Структурно-функциональные особенности запасных и защитных белков растений и их использование в генетических исследованиях

8. Генетический контроль компонентного состава кукурбитина

Одной из наиболее серьезных форм биологического засорения образцов тыквы является присутствие в нем гибридов от переопыления между разновидностями тыквы обыкновенной в коллекционных и селекционных питомниках. Выявление подобного типа засорения при грунтконтроле осложняется тем, что основной апробационный признак - форма семенника - у тыкв определяется комплементарным действием генов. В связи с этим нами была исследована возможность выявления гибридов в посевном материале по электрофоретическим спектрам белков семян на основе изучения генетического контроля отдельных компонентов кукурбитина.

Был проведен гибридологический анализ состава субъединиц кукурбитина в гибридной комбинации патиссон Белые 13 х кабачок Грибовские 37. Сорт кабачков Грибовские 37 обладает генотипом, типичным для стародавних сортов. В результате было установлено, что, во-первых, наследование вариабельных компонентов кукурбитина в спектрах сортов Белые 13 и Грибовские 37 осуществляется тремя локусами (А, В и С). Генотипы родительских сортов содержат различные аллельные варианты локусов А, В и С. Во-вторых, аллели одного локуса контролируют отдельные компоненты кукурбитина, различающиеся по молекулярной массе, в отличие от блоков компонентов, выделенных в качестве единицы наследования у проламинов злаков.

Анализ расщепления одновременно по трем кукурбитинкодирующим локусам свидетельствует о том, что они не сцеплены между собой: соотношение 18 классов, обнаруженных в F₂, полностью соответствует теоретически ожидаемому расщеплению (1:2:1):(1:2:1): (3:1) при ?²_факт.=12,4, ?²_теор. = 27,6.

Для формализации данных гибридологического анализа нами предложена классификация кукурбитина, позволяющая выражать электрофореграммы в виде формул. Для этого в строку последовательно заносится название белковой системы, буквенное обозначение локуса и порядковый номер идентифицированного компонента, кодируемого соответствующим аллелем. Например, электрофореграмму сорта Грибовские 37 (рис. 12г) можно записать как CbnA2 B1 C1. В генетических формулах гетерозигот по кукурбитину аллели одного локуса разделяются запятой. Например, формула гибрида F₁ от скрещивания Белые 13 х Грибовские 37 (рис. 12б,в) будет CbnA1,2 B1,2 C1,0. В сокращенном виде формула сорта Грибовские 37 будет 2.1.1., а упомянутого выше гибрида F₁ - 1,2.1,2.1,0.

Возможность идентификации гибридов была продемонстрирована также на комбинации скрещивания, включающей сорт кабачков современной селекции Якорь и патиссон Белые 13. Кроме того, была показана возможность идентификации гибридов еще одного варианта скрещивания: тыква х кабачок (на примере сортов Миндальная 35 х Сотэ 38).

Изучение коллекции сортов тыкв с применением гибридологического анализа, а также методов идентификации аллелей сравнительным анализом электрофореграмм разных биотипов гетерогенного сорта и с использованием эталонного сорта позволило составить каталог аллельных вариантов компонентов кукурбитина, контролируемых локусами Cbn A, Cbn B, Cbn C, Cbn D. По локусам А, С, D обнаружены пары аллелей, по локусу В - серия, состоящая из 7 множественных аллелей (рис. 14).

Рис. 14. Каталог аллельных вариантов компонентов электрофоретического спектра кукурбитина, контролируемых локусами Cbn A, Cbn B, Cbn C, Cbn D

Каталог систематизирует полученные данные по генетическому контролю компонентов кукурбитина, делает возможным предсказание фенотипических классов по кукурбитину при гибридизации.

При анализе характера распределения аллелей кукурбитинкодирующих локусов у сортов различных видов тыкв было установлено, что наибольшая генетическая изменчивость по четырем локусам наблюдается у вида C. pepo H=0,116, несколько ниже она у C. moschata - H=0,056 и C. maxima - H=0,041. Полученные результаты совпадают с существующией точкой зрения, что тыква обыкновенная является наиболее полиморфной из трех культивируемых в нашей стране видов.

Исследование полиморфизма кукурбитина на внутривидовом уровне показало, что электрофоретические спектры кукурбитина, как правило, сортоспецифичны. Однако при этом выделяются группы сортов, имеющих в генотипе одинаковый набор аллелей кукурбитинкодирующих локусов, различие между подобными образцами выражаются в интенсивности электрофоретически выявляемых компонентов.

Путем параллельной оценки чистосортности партии семян суперэлиты патиссонов Белые 13, выращенной на Симферопольской ОБОС, двумя методами была продемонстрирована высокая эффективность предложенного метода (по электрофоретическим спектрам куккрбитина) по сравнению с традиционно используемым грунтконтролем.

Глава II. Защитные белки

В настоящем разделе диссертации излагаются результаты исследования защитных PR-белков, образующихся в растениях в ответ на инфицирование, для выяснения механизмов устойчивости к патогенам. Цель работы состояла в выявлении и изучении свойств PR-белков у растений рода Nicotiana и Lycopersicon с разными генами устойчивости при вирусной инфекции и перекрестной защите.

1. Обнаружение PR-белков в листьях разных видов табака при вирусной инфекции

Предварительно было установлено, что механическое повреждение листьев табака индуцирует образование новых белков, R_f которых составили 0,84 и 0,67. Такие растения были использованы в качестве контроля при изучении влияния вирусной инфекции на спектр кислоторастворимых белков листьев. Изучение состава белков листьев гибридного табака Терновского в динамике (на 3, 7, 10 и 14 день после заражения) показало, что содержание PR-белков наибольшее на 10 день после заражения, после чего (на 14 день) их содержание падает, что сопровождается некротизацией листьев. Исследование накопления PR-белков в разных участках ткани зараженного листа, а также в других частях растения показало, что PR-белки преимущественно накапливаются в непосредственной близости от места инокуляции вирусом. При удалении от места инфицирования их содержание падает: так, на расстоянии 2 см от некроза их содержание падает почти в 2 раза. В верхних неинокулированных листьях PR-белки обнаруживаются лишь в следовых количествах. Был проанализирован спектр PR-белков у разных видов и сортов табака и выявлена видоспецифичность набора PR-белков (табл. 4). Это позволяет использовать их в качестве генетических маркеров как при исследовании происхождения разных видов табака, так и при анализе устойчивости растений табака к вирусным заболеваниям. В то же время межсортовых различий по электрофоретическим спектрам PR-белков выявлено не было.

Исследование кислоторастворимых белков листьев табака Терновского при системной реакции на заражение ВОМ-1 показало, что в отличие от других исследованных видов табака, у гибрида PR-белки образуются и при системном заражении (табл. 4).

Таблица 5.

