Окислительный стресс и особенности воздействия слабых стрессоров физической природы на перекисный гомеостаз растительной клетки

Как антиоксидант аскорбат реагирует с супероксидом кислорода, перекисью водорода и радикалом токоферола, при этом окисляясь до монодегидроаскорбиновой кислоты (МДГА) или дегидроаскорбиновой кислоты (ДГА). Окисленные формы превращаются в аскорбат с помощью редуктаз МДГА и ДГА соответственно. В первом случае используется восстановленный эквивалент NADPH+H+, а во втором - глутатион.

Аскорбиновая кислота может прямо (без апофермента) и в качестве кофактора аскорбатоксидазы инактивировать свободные радикалы, выполняя сходную роль с супероксиддисмутазой:

2O-2 + 2H+ + аскорбат >2H2O2 + ДГА,

а также косвенно принимать участие в детоксикации, восстанавливая токоферол.

Витамин C найден в хлоропластах, цитозоле, вакуолях и внеклеточных компартментах клетки. В клеточной стенке содержится аскорбатоксидаза, катализирующая реакцию с синглетным кислородом 1O2:

1O2 + H+ + 2аскорбат > 2ДГА + 2Н2О

В хлоропластах мезофилла листа находится около 20 - 40% аскорбата. Там же содержатся все ферменты регенерации восстановленной аскорбиновой кислоты из окисленных форм. Было выяснено, что H2O2 обезвреживается в хлоропластах в аскорбат - глутатионовом цикле при участии аскобатпероксидазы.

Глутатион - это маленький пептид, состоящий из трех аминокислотных остатков (?-Глу, Цис, Гли), гамма-глутамилцистеинилглицин. Необычный структурный элемент молекулы - амидная связь, образованная взаимодействием амидной группы цистеина и ?-карбоксильной группы глутаминовой кислоты.

Глутатион защищает тиольные группы белков, инактивирует радикальные частицы, разрушает перекисные соединения, реагирует с активными формами кислорода. Он может стабилизировать мембранные структуры, удаляя ацильные перекиси, образующиеся в ходе ПОЛ. При этом восстановленная форма глутатиона Г - SH превращается в окисленную ГS - SГ. Восстанавливается окисленный глутатион под действием фермента глутатионредуктаза (ГР).

Глутатион является кофактором ферментов глутатионпероксидазы (ГП) - восстанавливает H2O2 до воды при окислении глутатиона:

2G - SH + H2O2 > GS - SG + 2 H2O

и глутатионредуктазы (ГР), которая постоянно находится в клетке в активном состоянии, катализируя восстановление окисленного глутатиона при участии НАДФН+Н+:

НАДФН+Н+ + ГS - SГ > 2Г - SН + НАДФН+.

Глутатион участвует в глутатион - аскорбатном цикле, восстановления дегидроаскорбиновую кислоту без апофермента при pH >7 в клетке и концентрации глутатиона >1мМ.

Способность глутатиона перехватывать свободные радикалы обуславливает его противодействие окислительному стрессу. Кроме того, в условиях стресса, вызванного тяжелыми металлами, растения синтезируют металлсвязывающие белки, такие как фитохелатины. Наличие ?-Глу связи в этих пептидах свидетельствует о том, что они не синтезируются через мРНК, а используют молекулы глутатиона в качестве мономеров. Это уменьшает пул ГSH.

Снижение количества восстановленного глутатиона может также наблюдаться в результате недостатка глутатионредуктазы и/или снижения скорости синтеза. Это может приводить к сильным клеточным повреждениям. Уменьшение пула восстановленного глутатиона может свидетельствовать о его окислении до ГSSГ, катализируемом тяжелыми металлами, либо использовании GSH-прероксидазами в процессе ферментативной регенерации перекисей липидов.

Использование ГSH в антиоксидантной защите у разных видов может происходить по разным механизмам: с преобладанием процессов его ресинтеза или активного участия в окислительно-восстановительных процессах. Второй механизм метаболизма является более уязвимым, так как в условиях стресса при загрязнении ресурс глутатиона истощается. Это может привести к нарушению функционирования глутатионзависимой антипероксидной системы клеток.

Еще один фермент, который участвует в выполнении цитопротекторных функций глутатиона, это глутатион S-трансфераза, которая катализирует коньюгацию эндогенных или экзогенных электрофильных субстратов с глутатионом. Далее конъюгат транспортируется в вакуоль. Показано, что данный фермент вовлекается в механизмы устойчивости растений к различным биотическим и абиотическим факторам, в том числе и воздействию тяжелых металлов.

Пролин (про, pro, P) - гетероциклическая аминокислота (иминокислота). У многих растений она накапливается в условиях биотического и абиотического стрессового воздействия. При этом пролин оказывает стабилизирующее действие на мембраны, уменьшает осмотический стресс, защищает белки от денатурации, участвует в передаче стрессового сигнала, регулирует redox- потенциал клетки. Есть также данные, что он участвует в инактивации свободных радикалов, образуя с ними долгоживущие конъюгаты.

Еще одним важнейшим антиоксидантным звеном растений являются каротиноиды. По химической природе каротиноиды относятся к классу тетратерпеноидов. Их углеводородная структура состоит и 8 изопренов (C5 - углеводородов). Каротиноиды также относят и к классу изопреноидов; они состоят из длинных ветвящихся углеводородных цепей, содержащих несколько сопряженных двойных связей, заканчивающихся на одном (?-каротин) или обоих концах (?-каротин) кольцевой циклической структурой - иононовым кольцом.

