентрація EF-1 - 31 нМ.

Але додавання EF-1, незважаючи на те, що цей білок має високу спорідненість до аміноацил-тРНК, не впливало на синтез валіл-тРНК (рис.11) навіть у присутності субодиниць EF-1H, які каталізують GDP/GTP обмін в молекулі EF-1.

Таким чином, можна зробити висновок, що прискорення синтезу валіл-тРНК валіл-тРНК синтетазою, яка знаходиться в комплексі з EF-1H, в присутності надлишку EF-1 є специфічним для білків вищих еукаріот і може бути результатом білок-білкових взаємодій в цьому комплексі.

Які компоненти комплексу валіл-тРНК синтетаза - EF-1H важливі для забезпечення функціональної взаємодії EF-1 з валіл-тРНК синтетазою? Для відповіді на це питання було доцільно провести дисоціацію комплексу і потім його реконструкцію в дослідах in vitro з окремих компонентів, вивчаючи вплив кожного з них на стимулюючий ефект EF-1. Раніш було показано, що валіл-тРНК синтетаза, частина N-кінцевого домена якої деградована еластазою, втрачає спорідненість до EF-1H, але залишається такою ж активною в аміноацилюванні (Bec et al, 1994). Ми продемонстрували, що EF-1 ніяк не впливає на активність скороченої з N-кінця валіл-тРНК синтетази (рис.12а). Але не можна виключити, що N-кінцева частина молекули ферменту приймає участь у взаємодії з EF-1, тобто її видалення може призводити до втрати такої взаємодії, і отже до втрати стимулюючого впливу EF-1 на активність валіл-тРНК синтетази. Тому після дисоціації комплексу було отримано нативну валіл-тРНК синтетазу і вивчено ефект EF-1 на її активність. З рис. 12б видно, що EF-1 не впливає і на активність дисоційованого з комплексу нативного ферменту навіть за присутності EF-1. Таким чином, асоціація валіл-тРНК синтетази з EF-1H абсолютно необхідна для функціональної взаємодії ферменту з EF-1. Питання про те, який з компонентів EF-1H є важливим для цієї взаємодії залишається відкритим, тому що ні EF-1, ні EF-1, ні їх комбінація не мали ніякого впливу на активність індивідуальної валіл-тРНК синтетази як в присутності, так і без EF-1. Не змінювала загальної картини і зміна порядку добавлення різних субодиниць EF-1H при реконструкції комплексу. Необхідно зауважити, що згідно з літературними даними EF-1 має дуже велику здатність до самоагрегації та неспецифічної агрегації з іншими компонентами комплексу (Bec et al, 1994), і тому коректна реконструкція комплексу EF-1H з окремих компонентів може бути утруднена, якщо не неможлива. Оскільки нами було виявлено, що EF-1 значно чутливіший до дії еластази, ніж інші компоненти комплексу, альтернативним шляхом визначення можливої ролі EF-1 міг би бути частковий гідроліз еластазою комплексу валіл-тРНК синтетаза-EF-1H. Але і цей метод не дав чіткої відповіді. Отже, здається ймовірним, що для підтримання функціональної взаємодії валіл-тРНК синтетази з EF-1H є необхідним комплекс валіл-тРНК синтетаза-EF-1H як єдине ціле. Роль окремих компонентів EF-1H в забезпеченні безпосередньої передачі заново синтезованої валіл-тРНК від валіл-тРНК синтетази до EF-1 потребує подальшого дослідження.

Рис.12 Активність індивідуальної валіл-тРНК синтетази без N-кінцевої частини молекули (А) та індивідуальної інтактної валіл-тРНК синтетази (Б) в присутності (1) та без (2) EF-1 Концентрація модифікованої валіл-тРНК синтетази - 2.5 нМ, інтактної - 2.7 нМ. 100 мкМ GTP і 110 нМ EF-1 були присутні в кожній суміші.