PR-белки, выявленные у разных видов и сортов Nicotiana при вирусной инфекции

Вид, сорт	Ген	Реакция на ВТМ	PR-белки и их молекулярные массы, кДа
			b0	b1	b1	b2	b3	b4	b5	b6	b7
			16	16,6	14	16,2	16	-	34	35	35
N. glutinosa	N	сверхч.	-	-	+	-	-	-	-	-	-
N. rustica	N	сверхч.	-	-	-	+	-	-	+	+	+
N. sylvestris	N?	сверхч.	+	+	-	-	+	-	-	-	-
		системн.	-	-	-	-	-	-	-	-	-
N. tabacum сорт Samsun EN	N?	сверхч.	-	+	-	+	+	+	-	-	-
		системн.	-	-	-	-	-	-	-	-	-
N. tabacum сорт Java	N?	сверхч.	-	+	-	+	+	+	-	-	-
		системн.	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Гибридный табак	N	сверхч.	-	+	-	+	+	+	+	+	+
		системн.*	-	+	-	+	+	+	+	+	+

*заражение ВОМ-I; сверхч.- сверхчувствительная реакция; системн. - системная реакция.

2. Обнаружение PR-белков в листьях томатов при инфекции ВТМ и перекрестной защите

Для выяснения механизмов устойчивости к вирусному заражению изучали PR-белки, которые появляются после заражения в растениях с разными генами устойчивости к ВТМ: геном толерантности Tm-I и генами сверхчувствительности Tm-2 и Tm-2². Хотя гены устойчивости у томатов известны давно, индуцируемые ими защитные реакции практически не изучены. Исследования проводили как на томатах-дифференциаторах, так и на изогенных линиях, различающихся только по генам устойчивости.

В спектрах кислоторастворимых белков, выделенных из ткани зараженных растений после инфицирования соответствующими штаммами ВТМ, обнаружено 4 типа изменений по сравнению с контролем: (1) накопление отдельных полипептидов, (2) уменьшение относительного содержания некоторых полипептидов, (3) появление новых полипептидов, (4) исчезновение определенных полипептидов. Во всех случаях в зараженных ВТМ растениях в листьях с явными симптомами заболевания появляется вирус-специфический белок - белок оболочки вируса с молекулярной массой 17,4 кДа. На рис. 15 представлены результаты электрофоретического разделения белков листьев растений томатов I группы, содержащих ген толерантности Tm-I, при заражении разными штаммами ВТМ.

Рис. 15. Электрофореграммы кислоторастворимых белков листьев томатов при инфекции ВТМ (13%-ный ПААГ, 0,1% ДДС-Na). I, II, 0, III - группы томатов, М - белки-маркеры, 1, 4, 7, 10 - здоровые растения томатов: 2 - I/I, 3 - I/0, 5 - II/2, 6 - II/I, 8 - 0/0, 9 - 0/V-69, II - III/N2², 12 - III/2 (первая цифра - группа томатов, вторая - группа штаммов ВТМ).

Исследования спектров PR-белков показали, что заражение разными штаммами ВТМ как в томатах-дифференциаторах, так и в изогенных линиях томатов приводит к изменениям белкового состава листьев, причем наибольшие изменения наблюдаются через 2 недели после заражения и лишь в растениях с явными симптомами заболевания. Они могут быть связаны, с одной стороны, с развитием патофизиологического процесса, в пользу чего свидетельствует корреляции между изменениями в белках и тяжестью заболевания, а с другой, следствием развития приобретенной устойчивости.

Отсутствие каких-либо видимых изменений в спектре кислоторастворимых белков в устойчивых растениях при заражении их непробивающими устойчивость штаммами ВТМ, на наш взгляд, связано с тем, что блокировка инфекции происходит в относительно небольшом числе первично инфицированных клеток. Изменений в спектре белков не было обнаружено не только в случае наличия в генотипе одного из генов устойчивости, но и в линиях, содержащих одновременно оба гена: толерантности (Tm-1) и сверхчувствительности (Tm-2²).

Наиболее характерной особенностью развития инфекционного процесса в растениях томатов всех генотипов, зараженных пробивающими данный тип устойчивости штаммами ВТМ и при перекрестной защите, является появление в спектрах кислоторастворимых белков нового полипептида с молекулярной массой 15 кДа и названного Р15. Поскольку белок Р15 был обнаружен в томатах всех исследованных генотипов, его образование, по-видимому, не связано с генами устойчивости. При развитии мозаичного заболевания у томатов всех генотипов, помимо белка Р15, было отмечено увеличение синтеза двух других PR-белков- Р79 и Р31. Как и в случае белка Р15, синтез этих полипептидов, по всей видимости, не связан с генами устойчивости. Вероятно, белок Р79 является щелочной эндопротеиназой, идентифицированной в томатах (Vera, Conejero, 1988), а белок Р31 - хитиназой (Joosten, de Wit, 1989).

Помимо белков, которые появляются в растениях томатов различного генотипа в ответ на инфицирование, нами выявлены и специфические белки, индукция которых связана с генами устойчивости и отражает различия в механизмах устойчивости. Эти белки могут быть использованы в качестве маркеров в генетических исследованиях и селекционном процессе.

Были также исследованы изменения в спектре кислоторастворимых белков при перекрестной защите, заключающейся в том, что заражение растений апатогенным штаммом вируса предохраняет растение от последующей инфекции родственным штаммом того же вируса.

Поскольку одна из гипотез предполагала участие PR-белков в возникновении приобретенной устойчивости, были исследованы спектры кислоторастворимых белков при перекрестной защите. Анализировали кислоторастворимые белки растений 0 группы томатов, которые сначала заражали аттенуированным штаммом ВТМ V-69, а через 3 недели - резким штаммом R, который вызывает у растений зеленую мозаику. В качестве контролей использовали растения, зараженные отдельно штаммом V-69 и R штаммом ВТМ, соответственно, а также здоровые растения того же возраста.

При последовательном заражении томатов двумя штаммами ВТМ-аттенуированным V-69 и резким R - симптомы заболевания не развивались. При этом концентрация ВТМ в обоих случаях была сходной: 2,20 мкг/г в варианте 0/V-69 и 2,50 мкг/г в варианте 0/R. Таким образом, при перекрестной защите подавлено развитие симптомов заболевания. Это коррелирует с изменением содержания ряда белков: увеличивается содержание полипептидов с молекулярными массами 15 кДа (Р15) и 31 кДа (Р31), в то время как относительное содержание других белков с молекулярными массами 14, 14,5, 16,5, 17, 22, 23, 30, 36, 43 кДа уменьшается. Полученные нами данные позволяют предположить, что белки Р15 и Р31 участвуют в механизмах приобретенной устойчивости, а снижение экспрессии ряда белков приводит к подавлению развития симптомов мозаичного заболевания.

Поскольку во всех случаях заражения пробивающими устойчивость штаммами ВТМ в томатах разных генотипов появлялся белок с молекулярной массой 15 кДа, обозначенный Р15, этот белок был выделен и определен его аминокислотный состав. Полученные результаты свидетельствовали о том, что выделенный нами белок Р15 соответствует белку Р14, описанному Камачо и Сэнгером в восприимчивых растениях томатов при вирусной, грибной и вироидной инфекциях (Camacho, Sanger, 1982, 1984).

