Получение препаратов ряда протеиназ и исследование их физико-химических свойств

В дальнейшем нами проводились исследования по влиянию концентрации органических растворителей на выход фермента при оптимальном значении рН. Наблюдалось монотонное осаждение фермента при последовательном увеличении концентраций осадителей, выход фермента возрастал до определённого предела.

Оптимальная концентрация ацетона 66,6% (в объёмных соотношениях 1: 2). Степень очистки была более высокой, чем для этанола (1,5 раза) - однако выход по активности всего 62%. Лучшим органическим осадителем для протеиназы Pen. Wortmannii 2091 явился изопропанол. При концентрации его в смеси 50% выход протеиназы составил 90, 5%, степень очистки 2,78 и удельная активность 3,06.

Таким образом, изопропанол избирательно осаждает протеолитические ферменты, что повышает степень их очистки и снижает содержание баластных примесей. Однако на практике вполне можно использовать и этанол.

В дальнейшем проведены исследования по осаждению протеиназы сульфатом аммония. Было установлено, что при оптимальных условиях (степень насыщения 0,8 рН 7,5) выход фермента составил всего 23%. Низкий выход фермента не позволил в дальнейшем использовать эту соль для получения препарата Pen. Wortmannii BKMF 2091.

Из анализа вышеприведённых данных можно сделать вывод, что для осаждения препарата протеиназы целесообразно применение этанола и изопропанола. В зависимости от назначения препарата возможно применение этого или иного растворителя с практически одинаковым эффектом.

3.2 Фракционирование протеолитического комплексного препарата ферментов

Полученный осаждением органическими растворителями препарат нами назван „протовортманин Г10х”. В дальнейшем представляло интерес изучить его компонентный состав и идентифицировать протеолитические фракции. Для этого был использован метод дискового электрофореза в ПААГ. Электорофорез вели с учётом „нейтральной''природы протеолитического комплекса.

Компонентный состав препарата представлен четырьмя фракциями, отличающимися подвижностью в электрическом поле, размерами и интенсивностью окраски белковых полос.

Идентификацию протеолитических фракций проводили двумя способами: насыщением ПААГ денатурированным гемоглобином (pH 7,2) после дискового электрофореза и последующим выявлением прогидролизованных участков; экстракцией белкового спектра из ПААГ дистиллированной водой с определением протеолитической активности в экстрактах.

При гидролизе гемоглобина в ПААГ обнаружены две протеолитические фракции, которые проявились в виде двух светлых полос. Это свидетельствовало о том, что комплекс ферментов, гидролизующий белки в нейтральной области pH сложен и представлен двумя фракциями. Аналогичными были данные при использовании метода экстракции белковых полос из геля.

Таким образом, используя методы дискового электофореза было установлено, что компонентный состав полученного препарата представлен четырьмя фракциями, две из которых протеолитические. Кроме активного протеолитического комплекса препарат „протовортманин Г10х” содержал в своём составе глюкоамилазу (ГЛА 20ед/г) и альфаамилазу (3ед/г), сопутствующие ферменты, а также баластные вещества. Для получения гомогенных протеолитических фракций необходимо ввести более глубокую очистку.

3.3 Влияние температуры и рН на активность фермента

Нами была поставлена цель определить рН и температурные оптимумы действия выделенных протеиназ Penicillium wortmannii 2091 и дать их сравнительную характеристику.

Нужное значение рН субстрата поддерживали с помощью 0,1М универсального буфера. Гидролиз вели при температуре 30^оС в течение 30 минут. Ферментативную активность определяли стандартным методом [12].

Однако максимум активности наблюдается при различных значениях рН. Протеиназа 1 имеет оптимальное значение рН 7,2, в то время как протеиназа 2 - 10,0. Таким образом, протеиназа 1 имеет нейтральную природу, а протеиназа 2 - щелочную.

Температурный оптимум действия ферментов определяли в интервале температур 30 - 80^оС при оптимальных значениях рН 7,2 и 10,0. На рис.3 показано влияние температуры на активность ферментов. Для протеиназы 1 максимальный гидролиз наблюдается при температуре 60^оС, а протеиназы 2 - 40^оС.