Каротиноиды благодаря наличию сопряженных двойных связей, могут связывать синглетный кислород и ингибируют образование свободных радикалов, предупреждая их негативное действие на кна организм. Они обеспечивают защиту от ультрафиолетового излучения, так как могут трансформировать энергию УФ-света в видимый свет, что проявляется в явлении флуоресценции; выступают в роли антиоксидантов, защищая чувствительные ткани и лабильные соединения от окисления.

Каротиноиды снимают избыток энергии у возбужденного хлорофилла или синглетного кислорода и рассеивают ее через процесс нерадиационной релаксации в виде тепла. Таким образом, может быть предотвращен окислительный стресс. Они так же могут переносить электроны с радикала и модифицировать его структуру, предотвращая дальнейшее развитие цепной реакции.

Антиоксидантные (АО) ферменты характеризуются высокой специфичностью по отношению к АФК и отличаются строго определенной локализацией в клетке. Обычно выделяют три линии защиты.

Важнейшим ферментом первой линии антиоксидантной защиты является супероксиддисмутаза (СОД, КФ 1.15.1.11), которая катализирует реакцию дисмутации супероксидного анион-радикала:

Этот фермент имеет молекулярную массу 32 кД и состоит из 2-х субъединиц, каждая из которых содержит по 1 атому Cu и 1 атому Zn. Существует три изоформы СОД, различающиеся металлами, находящимися в активном центре: Cu/Zn-СОД (Mr 30-33 кДа) содержится в цитозоле, хлоропластах, межмембранном пространстве митохондрий, в пероксисомах; Mn-СОД (Mr 75-94 кДа) - в матриксе митохондрий; Fe-СОД (Mr 36-48 кДа) более характерна для прокариот, но существуют сведения о наличии ее в хлоропластах, пероксисомах, митохондриях, пропластидах. Cu/Zn-СОД, так же как и большинство прокариотических Mn-СОД и Fe-СОД являются димерами, в то время как Mn-СОД из митохондрий и определенных термофильных бактерий - тетрамеры. Кроме того, три вида СОД различаются по чувствительности к Н2О2 и цианиду. Mn-СОД устойчива к действию пероксида, а Cu/Zn-СОД и Fe-СОД необратимо ингибируются Н2О2 , в этом случае Cu/Zn-СОД способна проявлять пероксидазную и гидроксил и супероксид-генерирующую активность. Роль отдельных изоформ в общеклеточной активности различна в зависимости от физиологического состояния организма и типа воздействующего фактора.

В результате работы СОД образуется пероксид водорода. Основным ферментом, удаляющим пероксид водорода в клетке является каталаза и класс ферментов пероксидазы (КФ 1.11.1,7), работающие в составе второй линии защиты.

Каталаза (КФ 1.11.1.6) представляет собой гемовый фермент, состоящий из четырех субъединиц с общей молекулярной массой около 240 кД. Это металлопротеин с гемовым железом в активном центре. Обнаружено 5 изоформ каталаз. Необходимы достаточно высокие концентрации Н2О2 для проявления каталитической функции фермента, имеющего невысокое сродство к субстрату и использующего в качестве донора электрона при восстановлении Н2О2 до воды и молекулярного кислорода вторую молекулу пероксида. Каталаза может разложить 44000 молекул Н2О2 в секунду.

Пероксидазы разрушают Н2О2 нерадикальным путем и образуют Н2О при окислении не второй молекулы Н2О2, как в случае каталазы, а других субстратов (АН2):

Н2О2 + АН2 Н2О + А

Пероксидазы различаются по субстратам окисления и строению активного центра. Это металлопротеин, содержащий железо в гемовой форме. Пероксидаза катализирует окисление перекисью водорода или молекулярным кислородом ароматических аминов, анилина, бензидина, тирозина, триптофана, индола, индолилуксусной кислоты, фенолов и т.д. Источником АФК для работы пероксидазы могут быть также органические гидроперекиси. Наиболее распространена в растениях гваяколовая пероксидаза, участвующая в биосинтезе лигнина.

Особое место занимает глутатионпероксидаза, использующая водород сульфгидрильной группы глутатиона для восстановления гидроперекисей липидов в соответствующие спирты и восстановление пероксида водорода до воды. Структурно ферменты данного семейства представляют собой селеносодержащие тетрамеры. В активном центре фермента находится остаток аминокислоты селеноцистеина. Атом селена находится в степени окисления ?1 и окисляется пероксидом до SeOH. Далее SeOH соединяется с молекулой глутатиона (гSH), и затем соединяется с другой молекулой глутатиона. При этом регенерируется Se? и образуется побочный продукт - окисленный глутатион (гS-Sг). Окисленный глутатион восстанавливается ферментом глутатионредуктазой и цикл замыкается. При восстановлении глутатиона глутатионредуктазой донором электронов служит НАДФН, образующийся, например в световых реакциях фотосинтеза или окислении глюкозы.

Аскорбатпероксидазу (АП) относят к новому семейству пероксидаз, включающих цитохром-с-пероксидазу из дрожжей и прокариотическую каталазу-пероксидазу. От гваяколовой пероксидазы, АП отличаются не только специфичным донором, но и аминокислотной последовательностью, и физиологическими функциями.