3. Структурно-функциональное исследование хлоропластов томатов с различными генами устойчивости к ВТМ при заражении разными штаммами вируса

Исследование структурно-функциональных характеристик хлоропластов растений томатов, несущих различные гены устойчивости к ВТМ, при вирусной инфекции показало, что в мозаичных растениях существенно подавлена активность фотосистемы II и транскрипционная активность хлоропластов. Подавление транскрипции хлоропластных генов при заражении резкими штаммами ВТМ происходит независимо от генотипа, однако оно выражено слабее в генотипах с генами устойчивости. В случае системного некроза функционирование хлоропластов нарушено в меньшей степени: активность фотосистемы II уменьшается на ~10%, а транскрипционная активность хлоропластов - на 20%. Одновременно с этим в растворимой фракции обнаружен ряд новых белков. При заражении аттенуированным штаммом V-69, хотя симптомы заболевания не развиваются, в хлоропластах происходят определенные структурно-функциональные изменения, однако, они проявляются слабее, чем при заражении резкими штаммами ВТМ.

4. Обнаружение интерфероноподобных белков в листьях томатов

Изучив PR-белки, синтезирующиеся в растениях в ответ на вирусную инфекцию и представляющие собой важнейшие компоненты защитной системы растений, представляло интерес выяснить, существует ли в растениях система защиты, связанная с синтезом интерфероноподобных белков, поскольку этот механизм защиты широко распространен у животных. В связи с этим, был проведен поиск интерфероноподобных белков в растениях томатов с различными генами устойчивости к ВТМ с использованием иммуноблоттинга с антителами к ?-интерферону человека.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что среди кислоторастворимых белков листьев томатов различного генотипа выявляются три белка в низкомолекулярной области спектра, иммунологически сходных с ?-интерфероном человека. Один из них практически совпадает по электрофоретической подвижности с ?-интерфероном человека, два других обладают несколько большей молекулярной массой. Заметное увеличение содержания интерфероноподобных белков наблюдалось в томатах с геном сверхчувствительности Tm-2² при инфицировании растений штаммом N2², вызывающим системный некроз. У растений с геном толерантности Tm-1 не происходит индукции интерфероноподобного механизма противовирусной защиты. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что одним из сходных защитных механизмов растений и животных является индуцированное вирусной инфекцией образование антивирусных интерфероноподобных веществ.

5. Исследование трансгенных растений табака, экспрессирующих двунитевую РНК

Помимо PR-белков - компонентов врожденной иммунной системы растений, нами были исследованы белки растений при индуцированной устойчивости - в трансгенных растениях табака, экспрессирующих двунитевую РНК (днРНК).

В качестве объекта исследования были использованы трансгенные растения табака, стабильно сохраняющие в течение 3-х поколений конструкцию, несущую экспрессируемую последовательность бактериального происхождения (фрагмент гена устойчивости к тетрациклину) в виде протяженного инвертированного повтора. Данная конструкция обеспечивает синтез в трансгенных растениях РНК, имеющую шпилечную, двунитевую структуру (Смирнов и др., 1993).

Была исследована устойчивость трансгенных растений табака поколения Т₂, устойчивых к канамицину, к штаммам ВТМ, различающимся по степени патогенности. Было установлено, что хотя здоровые трансгенные и нетрансгенные растения табака не различаются фенотипически, у трансгенных зараженных растений наблюдались задержка в сроках развития симптомов, а также изменения в характере симптомов. Степень развития мозаичных симптомов у трансгенных растений табака была слабее, чем у нетрансгенных растений. Полученные результаты свидетельствовали об увеличении устойчивости к заражению ВТМ у трансгенных растений табака, экспрессирующих двунитевую РНК. При этом реакция на разные штаммы была различной.

Электрофоретический анализ белков листьев здоровых нетрансгенных и трансгенных растений в денатурирующих условиях не выявил различий в электрофоретических спектрах. В трансгенных зараженных растениях было снижено содержание белка оболочки вируса (17,6 кДа) по сравнению с нетрансгенными растениями, что свидетельствовало о меньшем накоплении вируса и коррелировало с повышением устойчивости к ВТМ. Одновременно при заражении трансгенных растений штаммом N2², было обнаружено два новых белка, молекулярные массы которых составили 25 и 30 кДа, обозначенные Р25 и Р30. Структурный анализ белка Р30 выявил гомологию с ксилоглюкан-эндо-1,4-?-D-глюканазой томата и с глюкан-эндо-1,3-?-глюкозидазой сои. Белки, обладавшие гомологией с исследованными полипептидами, относятся к одному функциональному семейству растительных ?-эндоглюканаз. Эти ферменты связаны с метаболизмом углеводных компонентов клеточной стенки: гидролизом О-гликозидной связи в различных полисахаридах, что приводит к расщеплению сложных полимеров на фрагменты и образованию различных олигосахаридов.

Полученные данные позволяют предположить, что индуцированный инфекцией в трансгенных растениях белок с молекулярной массой 30 кДа является новым представителем семейства ?-эндоглюканаз, в регуляции экспрессии которого участвует днРНК. По всей видимости, активация синтеза этого белка зависит не только от присутствия днРНК, но требует дополнительно некоторого вирусного фактора. Это говорит в пользу участия этого белка в защите или патогенезе.

6. Исследование антимикробных пептидов пшеницы Triticum kiharae Dorof. et Migusch

Важнейшей группой защитных полипептидов, относящихся к группе PR-белков, являются антимикробные пептиды. Хотя к началу настоящего исследования они были выделены из ряда растений, многие аспекты, касающиеся их молекулярного полиморфизма у отдельных видов растений, специфичности в отношении отдельных групп патогенов, механизма действия, структуры генов и регуляции их экспрессии оставались мало изученными. В связи с этим был проведен систематический анализ катионных АМП зерновок пшеницы вида Triticum kiharae Dorof. et Migusch., которая представляет собой синтетический аллополиплоид, полученный от скрещивания Triticum timopheevii с Aegilops tauschii, обладающий повышенной устойчивостью к патогенам. К началу наших исследований сведения об АМП пшеницы этого вида отсутствовали.

6.1 Выделение и характеристика антимикробных пептидов вида T. kiharae

Была разработана методика выделения АМП из этого вида растения, сочетающая в себе различные виды ВЭЖХ (аффинную, эксклюзионную и обращенно-фазовую) с масс-спектрометрией, секвенированием аминокислотных последовательностей и испытаниями биологической активности. В результате из пшеницы Т. kiharae было выделено 24 новых пептида. На основе гомологии аминокислотных последовательностей и цистеинового мотива, характерного для каждого семейства растительных АМП, все полученные пептиды были отнесены к известным семействам: дефензинов, тионинов, гевеиноподобных пептидов, ноттиноподобных пептидов и липид-переносящих белков. Кроме того, нами впервые было обнаружено новое семейство глицин-богатых пептидов, а также семейство 4-Cys пептидов, гомологов 4Cys-пептида кукурузы MBP-1 (Duvick et al., 1992). Обнаружены также новые структурные типы дефензинов и гевеиноподобных пептидов.