Таким образом, протеолитический комплекс Penicillium wortmannii 2091 представлен двумя ферментами, имеющими различные температурные и рН - оптимумы.

3.4 Определение молекулярной массы

Молекулярную массу ферментов Penicillium wortmannii 2091 определяли методом гель-фильтрации на сефадексе У-100 [8].

Установлено, что соотношение объёма элюента, необходимого для выноса исследуемого белка из колонки (V - объём элюента) и объёма элюата, размещающемся в свободном (не занятом гранулами сефадекса) пространстве колонки (V₀ - свободный объём), обратно пропорционально величине молекулярной массы белка. Для расчёта использовали формулу:

LgM=5,941-0,847 V/V₀

Молекулярная масса протеиназы 1 оказалась равной 34500, протеиназы 2 - 20800, т.е. обе фракции относятся к низкомолекулярным белкам.

3.5 Исследование процессов кислотной и термической инактивации

Изучение термо- и рН-стабильности ферментов часто несёт прикладной характер.

Исследование этих характеристик проводится остаточной активностью фермента после выдержки его раствора в течение некоторого времени при определённых рН и температуре [11].

Нами были проведены исследования кинетики кислотной и термической инактивации протеиназ Penicillium wortmannii 2091 и рассчитаны кинетические параметры этого процесса.

При изучении термо- и рН -стабильности раствор препарата выдерживали в фосфатном буфере в диапазоне рН от 5,0 до 12,0 и температур от 30 до 60^оС. Периодически отбирали аликвотные доли раствора и определяли остаточную протеолитическую активность.

Полученные результаты по инактивации обоих ферментов показали, что протеиназа 1 сохраняет активность в широком диапазоне рН. При значении рН 7,0 через 200 часов фермент сохраняет около 90% активности (рис.4). При значениях рН 6,0 - 9,0 активность фермента снижается до 70 - 75%, это указывает на то, что фермент в указанном интервале не подвержен автолизу, а, следовательно, его нативная конформация обладает высокой стабильностью. При значениях рН ниже 6,0 и выше 11,0 каталитическая активность фермента быстро снижается.

Во всех случаях ПА/КлА-const, это свидетельствует о том, что мы имеем дело с одним ферментом.

Термическую инактивацию протеиназ изучали в интервале температур 30 - 60^оС. Протеиназа 1 в области высокой рН-стабильности инактивируется почти полностью при температуре 60^оС в течение 60 часов, в то время как протеиназа 2 при этой же температуре инактивируется полностью уже за 3 часа. Данные свидетельствуют о высокой термостабильности протеиназы 1. Инактивация протеиназы 2, происходящая при высокой температуре, по-видимому, определяется процессом разворачивания белковой глобулы.

Протеиназа 1, обладающая коллагенолитическим действием, нас интересует с практической точки зрения, поэтому были рассчитаны некоторые кинетические характеристики для этого фермента.

Если предположить, что в каждом элементарном акте процесса инактивации фермента под действием Н⁺ - ионов участвует одна его молекула, то кислотную инактивацию можно представить в виде реакции первого порядка. Кинетическое уравнение первого порядка имеет вид:

2,303 lg E₀/E=K,

где Е₀ - исходная активность фермента

Е - активность в момент времени

К - константа скорости инактивации, характеризующая потерю активности в течение часа, час^-1.

Остаточную активность выражали в процентах от исходной и затем использовали в расчётах констант инактивации. Величину находили, как среднее из 5 - 6 определений (табл.1).

Таблица 2. Кислотная инактивация протеиназы 1 при температуре 50⁰С.

, ч	Значения рН
	5,0	7,0	9,0	11,0
	Е	К*103ч-1	Е	К*103ч-1	Е	К*103ч-1	Е	К*103ч-1
0	100	2	100	2	100	2	100	2
12	65,1	37,0	100	2	100	2	63,2	38,1
24	45,2	33,6	92,3	2,33	92,3	2,33	42,3	36,0
48	16,8	37,7	88,0	2,54	87,8	2,54	18,1	36,3
96	7,6	36,8	81,0	2,23	81,5	2,19	7,0	37,1
120	6,7	35,7	66,3	2,50	68,2	2,30	6,5	37,7
144	6,5	33,1	62,2	2,56	60,9	2,54	6,0	34,0

Как видно из табл.2, при определённом рН, значения констант достаточно близки друг к другу, максимальное отклонение от средних значений не превышает 10 - 15%, что вполне допустимо в исследованиях кинетики химических реакций. Это свидетельствует о том, что процесс инактивации протеиназы 1 является реакцией первого порядка. Различия в значениях при рН 5,0 и 11,0 и при рН 7,0 - 10,0 на целый порядок ещё раз указывают на лабильность фермента в слабо - кислой и слабо - щелочной зонах.