Таким чином нами встановлено феномен функціональної взаємодії фактора елонгації трансляції EF-1 з валіл-тРНК синтетазою. Стимулювання активності синтетази фактором, очевидно, відбувається шляхом прискорення дисоціації синтезованої валіл-тРНК з ферменту за рахунок передачі цієї аміноацил-тРНК у потрійний комплекс EF-1-GTP-валіл-тРНК. Для здійснення такої взаємодії обов'язковим є комплексоутворення між валіл-тРНК синтетазою та EF-1H. Разом з тим нами було показано, що в клітинах ссавців ченелінг відбувається за участі більшості, якщо не всіх аміноацил-тРНК. Виникає питання, чи можна виявити в дослідах in vitro взаємодію EF-1 із тими аміноацил-тРНК синтетазами, які не входять до складу різних високомолекулярних комплексів? Зробити це було вирішено на прикладі фенілаланіл-тРНК синтетази з печінки кроля.

Встановлено, що додавання EF-1-GDP до інкубаційної суміші призводило до двократного підвищення активності фенілаланіл-тРНК синтетази (рис.13).

Рис.13. Активність фенілаланіл-тРНК синтетази з печінки кроля в присутності (1) та без (2) 50 пмоль EF-1.. Об'єм інкубаційної суміші - 50 мкл.

Каталітична константа (kcat) ферменту в присутності EF-1 (0.76 сек-1) була в два рази вищою, ніж без нього (0.38 сек-1). Слід особливо відзначити, що на відміну від валіл-тРНК синтетази, активація фенілаланіл-тРНК синтетази відбувалася під дією GDP-форми EF-1.

Це дозволило припустити, що механізми стимулювання цих двох ферментів різні, і активація фенілаланіл-тРНК синтетази може бути не зв'язана з формуванням класичного потрійного комплексу аміноацил-тРНК-EF-1-GTP, тобто з прискоренням дисоціації аміноацил-тРНК з ферменту, а відбуватися за рахунок фактор-синтетазної взаємодії на етапах до дисоціації синтезованої аміноацил-тРНК. Дійсно, залежність рівня активації від концентрації EF-1 була подібна до сигмоїдальної, що є типовим для алостеричних взаємодій (рис.14). Це може свідчити на користь безпосередньої взаємодії фенілаланіл-тРНК з EF-1. Про специфічність ефекту активації свідчить незмінність ферментативної активності в присутності сироваткового альбуміну бика та прокаріотичного фактора елонгації трансляції EF-Tu.

Рис.14 Активність фенліаланіл-тРНК синтетази в присутності різної кількості EF-1.. За 100% прийнято кількість фенілаланіл-тРНК (12 пмоль), синтезованої без участі EF-1. Об'єм інкубаційної суміші - 50 мкл. Час інкубації - 2,5 хв.

Для перевірки припущення про те, що фактор EF-1 впливає на першу стадію реакції аміноацилювання, було вивчено його дію на АТР-пірофосфатний обмін, який каталізує фенілаланіл-тРНК синтетаза. Встановлено, що швидкість цієї реакції також стимулюється фактором елонгації EF-1 (рис.15). Спостерігалася також S-образність кривої залежності активності синтетази в реакції АТР/РРі обміну від концентрації EF-1.

Рис.15 Швидкість ATP-пірофосфатного обміну, що каталізує фенілаланіл-тРНК синтетаза, в присутності (1) та без (2) 50 пмоль EF-1. Об'єм інкубаційної суміші - 100 мкл.

Таким чином, можна зробити висновок, що стимуляторний ефект EF-1 не пов'язаний з прискоренням дисоціації аміноацил-тРНК, як у випадку валіл-тРНК синтетази. Цілком ймовірно, що взаємодія фактор-синтетаза або фактор - тРНК - синтетаза веде до зміни конформації фенілаланіл-тРНК синтетази, яка стає більш сприятливою до синтезу фенілаланіладенілата, прискорюючи таким чином і загальну швидкість аміноацилювання. Говорячи про можливі механізми стимуляції слід вказати, що для фенілаланіл-тРНК синтетаз із дріжджів та E.coli швидкість-лімітуючими етапами є якісь процеси, що відбуваються до дисоціації аміноацил-тРНК з ферменту (Fasiolo et al, 1978, Baltzinger et al, 1982, Dibbelt et al, 1981). Це свідчить на користь нашого висновку про природу стимуляції фактором фенілаланіл-тРНК синтетази. Оскільки цей ензим має чотири субодиниці та два активних центри, та беручи до уваги, що в літературі вже було висунуто припущення щодо можливості кооперативної взаємодії між каталітичними центрами субодиниць (Dibbelt et al, 1981), не є несподіваним сигмоїдальний характер кривої впливу концентрації EF-1 на синтез фенілаланіл-тРНК і на ATP-пірофосфатний обмін, що каталізує фенілаланіл-тРНК синтетаза.