На рис. 16 приведены различные стадии очистки АМП семян пшеницы T. kiharae. .Выделенные пептиды были охарактеризованы по молекулярным массам, аминокислотным последовательностям и биологической активности в отношении важнейших фитопатогенных грибов и бактерий.

Рис. 16. Выделение АМП из семян Т. kiharae . I. 100-мМ фракция; II. 500-мМ фракция; (а) эксклюзионная ВЭЖХ на колонке Superdex HR 10/30, отмечены границы объединения фракций А-Е. ОФ-ВЭЖХ фракций С (b), D (c) и E (d).

6.2 Глицин-богатые пептиды

Новые глицин-богатые пептиды, выделенные из семян пшеницы, приведены в табл. 6.

Таблица 6.

Глицин-богатые пептиды пшеницы T. kiharae*

Пептид	N-концевая аминокислотная последовательность	Мол. масса, Да
Tk-AMP-G1	GGGGGGGGYHGGGGGGYPGH20	4294
Tk-AMP-G2	GGGGAGGGYPGHGGGGYPGHGGGGGGGGYPGHGGGGGGGGGGGGGGGGGG50	4375
Tk-AMP-G3	GGYPGGGGGG10	4668
Tk-AMP-G4	GGYPGGGGAG10	4750
Tk-AMP-G5	GGGGGXGY8	4844 4917
Tk-AMP-G6 Tk-AMP-G7	HHGGGDQAHGDR HHGGGGHGHGDR	4360 4603
Tk-AMP-G8	XGXGGGGRGGGYPGRG16	4285

*Повторяющиеся аминокислотные мотивы выделены жирным шрифтом.

Для большинства из них показано отсутствие остатков цистеина в молекуле. Для этих пептидов, помимо высокого содержания глицина, характерно наличие повторяющихся олигопептидных мотивов, наличие которых отражает происхождение кодирующих их генов путем многократных дупликаций предкового гена.

6.3 Дефензины T. kiharae

В семенах T. kiharae нами были частично охарактеризованы 11 дефензинов, которые по гомологии N-концевых последовательностей были подразделены на 3 структурные группы: Tk-AMP-D (группа I), Tk-AMP-?1, Tk-AMP-?2, Tk-AMP-?3 (группа II), Tk-AMP-?2 и Tk-AMP-?3 (группа III). Большинство из них (пептиды Tk-AMP-D) являются новыми, ранее не описанными, и представляют собой новый подкласс дефензинов пшеницы - дефензины группы I. Были установлены полные аминокислотные последовательности D дефензинов T. kiharae, а также родственных пшенице видов родов Triticum и Aegilops, которые рассматриваются как доноры геномов полиплоидных пшениц (табл. 7).

Таблица 7.

Аминокислотные последовательности дефензинов T. kiharae и T. monococcum

Пептид	Аминокислотная последовательностьa
Tk-AMP-D1	RTCQSQSHKFKGACFSDTNCDSVCRTENFPRGQCNQHHVERKCYCERDC
Tm-AMP-D1.2	RTCQSQSHKFKGACFSDTNCASVCRTENFPRGQCNQHHVERKCYCERDC
Tk-AMP-D2	RTCESQSHKFKGPCFSDSNCATVCRTENFPRGQCNQHHVERKCYCERSC
Tk-AMP-D1.1	RDCESDSHKFHGACFSDTNCANVCQTEGFTAGKCVG--VQRHCHCTKDC
Tk-AMP-D5	RECRSESKKFVGLCVSDTNCASVCLTERFPGGKCDG--Y-RRCFCTKDC
Tk-AMP-D6	RDCRSQSKTFVGLCVSDTNCASVCLTEHFPGGKCDG--Y-RRCFCTKDC
Tk-AMP-D6.1	RECRSQSKQFVGLCVSDTNCASVCLTEHFPGGKCDG--Y-RRCFCTKDC
Tk-AMP-D3	RDCKSDSHKFHGACFSDTNCANVCQTEGFTRGKCDG--I--HCHCIKDC
Tk-AMP-D4	RDCTSQSHKFVGLCLSDRNCASVCLTEYFTGGKCD-H---RRCVCTKGC
Консенсусная последовательность	R-C-S-Sb-F-GhChSD-NC--VC-TE-F--G-C-------bChC-b-C

В табл. 7 аминокислотные остатки, различающиеся у всех или некоторых последовательностей, выделены, соответственно, светло- и темносерым цветом. В нижней строке приведена консенсусная последовательность, в которой консервативные остатки цистеина и некоторых других аминокислот выделены жирным шрифтом. “h” и “b” обозначают гидрофобные и основные аминокислоты, соответственно.

Cравнение аминокислотных последовательностей D дефензинов с дефензинами других злаков по программе Clustal W (рис. 17) выявило наибольшую гомологию с TAD1, дефензиноподобным пептидом, экспрессирующимся в пшенице при холодовой адаптации (Koeke et al., 2002).

Растение Дефензин Аминокислотная последовательность

Triticum kiharae Tk-AMP-D1 RTCQSQSHKFKGACFSDTNCDSVCRT-E--NFPRGQCNQHHVERKCYCERDC- 49

Triticum kiharae Tk-AMP-D1.2 RTCQSQSHKFKGACFSDTNCASVCRT-E--NFPRGQCNQHHVERKCYCERDC- 49

Triticum kiharae Tk-AMP-D2 RTCESQSHKFKGPCFSDSNCATVCRT-E--NFPRGQCNQHHVERKCYCERSC- 49

Triticum aestivum† TAD1 RTCLSQSHKFKGTCLSNSNCAAVCRT-E--NFPDGECNTHLVERKCYCKRTC- 49

Triticum kiharae Tk-AMP-D3 RDCKSDSHKFHGACFSDTNCANVCQT-E--GFTRGKCDG--I--HCHCIKDC- 45

Triticum kiharae Tk-AMP-D1.1 RDCESDSHKFHGACFSDTNCANVCQT-E--GFTAGKCVGVQ--RHCHCTKDC- 47

Triticum kiharae Tk-AMP-D6 RDCRSQSKTFVGLCVSDTNCASVCLT-E--HFPGGKCDG--Y-RRCFCTKDC- 46

Triticum kiharae Tk-AMP-D6.1 RECRSQSKQFVGLCVSDTNCASVCLT-E--HFPGGKCDG--Y-RRCFCTKDC- 46

Triticum kiharae Tk-AMP-D5 RECRSESKKFVGLCVSDTNCASVCLT-E--RFPGGKCDG--Y-RRCFCTKDC- 46

Triticum kiharae Tk-AMP-D4 RDCTSQSHKFVGLCLSDRNCASVCLT-E--YFTGGKCD-H---RRCVCTKGC- 45