Исследования термической инактивации протеиназы 1 при различных значениях рН позволили рассчитать константы инактивации для температур 30, 40, 50, 60^оС, а затем найти термодинамические параметры этого процесса.

Термодинамические расчёты были проведены только для вышеуказанных температур (табл.2).

Таблица 2. Термодинамические характеристики активированного комплекса протеиназы I.

t, oC	PH	Еакт	Н	F	S Дж*К-1*моль-1
		Дж*моль-1
30-60	5,0	245,8	244,6	53,2	600,3
30-40	7,0	75,6	72,0	68,1	13,6
40-60	7,0	300,5	298,2	60,0	734,9
30-40	9,0	72,4	71,0	69,9	9,9
40-60	9,0	295,9	294,1	60,0	723,9
30-40	11,0	255,9	253,6	54,9	624,3

Поскольку инактивация протеиназы была необратимой, для определения энтальпии Н, свободной энергии F и энтропии S воспользовались теорией абсолютных скоростей Эйринга.

При повышении температуры скорость инактивации возрастает. Это можно объяснить тем, что тепловая энергия разрушает гидрофобные взаимодействия, которые играют важную роль в стабильности белков. В результате происходит развёртывание полипептидной цепи, что подтверждается высокими значениями S и согласуется с литературными данными.

Таким образом, изменение величины рН вызывает разрушение электростатических сил, и решающую роль в этих условиях в процессе инактивации играют, по-видимому, гидрофобные взаимодействия.

3.6 Влияние ионов металлов и ингибиторов на активный центр фермента

Главным признаком, используемым при отношении протеолитических ферментов к тому или иному классу, является строение каталитического центра.

Отправной точкой в изучении строения активного центра, механизма катализа является идентификация функциональных групп, что достигается комплексными исследованиями и, в первую очередь, применением специфических ингибиторов. В наших опытах в качестве ингибиторов были использованы ЭДТА, монойодуксусная кислота, n-хлормеркурийбензоат натрия, фенилметилсульфатонилфторид, диизопропилфторфосфат, перманганат калия.

Растворы ферментов, содержащие 510^-3М этих соединений, выдерживали при 30^оС в течение одного часа.

Как показали результаты опытов, протеиназа 1 полностью инактивировалась ЭДТА - ингибитором металлоферментов, остальные ферменты не изменяли протеолитическую активность.

Протеиназа 2 инактивировалась монойодуксусной кислотой и n-хлормеркурийбензоатом натрия на 84 и 63% соответственно. Фермент терял активность при воздействии фенилметилсульфатонилфторидом и диизопропилфторфосфатом, это даёт возможность предположить, что протеиназа 2 относится к «сериновым». Не оказывал влияния не на одну из протеиназ перманганат калия, что свидетельствует об отсутствии в активном центре карбоксильной группы.

На основе полученных данных можно предположить, что протеиназа 1 относится к «металлоферментам», а протеиназа 2 - к «сериновым».

В дальнейшем было интересно рассмотреть влияние на протеиназы гистидина. На протеиназу 2 он не оказывал ингибирующего действия, в то время как полностью ингибировал протеолитическую и коллагеназную активности протеиназы 1. Из литературы известно, что гистидин является ингибитором коллагеназ. В связи с чем очевидно, что протеиназа 1 является ферментом, проявляющим свойства протеиназы с коллагеназным действием..