Таким чином, EF-1-GDP може взаємодіяти з фенілаланіл-тРНК синтетазою ще до аміноацилювання тРНК та під час цього процесу. Яке функціональне значення цієї взаємодії? В наведеній раніше схемі ченелінга фактора елонгації 1 в GTP-формі відводилася роль акцептора аміноацил-тРНК після її синтезу аміноацил-тРНК синтетазою. Суттєві докази на користь цього механізму отримані нами на прикладі валіл-тРНК синтетази. Стимуляція фенілаланіл-тРНК синтетази, очевидно, не є наслідком функціонування цього механізму, бо відбувається на стадіях до дисоціації аміноацил-тРНК з ферменту. Одним з найменш з'ясованих моментів у схемі ченелінга тРНК в білковому синтезі є шлях між Е сайтом рибосом та аміноацил-тРНК синтетазами. Нещодавно було отримано дані, про те, що деацильована тРНК, так само як і аміноацил-тРНК, не є вільною у клітині, а завжди знаходиться в комплексі з клітинними структурами (Stapulionis et al, 1995). Розвиваючи гіпотезу ченелінга, ми запропонували, що EF-1, який знаходиться в GDP-формі після гідролізу GTP під час взаємодії аміноацил-тРНК з А сайтом рибосоми, здатний зв'язувати деацильовану тРНК в Е сайті рибосоми, дисоціювати з рибосоми у складі потрійного комплексу EF-1-GDP-тРНК та переносити тРНК до аміноацил-тРНК синтетази. В цьому випадку виявлена стимуляція GDP-формою EF-1 першої стадії реакції аміноацилювання тРНК може бути простим відзеркаленням взаємодії неканонічного потрійного комплексу з аміноацил-тРНК синтетазою. Певна річ, що це не виключає можливості взаємодії фактора із синтетазою і після синтезу аміноацил-тРНК.

Для доказу цієї гипотези в першу чергу необхідно показати існування неканонічного потрійного комплексу EF-1*GDP*тРНК. Ряд непрямих спостережень, що вказували на досить велику ймовірність формування такого комплексу, вже були зроблені в цій роботі. Але можливість утворення комплексу EF-1*GDP*тРНК була вперше прямо доказана нами методом мембранної фільтрації. Одночасно було підтверджено можливість утворення комплексу EF-1*GTP*тРНК. Комплекс EF-1*GDP*тРНК було охарактеризовано флуоресцентним аналізом. Вивчалася флуоресценція п'яти триптофанілових залишків в молекулі EF-1, яка може змінюватися при формуванні комплексу з тРНК. Дійсно, спостерігалося збільшення інтенсивності сигналу вже в присутності удвічі меншої кількості тРНК, ніж кількість фактора (рис.16a). Цікаво, що підвищення інтенсивності можна було реєструвати навіть на фоні неспецифічного зменшення рівня флуоресценції за рахунок адсорбції світла молекулами тРНК. Таким чином, реальний вплив тРНК на ендогенну флуоресценцію був дещо більшим, ніж детектувалося в експерименті, проведеному без урахування здатності тРНК поглинати світло. Зростання інтенсивності флуоресценції відображає зміну оточення флуорофорів в молекулі EF-1, тобто може свідчити про конформаційну перебудову білка при утворенні комплексу з тРНК. Більш однозначним свідченням формування такого комплексу, не зв'язаним з можливими артефактами за рахунок світлопоглинання тРНК, може бути зсув максимуму спектра ендогенної флуоресценції білка при добавленні тРНК. Дійсно, в контрольному експерименті не спостерігалося ніякого впливу тРНК на положення максимуму флуоресценції модельного пептиду NaTa, у той час, коли та ж концентрація тРНК спричиняла помітний (2нм) зсув максимуму флуоресценції EF-1 у бік збільшення довжини хвилі.