Zea mays ?1-Z RVCRRRSAGFKGVCMSDHNCAQVCLQ-E--GYGGGNCDG-IM-RQCKCIRQC- 47

Sorghum bicolor SI-1 RVCMGKSQHHSFPCISDRLCSNECVKEE-GGWTAGYCHLR-Y---CRCQKAC- 47

Sorghum bicolor SI-3 RVCRRRSAGFKGLCMSDHNCAQVCLQ-E--GWGGGNCDG-VI-RQCKCIRQC- 47

Sorghum bicolor SI-2 RVCMGKSAGFKGLCMRDQNCAQVCLQ-E---GWGGGNCDG-VM-RQCKCIRQCW 48

Hordeum vulgare ?1-H RICRRRSAGFKGPCVSNKNCAQVCMQ-E--GWGGGNCDGP-L-RRCKCMRRC- 47

Triticum turgidum ?1-P KICRRRSAGFKGPCMSNKNCAQVCQQ-E--GWGGGNCDGP-F-RRCKCIRQC- 47

Triticum turgidum ?2-P KVCRQRSAGFKGPCVSDKNCAQVCLQ-E--GWGGGNCDGP-F-RRCKCIRQC- 47

Zea mays ?2-Z RVCMGKSQHHSFPCISDRLCSNECVK-EDGGWTAGYCHLR-Y---CRCQKAC- 47

Raphanus sativum Rs-AFP2 QKLCQRPSGTWSGVCGNNNACKNQCIRLEK--ARHGSCNYVFPAHKCICYFPC- 51

Рис. 17. Аминокислотные последовательности некоторых дефензинов растений. ^†Последовательность установлена по структуре гена. Элементы вторичной структуры отмечены темно-серым (?-спирали) и серым (?-тяжи) (Lay, Anderson, 2005)

Рис. 18. Филогенетическое древо, отражающее эволюционные связи между представителями семейства злаковых, построенное на основе данных о первичной структуре дефензинов.

6.4 Локализация детерминант антифунгальной активности в молекулах дефензинов

Для локализация детерминант антифунгальной активности в молекулах дефензинов злаков было проведено сравнение аминокислотных последовательностей дефензинов пшеницы Tk-AMP-D1 и Tk-AMP-D6, обладающих низкой антифунгальной активностью к ряду фитопатогенов (A. consortiale, B. cinerea, H. sativum, F. сulmorum, C. graminicola и D. maydis) с дефензином ежовника обыкновенного Echinochloa crusgalli (L.) Beauv., обладающим высокой ингибирующей активностью по отношению к этим патогенам. Дефензины ежовника и пшеницы обладают высокой гомологией первичной структуры, особенно в N-концевой области молекулы (остатки 1-27), которая достигает 85%. Таким образом, можно предположить, что различия в антифунгальной активности между дефензинами Tk-AMP-D1 T. kiharae и Ec-AMP-D1 E. crusgalli связаны с различиями в аминокислотной последовательности в С-концевой области молекул.

Выявленная нами высокая гомология дефензинов в N-концевой области молекул свидетельствует о значительном консерватизме этого участка в эволюции, который сохранился почти неизменным после дивергенции триб Paniceae (E. crusgalli) и Triticeae (T. kiharae). Можно предположить, что консерватизм этой части молекул дефензинов связан с какими-то общими жизненно важными функциями (например, структурной), в то время как С-концевой участок молекул отвечает за функциональную специфичность.

6.5 Дефензины видов Triticum и Aegilops

Помимо дефензинов T. kiharae, были выделены и охарактеризованы также дефензины диплоидных видов родов Triticum и Aegilops, предполагаемых доноров А, В и D геномов. Было установлено, что структура D дефензинов высоко консервативна в эволюции. Кроме того, набор дефензинов у исследованных видов специфичен: каждый из них содержит лишь некоторые дефензины, обнаруженные у гексаплоидной пшеницы (табл. 7). В результате была определена локализация генов, кодирующих дефензины, в геномах полиплоидной пшеницы. Сходство в наборе дефензинов у устойчивых (T. kiharae) и восприимчивых форм пшеницы (T. aestivum сорта Хакасская и Родина) свидетельствует о том, что различие в устойчивости, по всей видимости, связано с уровнем экспрессии генов дефензинов.

Таблица 8.

Состав дефензинов в семенах T. kiharae и родственных видов

Вид

Геномный состав

D1

D1.1

D1.2

D2

D3

D3.1

D4

D5

D6

D6.1

T. monococcum

AbAb

-

+

+

-

-

-

+

+

-

-

Ae. speltoides

BB

-

-

-

+

-

+

-

-

-

+

Ae. squarrosa

DD

-

-

-

+

+

-

-

-

+

-

T. timopheevii

AbAbGG

+

-

-

+

-

-

+

+

-

+

T. militinae

AbAbGG

-

-

+

+

-

-

+

+

-

+

T. aestivum сорт Родина

AuAuBBDD

+

+

-

+

+

-

+

+

+

+

T. aestivum сорт Хакасская

AuAuBBDD

+

+

-

+

+

-

+

+

+

+

T. kiharae

AbAbGGDD

+

+

-

+

+

-

+

+

+

+

6.6 Исследование нового структурного типа 10-Cys гевеиноподобного пептида WAMP T. kiharae

Из пшеницы были выделены и просеквенированы новые гевеиноподобные пептиды WAMP-1a и WAMP-1b, различающиеся по наличию дополнительного С-концевого остатка аргинина у WAMP-1b (рис. 19).

WAMP-1a и WAMP-1b представляют собой новый структурный тип АМП. Они обладают гомологией с гевеиноподобными АМП, однако в их молекулах содержится 10 остатков цистеина, расположенных уникальным образом, поэтому их можно отнести к новому структурному типу 10-Cys гевеиноподобных пептидов с новым цистеиновым мотивом (рис. 19). Обращает на себя внимание сходство пептидов WAMP с хитин-связывающими доменами хитиназ класса 1 (рис. 19). Другой особенностью новых пептидов является замена консервативного остатка серина на глицин в углеводсвязывающем сайте, хотя способность связываться с хитином сохраняется.

Pис. 19. Сравнение аминокислотных последовательностей пептидов WAMP с некоторыми гевеиноподобными АМП и хитин-связывающими доменами хитиназ класса I. Консервативные остатки цистеина выделены черным, идентичные или сходные аминокислотные остатки выделены серым цветом. Консервативные остатки углевод-связывающего сайта отмечены звездочками, как и остаток глицина, заменяющий консервативный остаток серина в хитин-связывающем сайте.

Исходя из гомологии с гевеином, мы предположили существование следующих дисульфидных связей в пептидах WAMP: Сys4-Сys19, Сys13-Сys25, Сys18-Сys32, Сys37-Сys41. дополнительная пятая дисульфидная связь образована между Сys16 и Сys44. Такое расположение дисульфидных связей подтверждается рентгеноструктурным анализом хитиназы класса 1 риса (Kezuka, Nishizawa, Watanabe, Nonaka, accession number 2DKV_A).