Аскорбатпероксидаза (КФ 1.11.1.II., Mr 28-58 кДа), содержит гемовое железо. В хлоропластах выделены стромальная и связанная с тилакоидной мембраной аскорбатпероксидаза. Растворимая форма аскорбатпероксидазы была обнаружена в 1979 г. учеными Келли и Латзко, а тилакоид-связанную форму выделили впервые Гроден и Бек. Тилакоидная форма локализована преимущественно вблизи акцепторной части ФС I, что обеспечивает перехват молекул Н2О2 вблизи места их образования.

Аскорбатепроксидазная реакция - это центральный процесс целого цикла реакций, направленного на удаление основных активных форм кислорода в хлоропластах. Все части антиоксидантной системы работают слаженно, и также как и многие другие процессы в клетке зациклены. Примером такого цикла является аскорбат-глутатионовый цикл, или водно-водный цикл, или по именам его исследователей - цикл Холливела - Асады. Он работает в разных компартментах клетки: цитозоле, пероксисомах, митохондриях, но главным образом - в хлоропластах растений, в которых является единственным способом удаления пероксида водорода, ввиду отсутствия каталазы. Цикл включает в себя ферменты: аскорбатпероксидазу (АП), монодегидроаскорбатредуктазу (МДАсР), дегидроаскорбатредуктазу (ДАсР) и глутатионредуктазу (ГР). Во время работы цикла происходит восстановление Н2О2 в присутствии аскорбиновой кислоты, которая восстанавливается при окислении глутатиона. Окисленный глутатион восстанавливается при участии НАДФН. Основным ферментом цикла является аскорбатпероксидаза.

Название водно-водный цикл подытоживает целый ряд реакций, которые направлены на фотовосстановление молекулярного кислорода до воды в ФС1 электронами, образованными в ФС2 из воды при ее фотоокислении.

Молекулярный механизм водно-водного цикла включает следующие стадии:

1. Окисление воды в ФС2:

2Н2О>4е-+О2+4Н+

2. Фотовосстановление молекулярного кислорода до супероксидного анион-радикала в ФС1 при псевдоциклическом потоке электронов:

2e- + 2O2 > 2O2-•

3. Реакция дисмутации супероксида до пероксида водорода и молекулярного кислорода, катализируемая СОД:

2O2-• + 2 H+ > O2+H2O2

4. Восстановление пероксида водорода аскорбатом до воды, катализируемое АП:

H2O2+2АсК > 2Н2О + 2МДАсК

5. Регенерация окисленной формы аскорбата, монодегидроаскорбата (МДАсК) и/или дегидроаскорбата (ДАсК), при работе соответсвующих редуктаз (МДАсР и ДАсР) за счет восстановленного ферредоксина или НАД(Ф)Н из ФС1, которые в свою очередь восстанавливаются электронами из ФС2:

2е- + 2H+ 2ДАсК > АсК

Таким образом, в водно-водном цикле 2 из 4 электронов от фотовосстановления двух молекул воды идут на одновалентное восстановление О2 (в реакции 2), а остальные 2 - используются при восстановлении окисленного аскорбата (в реакции 5).

Восстановление дегидроаскорбиновой кислоты происходит с использованием протонов трипептида глутатиона. Окисленный глутатион регенерируется при работе глутатионредуктазы (ГР) (КФ 1.6.4.2) в реакции:

GSSG + ГР-НАДФН 2GSH+ГР-НАДФ+

При восстановлении глутатиона донором электронов служит опять фотосинтетическая НАДФН, образующийся в световых реакциях.

В водно-водном цикле скорость псевдоциклического потока электронов на молекулярный кислород в ФС1 на несколько порядков ниже, чем протекание реакций дисмутации супероксида, катализируемой СОД, восстановления пероксида водорода до воды, катализируемой АП, и восстановления окисленных аскорбата и глутатиона. Поэтому водно-водно цикл эффективно уменьшает время жизни фотоиндуцированных АФК - супероксида и пероксида водорода - что позволяет снизить вероятность образования гидроксильных радикалов и их взаимодействие с важнейшими биополимерами хлоропластов, и как следствие - избежать фотоингибирование.



Рис. 5. Аскорбат-глутатионовый цикл (Водно-водный цикл, цикл Холливела - Асады)

К третьей линии защиты относятся глутатион-S-трансферазы (ГТ). ГТ обладают широкой специфичностью к субстратам. ГТ связывают очень многие гидрофобные вещества и инактивируют их, но химической модификации с участием глутатиона подвергаются только те, которые имеют полярную группу. То есть субстратами служат вещества, которые, с одной стороны, имеют электрофильный центр (например, ОН-группу), а с другой стороны - гидрофобные зоны. Такими молекулами являются продукты ПОЛ. Обезвреживание продуктов ПОЛ с участием ГТ, может осуществляться тремя различными способами: путём конъюгации субстрата (R) с глутатионом (ГSH), в результате нуклеофильного замещения, и путем восстановления органических пероксидов до спиртов.