Отже, зміна положення максимуму та інтенсивності флуоресценції EF-1 в присутності тРНК недвозначно свідчить про зміну конформації фактора елонгації в комплексі з тРНК. А що відбувається з молекулою тРНК в такому комплексі? Відповідь на це питання було отримано за допомогою методів РНКазного гідролізу та хімічної модификації тРНК різної специфічності. Картина гідролізу тРНКPhe в присутності EF-1-GDP нуклеазою отрути кобри показана на рис. 17А. Виявлено, що EF-1-GDP захищає від дії РНКази нуклеотиди в 68 та 69 положенні акцепторного стебла молекули тРНК. Крім того, присутність EF-1 призводить до появи нових розривів в позиції 66 акцепторного стебла і в позіціях 73 та 74 ССА-кінця молекули. Цікаво, що при заміні EF-1-GDP на EF-1-GTP не відбувається індукції нових розривів або захисту інших нуклеотидів в молекулі тРНК. На рис.17Б показано результати гідролізу тРНКLeu РНКазою Т1. В присутності EF-1 cпостерігається підсилення гідролізу молекули тРНК після G57 TC петлі та G70 акцепторного стебла, а також деяке підсилення розривів на 3' стороні варіабельної петлі. Останнє може бути спеціфичним для довгопетельних тРНК, до класу яких належить тРНКLeu. Дія РНКази Р1, яка специфічна до односпіральних ділянок молекули тРНК, була однаковою як в присутності, так і без EF-1, тобто цілком ймовірно, що більшість односпіральних частин молекули тРНК не беруть участі у взаємодії з EF-1.

Представлено результати хімічної модіфікації тРНКPhe етилнітрозосечовиною. EF-1 специфічно захищає від алкілування 3'фосфатні групи нуклеотидів G52, G53, A58, U68 та C69, тобто частини акцепторного стебла, TC-петлі та TC-стебла тРНКPhe. Узагальнюючи дані РНКазного гідролізу та хімічної модифікації, можна зробити висновок, що ці результати прямо підтверджують утворення комплексу EF-1-GDP-тРНК, та дозволяють ідентифікувати сайти тРНК, які приймають участь у взаємодії з EF-1 . Індукція нових сайтів гідролізу та посилення деяких існуючих розривів свідчить про певні конформаційні зміни молекули тРНК під час взаємодії з EF-1. Вартим уваги є те, що переведення молекули EF-1 у GTP-форму, хоч і супроводжувалося деякою зміною амплітуди протекторної дії цього білка на гідроліз тРНК нуклеазою отрути кобри, але не викликало появи нових сайтів захисту і нових сайтів гідролізу тРНК. Це може свідчити про подібну конформацію молекули тРНК під час її взаємодії з GDP- або з GТP- формами фактора.

Для з'ясування просторової організації комплексу EF-1-GDP-тРНК ми використали вже відому за даними рентгеноструктурного аналізу структуру класичного потрійного комплексу прокаріотичного фактора елонгації EF-Tu, аналога GTP та фенілаланіл-тРНК дріжджів (Nissen et al, 1995). При накладанні на цю структуру визначених нами сайтів деацильованої тРНК, що беруть участь у взаємодії з фактором, було виявлено практично повний їх збіг з ділянками молекули аміноацил-тРНК, які приймають участь у взаємодії з прокаріотичним фактором в кристалі комплексу. Цікаво, що такий збіг спостерігається незважаючи на те, що порівнюються комплекс тРНК з GDP-формою еукаріотичного фактора та комплекс аміноацил-тРНК із GTP-формою прокаріотичного фактора. Отже, існує досить велика ймовірність існування в молекулі EF-1 спільного сайта для зв'язування аміноацил-тРНК і тРНК, або часткового перекриття цих сайтів.

Літературні дані свідчать про відсутність значної конформаційної різниці між GTP- та GDP- формами EF-1 (van Damme et al, 1992). Ми, в свою чергу, не виявили істотної різниці між ділянками взаємодії тРНК з GTP- та GDP-формами EF-1. В такому разі визначені нами сайти взаємодії тРНК з EF-1 напевно будуть вірними і для класичного потрійного комплексу EF-1*GTP*аміноацил-тРНК, тобто отримані результати є фактично першими, що дають певну інформацію про ділянки тРНК, які приймають участь в формуванні класичного потрійного комплексу аміноацил-тРНК*EF-1*GTP. Отже, ці результати є дуже важливими і з точки зору розуміння подробиць загального механізму елонгації поліпептидного ланцюга у вищих еукаріот.