6.7 Получение рекомбинантного пептида WAMP-1a

Для того чтобы получить достаточное количество пептида для функциональных исследований, была проведена гетерологичная экспрессия синтетического гена этого пептида в клетках E. coli. Целевой пептид экспрессировали в составе гибридного белка с тиоредоксином, поскольку было известно, что в этом случае достигается высокий выход целевого пептида в нативной конформации. Используя данные по аминокислотной последовательности пептида WAMP-1a, из синтетических олигонуклеотидов методом ПЦР был сконструирован ген, кодирующий этот пептид. Этот ген был клонирован в экспрессионный вектор pET-32b и образовавшаяся плазмида (pET-32-M-WAMP-1a) была использована для трансформации клеток E. coli BL21(DE3). Образование гибридного белка Trx- WAMP-1a и его очистку контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na (pис. 20). Химерный белок обрабатывали бромцианом, и рекомбинантный пептид WAMP-1a очищали путем ОФ-ВЭЖХ (рис. 20). Рекомбинантный пептид обладал тем же временем удерживания на колонке, что и нативный WAMP-1a при ОФ-ВЭЖХ и имел ту же N-концевую аминокислотную последовательность. Его молекулярная масса, измеренная методом MALDI-TOF MS, также совпадала с массой нативного пептида. Выход очищенного рекомбинантного пептида WAMP-1a составил около 8 мг/л культуры.

Рис. 20. Экспрессия и очистка гибридного белка Trx- WAMP-1a. ОФ-ВЭЖХ продуктов расщепления гибридного белка Trx-WAMP-1a бромцианом. Фракция, соответствующая WAMP-1a, отмечена стрелкой. На вставке - экспрессия и очистка гибридного белка Trx-WAMP-1a по данным электрофореза в ДДС-ПААГе (10%). (1) маркеры молекулярных масс, (2) лизат клеток E. coli BL21(DE3) с плазмидой pET-32b-M- WAMP-1a, до обработки IPTG, (3) после обработки 0,2 мМ IPTG, (4) растворимая фракция белков, (5) очищенный гибридный белок

6.8 Антимикробная активность рекомбинантного пептида WAMP-1a

Определение биологической активности пептида в отношении ряда грибов, включая дейтеромицеты и аскомицеты, выявило существенное ингибирование прорастания спор при микромолярных концентрациях пептида, IC₅₀ варьировала от 5 до 30 мкг/мл в зависимости от гриба.

Пептид также обладал способностью ингибировать рост фитопатогенных грамположительных (C. michiganense) и грамотрицательных (P. syringae и E. carotovora) бактерий. В случае грамположительных бактерий эффект был более выражен. Антифунгальные свойства пептида WAMP-1a, по всей видимости, связаны с его хитинсвязывающей активностью, в то время как активность в отношении оомицета Ph. infestans и бактерий, которые лишены хитина, обусловлена каким-то иным механизмом.

6.9 Установление структуры предшественника пептида WAMP-1a

Была установлена полная нуклеотидная последовательность мРНК, кодирующей пептид WAMP. Методом 3'- и 5'-RACE с использованием вырожденных праймеров, подобранных по аминокислотной последовательности пептида WAMP-1a была определена последовательность его кДНК длиной в 670 нуклеотидов (рис. 21).

ggaggaggcaccaagatcatgaagccacacatgtccgctacggtactgag

agccccgagggtggcggccatcctcctggccgtggtcctggcggcggtgc

tcgccacggccgtgaacggcgcccagaggtgcggcgaccaggcccgcggc

gcaaagtgccccaactgcctctgctgcggtaaatacggcttctgcggcag

tggcgacgcctactgcggcgccggcagctgccagagccagtgccgcggct

gccgggacgacgtcgtggggcaggcgttgccggccgaaccgggttctaca

agagctactgcggcgtcctcggcgtcggccaggggattaaacttgactgc

tacaaccggaggcccttgaacggctgggctcgcgtcgcagtgaagacggc

cggtgactacatagagcgtgagccctggacgaataatctcgacaagtact

agtatgtgaaaaaaataaatggacgaatgatttcccatttgtcttgtctt

atcgtgcatcagcatctttttgtcttcaataagaaatgggacagagaact

tgggtctagccagccggtggtaaagacctcctgaaggggtgtgttaattt

cgtcaatatttagagctctgcaattcagtctttaatatacatttgaaaaa

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Рис. 21 Нуклеотидная последовательность кДНК пептида WAMP-1а. Кодоны инициации и терминации трансляции выделены жирным шрифтом.

Оказалось, что структура экспрессируемого предшественника (препропептида) состоит из сигнального пептида и зрелой части, которая включает последовательность зрелого пептида и С-концевой продомен:

MKPHMSATVLRAPRVAAILLAVVLAAVLATAVNGAQRCGDQARGAKCPNCLCCGKYGFCGSGDAYCGAGSCQSQCRGCRDDVVGQALPAEPGSTRATAASSASARGLNLTATTGGP

Установлено, что, помимо изучаемого пептида WAMP-1а, в пшенице экспрессируется мРНК двух высокогомологичных ему пептидов сходной структуры, отличающихся от него заменой Аla34 на Lys34 в зрелой части.

6.10 Влияние биотических и абиотических факторов на экспрессию гена WAMP-1а

Была исследована регуляция экспрессии гена пептида WAMP-1а стрессовыми факторами среды. Для оценки уровня экспрессии мРНК в ответ на стрессовые воздействия биотической и абиотической природы использовали метод полуколичественной ОТ-ПЦР. Биотический стресс создавали воздействием грибных патогенов при инфицировании ими прорастающих семян пшеницы. Для изучения воздействия абиотического стресса были выбраны температурный и солевой стресс разной интенсивности. При изучении воздействия температурного стресса достоверных различий обнаружено не было ни в случае гипотермического стресса, ни при воздействии повышенной температуры.

При изучении воздействия солевого стресса было выявлено значительное увеличение экспрессии мРНК пептида WAMP-1a (рис. 22). Под действием соли количество транскриптов изучаемого гена возрастает в 4,3 - 5,7 раза, зависимость от концентрации NaCl не выражена.

При изучении воздействия биотического стресса было установлено, что грибные патогены оказывают различное действие на экспрессию мРНК пептида WAMP-1a. При заражении зерновок непатогенным для пшеницы грибом A. niger не наблюдалось достоверных различий в уровне экспрессии между опытным и контрольным образцом. При заражении патогенными грибами F. oxysporum происходило достоверное увеличение уровня экспрессии мРНК пептида WAMP-1а. Максимальный уровень увеличения экспрессии, наблюдавшийся у зараженных растений по сравнению с контрольной группой, состоял в 5-кратном усилении экспрессии.