Итак, в клетке постоянно в самых разнообразных процессах происходит образование свободных радикалов и других АФК, и это нормально. Накопление АФК и развитие окислительных процессов сдерживает мощная система антиоксидантной защиты, включающая низкомолекулярные антиоксиданты и ферменты. В норме поддерживается динамическое равновесие между про- и антиоксидантными процесссами, которое получило название перекисного гомеостаза. При различных воздействиях извне может происходить сдвиг этого равновесия в сторону окислительных процессов и тогда развивается окислительный стресс. В многочисленных исследованиях показано, что окислительный стресс представляет собой универсальное следствие воздействия на живую систему разнообразных экстремальных факторов, при этом продукты ПОЛ могут являться «индикаторами» этих воздействий, являясь тем триггером, который запускает ответную реакцию клетки и организма в целом. С другой стороны они могут быть и «первичными медиаторами» стресса как особого состояния клетки, которое может привести к увеличению ее устойчивости и адаптации. При этом для окислительного стресса характерны все стадии неспецифического адаптивного ответа - на стадии тревоги происходит первичная активация ПОЛ, которая быстро меняется мобилизацией антиоксидантных резервов; стадии истощения характерен значительный рост интенсивности перекисного окисления при снижении антиоксидантного потенциала тканей.

Глава 2. Особенности восприятия слабых стрессоров физической природы растительной клеткой

У многоклеточных организмов выделяют 2 уровня восприятия и передачи сигналов. Во-первых, это уровень целого организма, который получает информацию из окружающей среды, во-вторых, это уровень клеточный.

Подавляющая часть клеточных механизмов устойчивости сформировалась на ранних этапах эволюции, поэтому защитные системы у высших растений и более примитивных организмов имеют общую основу. Изменения в метаболизме, физиологических функциях и ростовых процессах при стрессах, прежде всего, связаны с изменениями в экспрессии генов. Ответ на действие стрессора происходит, если растение распознает стрессор на клеточном уровне. Распознавание стрессора, т.е. рецепция сигнала, приводит к активации пути передачи сигнала. Последний поступает в геном, индуцируя или подавляя синтез тех или иных белков. Связанные с экспрессией генов ответные реакции клеток на действие стрессора интегрируется в ответ целого растения, который выражается, например, в ингибировании роста и развития растений, и одновременно в повышении его устойчивости к действию стрессора.

Во время переключения обмена веществ на новый режим при стрессовых воздействиях резервные возможности организма объединяются благодаря системам регуляции. Для координации функциональной активности клетки в нормальных и неблагоприятных условиях среды необходим аппарат регуляции, включающий тесно связанные между собой генетическую, метаболическую (ферментную) и мембранную системы.

Многочисленные исследования последних десятилетий показали, что независимо от природы воздействия, ответ растения на него развивается по некоторой общей схеме, что позволяет говорить о существовании неспецифической стрессовой реакции на воздействия извне. Таким универсальным звеном в реакции растительного организма на действие самых разнообразных факторов может быть некоторое стереотипное изменение внутренней среды клетки, на роль которого многие исследователи и выдвигают окислительный стресс. Однако до настоящего времени ведутся споры о степени универсальности окислительного стресса, как ответной реакции на любое воздействие извне и наличии специфических механизмов для его реализации, зависящих от природы действующего фактора.

Довольно долго АФК рассматривались как неизбежное зло, возникшее при переходе большинства организмов к аэробному образу жизни. Однако оказалось, что роль этих молекул двойственная. В многочисленных работах показано усиление генерации активных форм кислорода в ответ на разнообразные внешние стимулы, но их роль в развитии стресс-реакции до конца не выяснена и является широко обсуждаемым вопросом. С одной стороны повышение продукции активированного кислорода приводит к интенсификации окислительной модификации биомолекул и, как следствие, к изменению перекисного гомеостаза клетки. В то же время известно, что клетки воспринимают и используют АФК в качестве сигнальных молекул, вторичных мессенджеров, которые помогают им анализировать внешние воздействия и внутренние сигналы. Кроме того, в некоторых случаях, клетка начинает сама продуцировать АФК, чтобы с их помощью включать те или иные процессы. Роль пероксида водорода как вторичного мессенджера была подтверждена во многих случаях, связанных с экспрессией генов, контролирующих синтез ферментов-антиоксидантов, а также синтез низкомолекулярных антиоксидантов - аскорбата и глутатиона. Есть данные, что индукция антиоксидантной защиты может быть вызвана генерацией супероксида и пероксида водорода в апопласте.

В растительной клетке генерация значительной части активных форм кислорода происходит в результате функционирования мембранных систем (например, ЭТЦ хлоропластов, митохондрий, плазмалемма), в связи с чем в современной физиологии растений выдвигается гипотеза о сенсорной функции клеточных мембран растений, так как последние не имеют специфической системы восприятия информации окружающей среды, такой, как нервная система животных.

Большое внимание в последнее время уделяется механизмам ответа живых систем на слабые внешние воздействия, с целью выяснения закономерностей, физиологической роли и степени универсальности реакции организма на заведомо неповреждающие агенты среды. Предполагается, что действие факторов, по силе не выходящих за зону толерантности организмов, формируется не вследствие прямого повреждающего эффекта стрессора, а в результате сдвига внутриклеточного гомеостаза.

Многие низкоинтенсивные факторы (например, ионизирующая радиация в малых дозах, химические вещества в низких концентрациях и др.) одинаково воздействуют на биологические системы. В биологии даже появился специальный термин для описания таких воздействий - «эффекты малых доз». Они выражаются в нелинейном, или парадоксальном ответе живой системе на действие низкоинтенсивного фактора - меньшая доза вызывает больший отклик системы, чем более высокая доза воздействия. Особенно широко этот феномен изучается в радиобиологии.