Таким чином, підтверджено утворення неканонічного потрійного комплексу EF-1*GTP*тРНК. Але чи може тРНК в такому комплексі переноситися до аміноацил-тРНК синтетази, як запропоновано в нашій моделі ченелінга? Для доказу цього необхідно було довести формування четвертинного комплексу EF-1*GDP*тРНК-аміноацил-тРНК синтетаза. Порівнюючи відомі просторові структури комплексу фенілаланіл-тРНК синтетази (Тh.termophilus) з тРНКPhe (Goldgur et al, 1997) та комплексу EF-Tu*GMPPNP*фенілаланіл-тРНК (Nissen et al, 1995), можна пересвідчитися у тому, що немає стеричних перешкод для утворення четвертинного комплексу. Для прямої експериментальної перевірки можливості існування такого комплексу було застосовано метод "затримки у гелі", який базується на зміні рухливості нуклеїнової кислоти протягом її електрофорезу в присутності білків, до яких вона має спорідненість (Sioud et al, 1996). Було використано електрофорез в агарозі, який дозволяв рухатися досить великим макромолекулярним комплексам при показниках рН, що незначно відрізнялися від їх ізоелектричної точки. Електрофореграма дозволяє оцінити утворення різних комплексів тРНКPhe. Видно, що спостерігається затримка руху 32Р-тРНКPhe як наслідок утворення комплексу з EF-1-GDP або з фенілаланіл-тРНК синтетазою.

Найбільш вагомим є той факт, що при змішуванні EF-1-GDP, фенілаланіл-тРНК синтетази та тРНКPhe відбувається очевидний зсув смуги тРНК в ще більш "високомолекулярну" зону геля, що свідчить про утворення четвертинного комплексу EF-1*GDP*тРНКPhe*фенілаланіл-тРНК синтетаза. Цікаво, що EF-1*GDP*тРНК не утворює четвертинний комплекс ні з гліцеральдегідфосфатдегідрогеназою, яка має такий же заряд (рІ~8.0), ані з каталазою, яка має таку ж молекулярну масу (240 Кда) як фенілаланіл-тРНК синтетаза. Це свідчить про специфічність утворення комплексу EF-1*GDP*тРНКPhe*фенілаланіл-тРНК синтетаза. Отже, підтверджено наше припущення, що причиною стимуляторної дії EF-1 на активність фенілаланіл-тРНК синтетази є формування комплексу фактора і ферменту ще до початку аміноацилювання. Такий комплекс може впливати на взаємодію між активними центрами фенілаланіл-тРНК синтетази, прискорюючи стадію синтезу фенілаланіладенілату, і крім того забезпечувати оптимальну орієнтацію молекули тРНК по відношенню до активного центра ензиму.

Концепція функціональної компартменталізації білкового синтезу у вищих еукаріот. Узагальнюючи картину, можна зробити висновок про існування двох шляхів передачі тРНК між аміноацил-тРНК синтетазою і EF-1. Деацильована тРНК передається від EF-1-GDP до аміноацил-тРНК синтетази (показано на прикладі фенілаланіл-тРНК синтетази), а аміноацил-тРНК передається від аміноацил-тРНК синтетази до EF-1-GТP (показано на прикладі валіл-тРНК синтетази). Беручи це до уваги, ми пропонуємо таку модель функціонування апарату трансляції в режимі ченелінга тРНК. EF-1 є човником між рибосомами і гіпотетичним макромолекулярним комплексом, який містить аміноацил-тРНК синтетази та EF-1H. За допомогою EF-1 відбувається безпосереднє перенесення аміноацил-тРНК від цього комплексу до рибосоми та перенесення деацильованої тРНК від рибосоми до цього комплексу. EF-1-GTP працює в напрямку "аміноацил-тРНК синтетаза - рибосома", EF-1-GDP - в напрямку "рибосома - аміноацил-тРНК синтетаза". В цій моделі ченелінг аміноацил-тРНК/тРНК забезпечується мікрокомпартменталізацією EF-1, аміноацил-тРНК синтетаз, EF-1H, рибосом та мРНК в клітині. Дуже цікаво, що з моделі виникає можливість співкомпартменталізації мРНК та пула тРНК з антикодонами, які відповідають кодонам мРНК на цій ділянці, що дозволяє запропонувати якісно новий підхід до з'ясування причин високої точності трансляції в еукаріотичних клітинах.