При изучении воздействия биотического стресса было установлено, что грибные патогены оказывают дифференцированное действие на экспрессию мРНК пептида WAMP-1a. При заражении зерновок непатогенным для пшеницы грибом A. niger не наблюдалось достоверных различий в уровне экспрессии между опытным и контрольным образцом. При заражении патогенными грибами F. oxysporum происходило достоверное увеличение уровня экспрессии мРНК пептида WAMP-1а. Максимальный уровень увеличения экспрессии, наблюдавшийся у зараженных растений по сравнению с контрольной группой, состоял в 5-кратном усилении экспрессии. Различия между контрольным образцом и образцами, пораженными F. graminearum и H. sativum, не были достоверными.

Полученные нами данные о том, что синтез WAMP-1a при нормальных условиях вегетации осуществляется в 5-дневных проростках, свидетельствует о его роли на ранних стадиях развития растения, а накопление этого пептида при действии патогенов и в условиях солевого стресса дает основание предполагать его участие в устойчивости к биотическому и абиотическому стрессу.

6.11 4-Cys пептиды

Помимо дефензинов из семян T. kiharae нами было выделено 2 новых АМП, названных Tk-AMP-X1 и Tk-AMP-Х2, содержащих по 4 остатка цистеина в молекуле. С помощью масс-спектрометрии были установлены точные молекулярные массы этих пептидов: 3517 и 3857 Да, соответственно и определены их полные аминокислотные последовательности.

Tk-AMP-X1 ¹TDDRCERMCQHYHDRREKKQCMKGCRYGESD³¹

Tk-AMP-X2 ¹ADDRCERMCQRYHDRREKKQCMKRCRYG²⁸

Было установлено, что остатки цистеина в этих пептидах соединены следующим образом: Сys⁵-Cys²⁵ и Cys⁹-Cys²¹.

Сравнение аминокислотных последовательностей пептидов Tk-AMP-X1 и Tk-AMP-X2 показало, что выделенные пептиды обладают высокой гомологией. Установлено, что они ингибируют прорастание спор некоторых фитопатогенных грибов (F. graminearum, F. verticillioides, C. graminicola и D. maydis) in vitro показало, действуя в микромолярных концентрациях (табл. 9).

Таблица 9.

Антифунгальные свойства пептидов Tk-AMP-X1 и Tk-AMP-Х2*

Пептид	Tk-AMP-X1	Tk-AMP-Х2
Fusarium graminearum	7,5	7,5
Fusarium verticillioides	15	10
Diplodia maydis	30	17

*Приведены значения IC₅₀, мкМ

Подводя итог исследованию молекулярного полиморфизма антимикробных пептидов пшеницы, следует особо отметить, что в этом виде присутствуют практически все известные у растений семейства АМП.: тионины, дефензины, ноттиноподобные пептиды и липид-переносящие белки. Кроме ранее известных семейств, нами были обнаружены новые семейства, ранее не описанные у растений. Так, было открыто новое семейство глицин-богатых пептидов, семейство 4-Cys пептидов, новое подсемейство D дефензинов и новый структурный тип гевеиноподобных пептидов. Полученные нами результаты значительно расширяют наши представления о чрезвычайном структурном многообразии молекулярных компонентов защитной системы злаков.

Представляло интерес выяснить, является ли высокий молекулярный полиморфизм характерным лишь для злаковых, либо он присущ также другим видам растений. Для решения этого вопроса были исследованы антимикробные полипептиды у представителя двудольных растений семейства Asteraceae - одуванчика лекарственного Taraxacum officinale.

Исследование полипептидов семян Taraxacum officinale, обладающих антифунгальной активностью, показало, что в отличие от T. kiharae, основными детерминантами антифунгальной активности полипептидной природы в семенах T. officinale являются не АМП, а запасные 2S альбумины, представленные несколькими изоформами, каждая из которых состоит из двух субъединиц, соединенных двумя дисульфидными связями. Установлено, что эти белки способны подавлять рост ряда фитопатогенных грибов и оомицета Ph. infestans в микромолярных концентрациях, причем изоформы различаются по активности. Эти результаты свидетельствуют о многообразии и видоспецифичности защитного арсенала растений.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методология разделения и очистки запасных и защитных белков растений, позволяющая проводить структурно-функциональный анализ мономерных и полимерных проламинов (сем. Poaceae), 2S альбуминов (сем. Asteraceae), глобулинов (сем. Cucurbitaceae), PR-белков (сем. Solanaceae) и антимикробных пептидов (сем. Poaceae).

2. Впервые у гексаплоидной пшеницы Triticum aestivum проведено определение и сравнение N-концевых аминокислотных последовательностей глиадинов, кодируемых одним кластером генов (1D1 и 1B1), а также кластерами гомеологичных хромосом (D и B). Установлено, что компоненты одного кластера генов, локализованного на коротком плече хромосомы 1D (блок 1D1 у пшеницы Безостая 1) и хромосомы 1В (блок 1В1), существенно различаются по N-концевым аминокислотным последовательностям. У ?-глиадинов выявлено существование трех типов N-концевых аминокислотных последовательностей и показано, что N-концевые аминокислотные последовательности ?-глиадинов, кодируемых геномом D, значительно дивергировали от последовательностей ?-глиадинов генома В. В то же время выявлен значительный консерватизм аминокислотных последовательностей ?-глиадинов, кодируемых хромосомами А, В и D.

3. В ?- и ?-глиадинах обнаружены короткие повторяющиеся олигопептидные мотивы, что дает основание полагать, что гены ?- и ?- глиадинов произошли в результате многократных дупликаций коротких нуклеотидных последовательностей ДНК.

4. Исследование глиадинов двух видов эгилопсов Ae. squarrosa и Ae. longissima - предполагаемых доноров геномов B и D пшеницы, выявило высокую внутривидовую изменчивость этих видов и показало, что у эгилопсов встречаются те же типы N-концевых аминокислотных последовательностей глиадинов, как у гексаплоидных пшениц. Таким образом, хотя гены проламинов и претерпевали изменения в ходе эволюции за счет мутаций и хромосомных перестроек, определенная часть их последовательностей оставалась консервативной в течение длительного эволюционного периода.

5. Дисульфидное картирование двух представителей суперсемейства проламинов - глиадина ?-46 пшеницы и 2S альбумина подсолнечника выявило высокий консерватизм расположения дисульфидных связей как между глиадинами и 2S альбуминами, так и в пределах каждой из этих групп белков. В то же время у других членов суперсемейства проламинов, ингибиторов ?-амилаз и трипсина злаков, только две дисульфидные связи с участием двух соседних остатков цистеина сохраняют свое положение. Эти различия, по всей видимости, связаны с необходимостью поддерживать структуру активных центров при взаимодействии с ферментами-мишенями.