2.1 Воздействие низкоинтенсивной ионизирующей радиации: эффекты малых доз

В настоящее время происходит рост техногенного радиоактивного загрязнения среды в связи с миграцией радиоизотопов по пищевым цепям и почвенным горизонтам в результате выброса огромного количества радиоактивных материалов во время Чернобыльской аварии. Особенности действия некоторых изотопов на растительные организмы связаны с тем, что, являясь метаболическими аналогами некоторых микроэлементов, они активно поглощаются и накапливается растениями, встраиваются в мембраны и активные центры белков, где, даже в сверхмалых концентрациях, способны оказывать пролонгированное низкоинтенсивное ионизирующее действие на компоненты клеточных структур.

Особенность эффектов малых доз радиации состоит в том, что их нельзя получить путем прямой экстраполяции эффектов больших дозах. В последние годы описан целый ряд специфических эффектов малых доз радиации, для которых характерна общность свойств, что свидетельствует о едином механизме из инициации. К эффектам малых доз радиации относят:

1. радиационный гормезис - стимуляция какой - либо системы организма внешними воздействиями, имеющими силу, недостаточную для проявления вредных факторов. Механизм радиационного гормезиса на уровне клетки состоит в инициировании синтеза белка, активации гена, репарации ДНК в ответ на стресс

2. адаптивный ответ - частный случай радиационного гормезиса - универсальная реакцию клеток на облучение в малых дозах, выражающаяся в приобретении устойчивости к поражающему действию излучения в большой дозе или других агентов нерадиационной природы

3. гиперчувствительность, когда меньшие дозы вызывают больший отклик системы (как правило, большие повреждения), чем при больших дозах.

При воздействии низкоинтенсивной ионизирующей радиации на живые организмы в клеточных макромолекулах происходит разрывы химических связей в результате как непосредственной ионизации, так и непрямого действия радиации, вызванного действием свободных радикалов, образовавшихся из других молекул клетки. В биологических системах непрямые эффекты облучения чаще всего связаны с участием высокоактивных продуктов радиолиза воды.

Ввиду особенностей взаимодействия ионизирующей радиации с веществом, процесс радиоактивного повреждения начинается на уровне взаимодействия ионизирующих частиц, фотонов с отдельными атомами вещества. Акт первичного физического взаимодействия квантов и частиц излучения с живым субстратом не зависит от природы облучаемого вещества и сводится к передаче энергии излучения с образованием ионов, переходом электронов в возбужденное состояние. Такие ионы обладают энергией достаточной для ионизации еще нескольких молекул воды. При этом расстояние, на котором происходит каждая последующая ионизация, прогрессивно уменьшается. Происходит образование «блобов», коротких треков и «шпор» - микрообластей распределения промежуточных активных частиц в объеме вещества.

Таким образом, на первой физической стадии радиолиза (10-16-10-15 с) образуются возбужденные Н2О* и сверхвозбужденные Н2О** молекулы воды. Молекулярные ионы воды (их иногда называют "сухая дырка") могут мигрировать по резонансному механизму, возможна также миграция возбуждения.

На следующей физико-химической стадии (10-14с) первичные продукты облучения, взаимодействуя с кислородом и трансформируются в АФК. Происходит диссоциация и автоионизация сверхвозбужденных молекул:

H2O* H+ + OH-

Н2О* Н2 + О

Н2О** Н2O+ + е- .

Н2О+ + Н2О Н3О+ +

К концу физико-химической стадии облученная вода находится в состоянии теплового равновесия. В ней существуют гидратированные электроны, радикалы , и О, Н2О+, Н, которые концентрируются в микрообластях.

На химической стадии (10-10 - 10 -7с) образовавшиеся продукты реагируют друг с другом, что приводит к генерации атомов и молекул водорода, пероксида водорода и ионов гидроксила, сосредоточенных в "блобах", "шпорах" и коротких треках. Одновременно имеет место диффузия этих частиц в объем раствора. В конце этой стадии в воде существуют гидратированные электроны, атомы водорода и кислорода, , ОН- , Н2О2, Н2О+. Вышедшие из мест повышенной концентрации в объем облучаемой системы частицы реагируют с растворенными веществами, со стабильными продуктами радиолиза и с короткоживущими частицами, вышедшими из других мест повышенной концентрации. Эти реакции характеризуются, как правило, весьма высокими константами скорости и низкими энергиями активации. В результате этих реакций в системе происходит разрушение первичных стабильных продуктов радиолиза воды - водорода, пероксида водорода, кислорода - и возникновение вторичных радикальных продуктов. Если разрушается один из продуктов радиолиза, например,

Н + ОН Н2О , или Н2 + ОН Н + Н2О, Н2О2 + егидр ОН- + ОН ,

то говорят об "обратных" реакциях.

Таким образом, основными первичными продуктами радиолиза воды являются .ОН, .Н и гидратированные электроны. Следствием их взаимодействия становится образование Н2О2, а позднее и НО2., представляющего собой протонированную форму супероксидного анион-радикала. В случае малых доз образующиеся первичные радикалы обладают малой возможностью взаимодействия друг с другом, и основными продуктами радиолиза становятся гидратированные электроны и .ОН. Непосредственное образование гидроксильного радикала без промежуточных других АФК является критическим для организма. Крайняя реакционная способность данного радикала, его короткое время жизни (порядка 10-9 с) и отсутствие специализированных антиоксидантов обуславливают особую уязвимость организма перед этой АФК. .ОН окисляет любые органические молекулы, расположенные вблизи места его образования и является основным инициатором радикальных окислительных процессов. Радиолиз органических соединений также приводит к непосредственному образованию органических радикалов и зарождению цепей окисления.