Отже, результати наших експериментів свідчать про наявність в клітинах ссавців, крім структурної, ще й функціональної компартменталізації апарату білкового синтезу. Функціональна компартменталізація - це формування трансляційних компартментів, яке необхідне для оптимального функціонування апарату білкового синтезу в клітинах вищих еукаріот. Базуючись на власних та літературних даних ми пропонуємо таке визначення трансляційного компартмента. Трансляційний компартмент - це сукупність (ансамбль) макромолекулярних комплексів, які утворюються та розпадаються під час трансляції мРНК на рибосомах в обмеженому клітинному просторі. До складу компартмента входять тРНК, аміноацил-тРНК синтетази, фактори елонгації, ряд інших білків, таких, наприклад, як несинтетазні компоненти високомолекулярного комплексу аміноацил-тРНК синтетаз, а також мРНК та рибосоми. Функціональне значення трансляційного компартмента головним чином полягає в забезпеченні можливості прямої передачі субстратів білкового синтезу, зокрема деацильованої тРНК та аміноацил-тРНК, від одного комплексу до іншого в ланцюзі послідовних реакцій під час трансляції мРНК. Структурною основою формування трансляційних компартментів окрім компонентів білок-синтезуючого апарату можуть бути актинові філаменти цитоскелету, а також мембрани шорсткого ендоплазматичного ретикулуму. компартменталізація ченелінг клітина ссавець

У клітині трансляційні компартменти організовані таким чином, що доступ экзогенних тРНК, які не знаходяться в цей час в комплексі з білками, усередину компартмента є утрудненим. Це відбувається тому, що аміноацил-тРНК і тРНК постійно перебувають у фізичному зв'язку з будь-яким із трансляційних комплексів. Водночас утруднений і вихід назовні ендогених тРНК, які вже функціонують в компартменті. Трансляційний компартмент являє собою досить лабільне утворення і може частково або повністю розпадатися при повному завершенні трансляції даної мРНК чи за несприятливих зовнішніх умов, які викликають зупинку білкового синтезу.

Висновки

1. Певне теоретичне уявлення про можливість компартменталізації апарату білкового синтезу вищих еукаріот не було підтверджено на початок наших досліджень ніякою експериментальною інформацією щодо функціонального значення цього феномену. В представленій дисертації отримано грунтовні експериментальні дані, які дозволили розробку концепції функціональної компартменталізації апарату трансляції та гіпотетичної моделі структурно-функціональної організації трансляційного компартменту. Вперше запропоновано схему ченелінга тРНК/аміноацил-тРНК, яка детально описує різні варіанти передачі тРНК під час синтезу поліпептидного ланцюга. Показано потенційне регуляторне значення функціональної компартменталізації, у тому числі запропоновано її можливу роль в забезпеченні точності трансляції в клітинах вищих еукаріот.

2. Вперше розроблено та використано систему спряженої пермеабілізації-трансляції в клітинах тварин та людини, що забезпечує таку ж швидкість білкового синтезу, як і інтактні клітини. Розроблено методи виділення фактора елонгації 1 та фенілаланіл-тРНК синтетази з печінки кроля.

3. Виявлено структурно-функціональну компартменталізацію аміноацил-тРНК в клітинах вищих еукаріот:

а) в експериментах з подвійною міткою показано, що ендогенна аміноацил-тРНК не виходить назовні з пермеабілізованих клітин китайського хом'ячка, тоді як розподіл екзогенно доданої аміноацил-тРНК між клітинним та позаклітинним просторами є пропорційним об'ємам цих просторів;

б) встановлено, що ендогенна аміноацил-тРНК, на відміну від екзогенно доданої, захищена від гідролізу добавленою зовні РНКазою в пермеабілізованих клітинах;

в) виявлено, що додана зовні аміноацил-тРНК не може ефективно використовуватись апаратом трансляції пермеабілізованих клітин, в той час, коли ендогенна аміноацил-тРНК бере активну участь в трансляції.

4. На прикладі пермеабілізованих фібробластів людини показано можливість залежного від вмісту макроергів розпаду трансляційних компартментів:

а) методом флуоресцентної мікроскопії продемонстровано зміну внутрішньоклітинної локалізації фактора елонгації EF-1 в залежності від фосфокреатину;

б) не виявлено впливу фосфокреатину на локалізацію іншої субодиниці фактора елонгації EF-1;

в) запропоновано існування нового рівня регуляції білкового синтезу - шляхом асоціації-дисоціації трансляційних компартментів;

г) припущено, що одним із посередників в такому типі регуляціїї є неактивні конформери тРНК, які утворюються в організмі за екстремальних умов та мають інгібіторний вплив на трансляцію мРНК.