6. При исследовании субъединиц глютенина гексаплоидной пшеницы T. aestivum. обнаружена новая D субъединица глютенина и показана ее роль в терминации роста полимерной цепи глютенинов, определяющей качество клейковины пшеницы. Показан консерватизм аминокислотных последовательностей в окружении остатков цистеина у высокомолекулярных субъединиц глютенина HMWx7 и HMWy18, и аллельной пары HMWx7 и HMWy9, обусловливающих хорошие вязко-эластичные свойства клейковины, что свидетельствует о ключевой роли дисульфидных связей в формировании надмолекулярной структуры клейковинного комплекса..

7. При использовании разработанного метода разделения полимеров глютенина в агарозном геле с измерением светорассеяния установлено, что молекулярные массы полимеров глютенина варьирует от 500000 до 5 млн. дальтон. Предложенный метод может быть использован для фракционирования глютенинов сортов пшениц, различающихся по технологическим характеристикам, а также для разделения других высокомолекулярных полимерных белков.

8. Разработаны электрофоретический и хроматографический методы исследования полиморфизма запасных белков тыквенных культур. Показана возможность идентификации генетически отдаленных форм огурца по электрофоретическим спектрам альбуминов, разделенных методом электрофореза в денатурирующих и кислых условиях, а также районированных сортов тыкв по электрофоретическим спектрам кукурбитина и альбуминов, а также по профилю элюции кислоторастворимых альбуминов при ОФ-ВЭЖХ.

9. Впервые изучено наследование субъединиц кукурбитина - основного глобулина семян тыквенных культур. Показано, что: компоненты электрофоретического спектра кукурбитина наследуются кодоминантно при отсутствии эффекта дозы генов. Аллели представлены отдельными полипептидами в электрофоретическом спектре, различающимися по относительной подвижности, а синтез вариабельных компонентов кукурбитина контролируется 4 независимыми локусами.

10. Предложена генетическая классификация кукурбитина и способ записи электрофореграмм этого белка в виде генетических формул, составленных для 38 сортов тыкв отечественной селекции. Показано, что большинство районированных сортов тыкв гетерогенны по кукурбитину. Эффективность предложенного экспресс-метода определения сортовой чистоты семян тыкв по электрофоретическим спектрам кукурбитина превышает традиционно используемый грунтконтроль.

11. Изучены PR-белки, относящиеся к защитной системе растений, у томатов с разными генами устойчивости (Tm-1, Tm-2 и Tm-2²) к ВТМ инфекции. Обнаружены специфические белки, характерные для каждого генотипа, которые могут быть использованы в качестве маркеров соответствующих генов в селекционном процессе.

12. Впервые исследованы трансгенные растения табака, экспрессирующие двунитевую РНК, не имеющую гомологии с геномами вируса и табака, и показано повышение устойчивости трансгенных растений к тобамовирусам. В инфицированных трансгенных растениях выявлен индуцируемый инфицированием синтез двух новых полипептидов, относящихся к PR-белкам -семейству ?-эндоглюканаз растений. Высказано предположение об участии этих белков в системе антивирусной защиты растений.

13. Среди PR-белков при вирусной инфекции в растениях томатов различного генотипа обнаружены интерфероноподобные белки, что свидетельствует о том, что у растений и животных действует сходный механизм защиты от патогенов, связанный с образованием антивирусных интерфероноподобных веществ.

14. Впервые при систематическом анализе антимикробных пептидов, важнейших компонентов врожденной защитной системы растений, у пшеницы Triticum kiharae Dorof. et Migusch. выделены 24 новых пептида, относящихся к 6 семействам, и установлена первичная структура 12 из них. Обнаружено новое семейство глицин-богатых пептидов растений и новый структурный тип гевеиноподобных пептидов. Выявлена высокая ингибирующая активность этих пептидов в системе in vitro в отношении ряда фитопатогенов.

15. Впервые показано наличие в зерновках пшеницы практически всех известных семейств антимикробных пептидов растений. Высокий молекулярный полиморфизм защитных пептидов у рода Triticum, вероятно, обеспечивает адаптацию к неблагоприятным факторам окружающей среды и является одной их причин, которые обусловливают распространение злаков по всем континентам и климатическим зонам Земного шара.

16. Выявлен молекулярный полиморфизм в пределах семейств антимикробных пептидов Triticum kiharae, который реализуется как на генном уровне (дефензины), так и на посттранскрипционном уровне (4-Cys и 6-Cys пептиды). Показано, что семейство дефензинов Triticum kiharae структурно неоднородно, и состоит, по крайней мере, из трех подсемейств, имеющих, по всей вероятности, различное эволюционное происхождение. Установлено, что детерминанты антифунгальной активности дефензинов семейства Poaceae локализованы в С-концевой области молекулы.

17. Впервые изучены дефензины Triticum monococcum, Triticum urartu, Triticum boeoticum, Aegilops squarrosa и Aegilops speltoides, предполагаемых доноров геномов полиплоидных пшениц. Сравнение дефензинов полиплоидных пшениц с дефензинами диплоидных видов свидетельствует о том, что структура дефензинов высоко консервативна в эволюции. Установлена геномная локализация генов дефензинов. Показано, что дефензины D1, D1.1 и D1.2 кодируются геномом А, D3.1 и D6.1 - геномом В, D3 и D6 - геномом D.

18. Среди антимикробных пептидов Triticum kiharae идентифицирован новый пептид WAMP-1, относящийся к ранее неизвестному структурному типу гевеиноподобных пептидов растений, обладающий высокой антифунгальной и антибактериальной активностями. Определена нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая предшественник пептида WAMP-1а и показано, что в пшенице экспрессируются еще две высокогомологичные мРНК. Установлена структура предшественников пептида WAMP-1а и его гомологов и показано, что они состоят из сигнального пептида, зрелого пептида и С-концевого продомена. Исследование регуляции экспрессии гена пептида WAMP-1 выявило высокий уровень экспрессии гена в проростках, а также повышение экспрессии в ответ на солевой стресс и заражение некоторыми фитопатогенными грибами, что свидетельствует об участии этого пептида в защите растений пшеницы от патогенов и солевого стресса. Разработана система гетерологичной экспрессии в прокариотической системе нового гевеиноподобного пептида Triticum kiharae WAMP-1а. позволившая получить рекомбинантный пептид, идентичный нативному, с высоким выходом. Предложенная бактериальная система экспрессии может быть использована при разработке технологии получения антимикробных пептидов.

19. Сравнение антимикробных полипептидов двух видов растений - однодольных Triticum kiharae и двудольных Taraxacum officinale, свидетельствует о видоспецифичности «защитного арсенала» растений. В отличие от пшеницы, в семенах Taraxacum officinale основными детерминантами антифунгальной активности являются не антимикробные пептиды, а запасные 2S альбумины.

20. Исследования запасных и защитных белков гексаплоидных пшениц и предполагаемых доноров их геномов свидетельствуют о том, что генетический состав ныне существующих диплоидных видов не идентичен составу тех видов, которые участвовали в создании тетра- и гексаплоидных пшениц, а также, что геном В культурных пшениц является сложным геномом, который модифицировался в ходе эволюции за счет интрогрессивной гибридизации с различными диплоидными видами родов Triticum и Aegilops.