Таким образом, основной эффект низкоинтенсивной ионизирующей радиации реализуется через активацию окислительных процессов.

В структурно-метаболической теории А.М. Кузина (1986), а также в концепции «мембранного механизма биологического действия малых доз, активно развиваемой группой Л.Х Эйдуса (2001) приводятся многочисленные доказательства того, что в отличие от больших доз, первичной мишенью малых считается не ДНК, а клеточные мембраны. Причем многие исследования показали, что помимо АФК, образующихся в результате радиолиза воды при воздействии радиации в малых дозах клетка начинает продуцировать собственные АФК, в частности, супероксид. Существует двоякое представление о роли супероксидного анион-радикала в развитии стрессовой реакции: с одной стороны он может являться просто побочным продуктом функционирования окислительных систем, своеобразным «метаболическим шумом», но может выполнять и позитивную функцию. Например, была показана центральная роль супероксидного радикала в защите субклеточных структур мононуклеарных лейкоцитов от АФК, образуемых ионизирующей радиацией, за счет активирования антиоксидантной системы. При облучении растений в определенном интервале малых доз радиации, также обнаружена продукция супероксида на мембранах хлоропластов, что имело адаптирующую роль, подготавливая клетку к возможному более серьезному воздействию впоследствии (в частности к воздействию теплового шока).

Адаптирующая роль образуемых клеткой АФК обеспечивается слаженной работой систем антиоксидантных ферментов. Антиоксиданты могут обеспечивать сигнальную функцию АФК, с одной стороны, поддерживая их образование, с другой стороны, сдерживая их деструктивную окислительную активность. Например, показано, что повышенная концентрация супероксидного анион-радикала в среде может ингибировать активность аскорбатпероксидазы. В то же время пероксид водорода способен активировать СОД, однако этот эффект имеет колоколообразную зависимость, и избыток Н2О2 может обуславливать неспецифическую пероксидазную активность СОД. Пероксид водорода в этом случае восстанавливает Cu2+, что ведет к инактивации фермента и может обусловить протекание следующих процессов:

Enz-Cu (II) + H2O2 > Enz-Cu(I) + 2H+ +

Enz-Cu (I) + H2O2 > Enz-Cu(II)-OH + OH-

В результате происходит еще большая наработка супероксида.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу регуляторной роли АФК, генерируемых самой мембраной хлоропластов в ответ на действие ионизирующей радиации. Причем этот механизм, по-видимому, имеет адаптивный эффект и включается при некотором пороговом значении воздействия (о чем свидетельствует нелинейный ответ системы в наших экспериментах). Ключевую роль в запуске этих процессов может играть супероксидный анион-радикал, образуемый посредством изменения структурно-функциональной активности мембран хлоропластов в результате облучения.

2.2 Воздействие низкоинтенсивного магнитного поля на перекисный гомеостаз клетки

В окружающей среде постоянно присутствуют электромагнитные поля (ЭМП) естественного и искусственного происхождения. Основными естественными ЭМП являются атмосферное электричество, постоянное МП Земли и геомагнитные вариации, возникающие при взаимодействии земного МП с межпланетной средой. В течение нескольких последних десятилетий уровень интенсивности электромагнитного окружения возрос за счет технических устройств, генерирующих ЭМП. В процессе деятельности человека сформировался новый фактор окружающей среды -- электромагнитные поля искусственного происхождения. Постоянное увеличение количества и мощности устройств, создающих при своей работе электромагнитные поля, привело к тому, что значительная часть экосистем находится под непрерывным действием магнитных полей (МП). В связи с этим обострился интерес к изучению влияния МП на человека и животных.

В конце XX в. в свет вышел ряд работ, посвященных воздействию магнитных полей на всхожесть и интенсивность роста растений и накопления биомассы различных видов живых организмов. Данные, приводимые в этих работах, весьма противоречивы и лишь констатируют факты практического приложения магнитных полей. Поэтому следующим этапом в развитии магнитобиологии стало изучение метаболических перестроек в клетке и субклеточных структурах под действием магнитных полей. Однако глубинные вопросы о механизмах взаимодействия биообъектов с этим физическим фактором до сих пор остаются неизученными.

Интенсивности искусственных магнитных полей как значительно превосходят интенсивность природных источников, то есть естественные поля, так и сравнимы с ней. В первом случае эффекты, вызываемые магнитным полем, связаны с энергетическим воздействием. Для второго случая характер действия остается широко обсуждаемым вопросом.

Слабое низкочастотное магнитное поле является проникающим агентом внешней среды, которое одновременно влияет как на системные механизмы, так и на структурно-метаболические процессы на уровне клеток и тканей организма. Специфические сенсоры клетки, которые принимают и преобразуют внешний сигнал об изменении характеристик магнитных полей в реакцию живой системы на уровне, например, гуморальной регуляции или нервной системы, до настоящего времени не выявлены. Поэтому Международным комитетом по неионизирующему излучению совместно с Международной программой по химической безопасности ВОЗ (1993) приоритетным направлением в исследовании переменных магнитных полей было утверждено рассмотрение эффектов, опосредованным через взаимодействие с клеточными мембранами. В настоящее время широко обсуждается вопрос об изменении свойств биомембран, как об основном эффекте магнитных полей на живую клетку. И прежде всего эффекты магнитных полей на этом уровне могут быть связаны с разобщением свободнорадикальных процессов, протекающих на мембранах.