5. Визначено функціональну роль стабільного комплексу валіл-тРНК синтетаза-EF-1H в клітинах вищих еукаріот:

а) показано, що EF-1-GTP стимулює початкову швидкість синтезу валіл-тРНК валіл-тРНК синтетазою, яка перебуває в комплексі з мультисубодиничною формою фактора елонгації EF-1 (EF-1H). Відсутність ефекту GDP-форми фактора свідчить про участь в механізмі стимуляції класичного потрійного комплексу EF-1*GTP*аміноацил-тРНК;

б) продемонстровано специфічність функціональної взаємодії EF-1 з валіл-тРНК синтетазою для білків вищих еукаріот;

в) виявлено абсолютну необхідність перебування валіл-тРНК синтетази в комплексі з EF-1H для її функціональної взаємодії з EF-1, що свідчить про визначальну роль цього комплексу в забезпеченні ченелінга валіл-тРНК.

6. Запропоновано і експериментально доведено можливість прямої передачі деацильованої тРНК від EF-1 до аміноацил-тРНК синтетази:

а) продемонстровано істотний стимуляторний ефект EF-1-GDP на активність фенілаланіл-тРНК синтетази в активації амінокислоти та аміноацилюванні тРНК;

б) різними методами доказано утворення неканонічного потрійного комплексу EF-1*GDP*тРНК;

в) продемонстровано утворення четвертинного комплексу EF-1*GDP*тРНК*фенілаланіл-тРНК синтетаза.

7. Розроблено концепцію функціональної компартменталізації білок-синтезуючого апарату вищих еукаріот та гіпотетичну модель структурно-функціональної організації трансляційного компартменту. Зокрема, висунуто експериментально обгрунтоване положення про протилежно направлену дію комплексів EF-1-GDP та EF-1-GTP в доставці тРНК від рибосоми до аміноацил-тРНК синтетази та доставці аміноацил-тРНК від аміноацил-тРНК синтетази до рибосоми відповідно.

Перелік робіт, що опубліковані за темою дисертації

1. Negrutskii B.S., Deutscher M.P. Channeling of aminoacyl-tRNA for protein synthesis in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - 88. - P. 4991-4995.

2. Negrutskii B.S., Deutscher M.P. A sequestered pool of aminoacyl-tRNA in mammalian cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - 89. - P. 3601-3604.

3. Negrutskii B. S., Stapulionis R., Deutscher M.P. Supramolecular organization of the mammalian translation system. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. - 91. - P. 964-968.

4. Negrutskii B.S., Budkevich T.V., Shalak V.F., Turkovskaya G.V., El'skaya A.V. Rabbit translation elongation factor 1 stimulates the activity of homologous aminoacyl-tRNA synthetase // FEBS Lett. - 1996. - 382. - P.18-20.

5. Petrushenko Z.M., Negrutskii B.S., Ladokhin A.S., Budkevich T.V., Shalak V.F., El'skaya A.V. Evidence for the formation of an unusual ternary complex of rabbit liver EF-1 with GDP and deacylated tRNA. // FEBS Lett. - 1997. - 407. - P. 13-17.

6. Negrutskii B.S., El'skaya A.V. Eukaryotic translation elongation factor 1: structure, expression, functions, and possible role in aminoacyl-tRNA channeling. // Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. - 1998. - 60. - P. 47-78.

7. Negrutskii B.S., Shalak V.F., Kerjan P., El'skaya A.V., Mirande M. Functional interaction of mammalian valyl-tRNA synthetase with elongation factor EF-1 in the complex with EF-1H. // J. Biol. Chem. - 1999. - 274. - P.4545-4550.

8. Негруцкий Б.С. Транспортная РНК как фактор регуляции белкового гомеостаза. // Биополимеры и клетка. - 1989. - 5. - №5. - С. 5-18.

9. Негруцкий Б.С. Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека. // Биополимеры и клетка. - 1997. - 13. - №1. - С. 70-74.

10. Негруцкий Б.С. Влияние фосфокреатина на распределение различных субъединиц фактора элонгации трансляции 1 в пермеабилизированных фибробластах человека. // Биополимеры и клетка. - 1997. - 13. - №5. - С. 380-385.