Специализированных биологических магниторецепторов, помимо частиц биомагнетита в клетках некоторых бактерий, с помощью которого они ориентируются в магнитном поле Земли, в природе не существует, поэтому важно понять, каким путем сигнал магнитного поля трансформируется в отклик биологической системы.

Известно, что постоянное МП влияет на скорость некоторых реакций с участием свободных радикалов. Некоторые классы химических реакций протекают при промежуточных состояниях электронов радикала. Взаимодействие с постоянным магнитным полем вызывает изменения спина таких электронов. Этот механизм реализуется при воздействии МП на биохимические реакции с участием частиц с неспаренными электронами (процессы переноса электронов по цепи цитохромов и сопряженные с ними реакции окислительного фосфорилирования, многие ферментативные реакции, окисление негемового железа кислородом, некоторые стадии фотосинтеза). В ряде ферментативных окислительно-восстановительных реакций эффекты магнитного поля уже обнаружены (для ферментов каталаза, глутаматдегидрогеназа, карбоксидисмутаза, сукцинатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа). Влияние внешнего магнитного поля на реакции с участием свободных радикалов объясняется снятием спинового запрета при синглет - триплетном переходе в радикальных реакциях. Механизм спинового запрета состоит в следующем. При столкновении двух парамагнитных частиц, которыми могут быть свободные радикалы или ионы-радикалы, образуются как синглетные, так и триплетные продукты реакции. При этом если вероятности образования продуктов реакции по синглетному и по триплетному пути различаются, изменение относительной ориентации магнитных моментов неспаренных электронов, сталкивающихся во внешнем МП частиц, может привести к "переключению" путей реакции и, следовательно, к изменению выхода продуктов реакции. Этот механизм может реализоваться при влиянии МП на процессы свободнорадикального окисления липидов, снижая интенсивность свободного окисления, поскольку синглетные и триплетные состояния обладают разной реакционной способностью.

Еще одной системой, где может реализоваться действие магнитного поля, являются металлсодержащие ферменты. Показано, что поле может изменять активность некоторых ферментов - каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы. Здесь предполагается другой механизм воздействия низкоинтенсивных полей, а именно механизм параметрического резонанса, который был предложен В.В. Ледневым. По этой теории, поля, частота которых резонирует с частотой собственных колебаний ионов, могут влиять на продолжительность взаимодействия этих ионов с центрами связывания регуляторных молекул (например, кальций и кальмодулин). В результате, может изменяться скорость протекания метаболических процессов.

В последнее время, в связи с усилением интереса к воздействию низкоинтенсивных магнитных полей начата работа по изучению влияния данного фактора на состояние мембран растительных клеток. К настоящему моменту получены данные о влиянии низкоинтенсивных магнитных полей на прооксидантно-антиоксидантный статус и энергетические процессы в хлоропластах. Показано, что продукция супероксидного анион-радликала в хлоропластах при воздействии низкоинтенсивных магнитных полей вызывала мобилизацию системы защиты от возможных повреждающих воздействий, ключевыми среди которых были СОД и низкомолекулярные антиоксиданты. Аналогично, низкоинтенсивные магнитные поля вызывали снижение ПОЛ и активацию ферментов антиоксидантной защиты сыворотки крови человека после применения магнитотерапевтических процедур, увеличивало интенсивность хемилюминисценции спленоцитов и клеток крови крыс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Слабые физические воздействия способны активировать неспецифический ответ со стороны растительной клетки, не зависимо от природы воздействия. Такая ответная реакция заключается в быстром сдвиге прооксидантно-антиоксидантного равновесия в сторону активации ПОЛ, что, однако, при условии такого же быстрого включения защитных механизмов, не приводит к развитию деструктивных процессов на мембранах. Таким образом, можно предположить сигнальную роль этих изменений. Важным звеном в активации защитных систем клетки служит продукция клеткой собственных АФК, в частности - супероксидного анион-радикала. Нелинейный и парадоксальный характер зависимости «доза-эффект» при слабых воздействиях может являться следствием наличия некоторого порога дозы, достижение которого является необходимым для запуска приспособительных к действию этих факторов реакций. В противном случае недостаточная активация защитных механизмов влечет за собой серьезное нарушение прооксидантно-антиоксидантного баланса и развитие окислительной модификации биомолекул.

ЛИТЕРАТУРА

1. Барабой В.А. Стресс: природа, биологическая роль, механизмы, исходы. - Киев, 2006. 424 с.

2. Барабой В. А., Блехман Н. Н., Голотин В. Г., Кудряшов Ю. Б. Перекисное окисление и стресс. - СПб.: Наука, 1992. - 148 с.

3. Борисова, Г.Г., Малева, М. Г., Чукина, Н. В. Учебно-методический комплекс дисциплины "Растение и стресс" [Электронный ресурс] / Г. Г. Борисова, М. Г. Малева, Н. В. Чукина ; Федер. агентство по образованию, Урал. гос. ун-т им. А. М. Горького, ИОНЦ "Экология и природопользование" [и др.]. -- Электрон. дан. (43,8 Мб). -- Екатеринбург, 2008.. http://elar.usu.ru/handle/1234.56789/1580

4. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. - Л.: Наука, 1987. -232с.

5. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. Стресс у растений (Биофизический подход). - М., 1993. - 144 с.

6. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. «Биофизика». - М.: ВИНИТИ, 1991. - 274с.

7. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972. - 252 с.

8. Гродзинский Д.М. Надежность растительных систем. - Киев: Наукова думка, 1983. - 386с.

9. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и окислительные модификации макромолекул: польза, вред и защита // Соросовский образовательный журнал. 1999. №1. С.56-63.

10. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки // Итоги науки и техники. Физиология растений. - М.: ВИНИТИ, 1989. - 168 с.

11. Пахомова В. Н., Чернов И. А. Некоторые особенности индуктивной фазы неспецифического адаптационного синдрома растений // Известия Академии Наук. 1996, № 6. С. 705-715.

12. Пахомова В.М. Основные положения современной теории стресса и неспецифический адаптационный синдром у растений // Цитология. 1995. Т.37. Вып.1-2. С.66-87.

13. Пескин А.В. О регуляторной роли активных форм кислорода // Биохимия. 1998. Т.63. Вып.9. С.1305-1306.

14. Селье Г. На уровне целого организма. - М., 1972. -122с.

15. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. - М.: Наука, 2002. - 294 с.

16. Физиология растений: Учебник для студ. вузов /Алехина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф. и др.; под ред. И.П. Ермакова. - М., 2005. - 640 с.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Что такое клеточный гомеостаз? Почему организм или клетка стремится к норме реакции, и почему норма реакции характеризуется, как гомокинез?

2. Что такое стресс по отношению к гомеостазу? Что значит «просто быть больным» по концепции Ганса Селье?

3. Какое воздействие является стрессовым для организма? Каковы основные виды стрессоров ?

4. Что такое триада Селье?

5. Чем характеризуются стадии стрессовой реакции на организменном уровне у человека?

6. Что такое фитостресс? Каковы особенности стресса у растений?

7. В чем расхождение между фазой тревоги у животных и первой фазой фитостресса?

8. Природа изменений электрической активности мембран и ее роль в развитии стрессовой реакции растений?

9. Каково значение катаболических процессов при развитии стрессовой реакции?

10. Классы и функции стрессовых белков?

11. Что такое перекрестная устойчивость? На какие особенности развития стрессовой реакции указывает это явление?

12. Охарактеризуйте проблему универсальности и специфичности стрессовой реакции растений.

13. Чем характеризуется перекисный гомеостаз?

14. Какова роль окислительного стресса в общей теории стресса?

15. Что такое активные формы кислорода?

16. Какие формы активированного кислорода вы знаете? Как и где они могут генерироваться в растительной клетке?

17. Какие из АФК являются стабильными? Какие - высокореакционноспособными? Как вы думаете: какие из них наиболее опасны для жизни клетки?

18. Какие биомолекулы могут подвергаться перекисному окислению? Каково значение процессов окислительной модификации молекул для нормального метаболизма клетки?

19. Какие АФК не несут заряда? Как это сказывается на проникающей способности через мембраны?

20. Какие АФК имеют радикальную природу? Чем опасны радикалы для клеточных структур?

21. Какие АФК образуются в процессе фотосинтеза? Наиболее вероятные места их образования?

22. В каком соотношении образуются АФК

23. Какие клеточные структуры наиболее подвержены негативному воздействию активных форм кислорода?

24. Какие молекулы способны вызвать начало перекисного окисления? Какова особенность процесса перекисного окисления?

25. Стадии перекисного окисления липидов. Значение начальных и конечных продуктов ПОЛ в диагностике синдрома адаптации.

26. Что такое пентадиенильный радикал, диеновый, триеновый конъюгат, гидроперекись липида, малоновый диальдегид, основание Шиффа?

27. Какие функциональные группы белков наиболее подвержены окислительной модификации?

28. Какие события могут развиваться в клетке при чрезмерной активации процессов перекисного окисления разных молекул?

29. Какие последствия может иметь перекисное окисление липидов мембран?

30. Перечислите основные окислительные модификации нуклеиновых кислот.

31. Классифицируйте антиоксиданты. На каких принципах основана выбранная Вами система классификации?

32. На каких представлениях основано разделение компонентов антиоксидантной защиты на линии защиты?

33. Что включает в себя первая линия антиоксидантной защиты?

34. Роль мембран клетки в передаче сигнала, изменение структуры, состава и функциональности мембран? Влияние этих изменений на клетку и организм?

35. Охарактеризуйте антиоксидантное свойство аскорбата.

36. Что такое глутатион? Каков химизм и значение для растительной клетки цикла Холливелла-Асада?

37. Какие изоформы СОД обнаружены в живых клетках? Какую роль выполняет этот фермент в метаболизме клетки?

38. В чем отличие в реакциях утилизации перекиси водорода каталазой и пероксидазами?

39. Каковы современные на взгляды на характер кривой дозовой зависимости «доза-эффект»? Что понимают под «эффектом малых доз»?

40. Каковы причины развития окислительного стресса при радиационном облучении живого организма? Что считается основной клеточной мишенью при поглощении больших и малых доз ионизирующего излучения?

Размещено на Allbest.ru