11. Негруцкий Б.С. Цитоскелет и факторы элонгации трансляции. // Биополимеры и клетка. - 1997. - 13. - №6. - С. 436-441.

12. Негруцкий Б.С. Ченелинг в белковом синтезе. // Биополимеры и клетка. - 1998. - 14. - №3. - С. 177-183.

13. Shalak V.F., Budkevich T.V., Negrutskii B. S., El'skaya A.V. A fast and effective method for purification of elongation factor 1 from rabbit liver. // Укр. бiохiм. журн. - 1997. - 69. - №2. - С. 104-109.

14. Шалак В.Ф., Турковская Г.В., Семенихин К.А., Негруцкий Б.С. Экспресс-метод для выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика. // Биополимеры и клетка. - 1994. - 11. - №1. - С. 24-27.

15. Негруцкий Б.С., Ельская А.В. Влияние различных конформеров тРНК на трансляцию мРНК в бесклеточных системах. // Укр. биохим. журнал.-1989.-61.-№3.- С. 58-62.

16. Negrutskii B.S., El'skaya A.V. The interaction between biologically inactive tRNA conformers and leucyl-tRNA synthetase from rabbit liver. // Eur. J. Biochem.-1987.-164.- P. 56-59.

17. Негруцкий Б.С., Ельская А.В. Взаимодействие различных конформеров деацилированной тРНК с 80S рибосомами. // Биополимеры и клетка.-1987.-3.-№3.- C. 131-134.

18. Негруцкий Б.С. Препаративное получение рибосомальных субчастиц из печени кролика. // Структура и генетические функции биополимеров.-Киев.-Наук.думка.-1981.-C. 36-38.

19. Негруцкий Б.С. Система сопряженной пермеабилизации-трансляции в клетках животных и человека // Молекулярная генетика и биотехнология. - Минск.- 1998.-С. 236-238.

20. Роднина М.В, Негруцкий Б.С. Деацилированная тРНК и контроль трансляции // Материалы школы-конференции "Структура и функция биополимеров". - Львов. - 1988. - С.88.

21. El'skaya A., Negrutskii B., Turkovskaya G., Ovcharenko G., Shalak V., Palchevskii S., Budkevich T. Specific features of higher eukaryotic translation machinery // Proc. International Conf. "Frontiers in translation". - Victoria (Canada). - 1995. - P.168.

22. Negrutskii B., Shalak V., Budkevich T., El'skaya A. Functional interaction between translation elongation factor 1 and phenylalanyl-tRNA synthetase from rabbit liver // Proc. International Conf. "Frontiers in translation". - Victoria (Canada). - 1995. - P.169.

23. Negrutskii B., Budkevich T., Shalak V., Turkovskaya G., El'skaya A. Elongation factor 1 from rabbit liver stimulates homologous phenylalanyl-tRNA synthetase // Abstr.of 16th Intern. tRNA. - Madison (USA). - 1995. - P. 185.

24. Petrushenko Z.M., Negrutskii B.S.,Budkevich T.V.,Shalak V.F., El'skaya A.V. Similar sites of tRNA molecule are involved in [tRNA.EF-1.GDP] and [aminoacyl-tRNA.EF-Tu.GDPNP] complexes. // Abstr. of 17th Inter. tRNA Workshop. - Shiba (Japan). -1997. - P.8-26.

25. Negrutskii B.S. The effect of phosphocreatine on the distribution of different subunits of translation elongation factor 1 in gently permeabilized human fibroblasts. // Abstr. of 17th Inter. tRNA Workshop. - Shiba (Japan). -1997. - P.8-17.

26. Negrutskii B.S., Shalak V.F., Kerjan P., El'skaya A.V., Mirande M. Channeling of aminoacyl-tRNA in the valyl-tRNA synthetase:EF-1H complex // Abstr. of EMBO Workshop on Structure and Function of aminoacyl-tRNA synthetases. - Mittelwihr(France). - 1998. - P.114.

27. El'skaya A.V., Petrushenko Z.M., Negrutskii B.S., Budkevich T.V., Shalak V.F. Eukaryotic aminoacyl-tRNA synthetases and EF-1 as possible partners in tRNA channeling // Abstr. of EMBO Workshop on Structure and Function of aminoacyl-tRNA synthetases. - Mittelwihr(France). - 1998. - P.40.

Размещено на Allbest.ru