К специфическим реагентам относятся также ионы металлов. Они могут оказывать ингибирующий или активирующий эффект. В наших опытах мы использовали соли двухвалентных металлов в виде хлоридов и концентрации 0,005М. Фермент выдерживали в соли, а затем определяли остаточную активность. Ионы Mn²⁺, Ca²⁺, Ba²⁺ практически не оказывали никакого влияния на активность обеих протеиназ; Zn²⁺, Co²⁺ незначительно ингибировали оба фермента, ионы Cd²⁺, Cu²⁺ ингибировали протеиназу 1, а протеиназа 2 ингибировалась ионами Fe²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Cu²⁺ . Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Влияние ионов металлов на активность протеиназ Penicillium wortmannii 2091.

Ион металла С=0,005М	Ферментная активность, % от исходной.
	Протеиназа I	Протеиназа II
Mn2+	100,0	95,39
Ca2+	100,0	100,0
Ba2+	100,0	100,0
Zn2+	95,2	95,2
Co2+	93,9	95,2
Cu2+	34,5	19,2
Cd2+	20,4	20,8
Ni2+	98,5	67,5
Fe2+	97,9	44,9

3.7 Субстратная специфичность

В изучении протеолитических ферментов значительное место занимают исследования специфичности их действия. В литературе нет сведений, касающихся вопроса специфичности действия протеиназ грибов рода Penicillium. В связи с этим исследовалась способность протеиназы 1 к гидролизу некоторых пептидных связей.

Исследования проводили на синтетических пептидах и различных белках. Результаты показали, что протеиназа 1 гидролизовала довольно широкий спектр пептидных связей. Она разрывала связи в пептидах: цис - ала, про - ала, гли - лей, гли - мет, ала - гли - гли, ала - гли - фен. Следует отметить, что гидролизу подвергались связи, характерные для белков животного происхождения. В связи с этим мы исследовали специфичность действия протеиназы на животных белках. В качестве субстратов использовались: казеин, гемоглобиин, денатурированный мочевиной, кератин, коллаген, желатина. При одной и той же концентрации фермента наиболее активно расщепляется казеин (78 - 80%) и гемоглобин (60 - 62%), затем слабее желатина и коллаген. Менее всего гидролизу подвергается кератин (22 - 25%).

3.8 Гидролиз коллагенсодержащего сырья: ноги птиц, шквара

Мясная промышленность располагает значительным количеством шквары, получаемой при перетопке говяжьего и свиного жиросырья. Анализ химического состава шквары свидетельствует о значительном содержании в ней белковых веществ и подтверждает целесообразность её использования как в колбасном, так и ряде других производств. Общее содержание белка в шкваре колеблется в пределах 65 - 80%. В состав белков входят 22 - 44% коллагена и 19 - 30% эластина. Однако использование шквары ограничивалось из-за большого содержания соединительной ткани. В настоящее время соединительную ткань рассматривают не как билластное вещество, а как необходимый компонент питания [10]. В связи с этим возрастает практический интерес к рациональному и полному использованию шквары на пищевые цели, разработке путей повышения её биологической ценности. Это направление явилось основой разрабатываемой нами темы. Для получения гидролиза шквары целесообразно использование протеиназ, расщепляющих белки в нейтральной зоне рН и действующих на коллаген. Нами был проведён сравнительный анализ промышленных препаратов, обладающих этими свойствами и полученного препарата (табл. 4).

Таблица 4. Характеристика протеолитических свойств и степени гидролиза гомогената шквары под действием различных ферментных препаратов.

Фермент	Массовая доля, %	рН	ПА, ед/см 3	Аминный азот, мг на см3 субстрата
Протовортманин	0,1	7,2	0,838	7,616
Протосубтилин	0,1	7,2	0,0476	5,068
Панкреотин	0,1	7,2	0,0570	4,868
Пепсин	0,1	7,2	-	-
Пигмауесин	0,3	7,2	-	-
Контроль	-	7,2	-	0,000

Контролем служила среда, где вместо фермента была добавлена дистилированная вода в аликвотном количестве.

Согласно полученным результатам, препарат протовортманин наиболее эффективен при получении белкового гидролизата.

В дальнейшем нами были определены условия эффективной работы фермента. Наши исследования ограничивались изучением влияния гидромодуля среды, температуры, продолжительности гидролиза, дозировки препарата, т. е. параметров, играющих решающее значение для разрабатываемой технологии и влияющих на экономику процесса.

Протеолитические ферменты катализируют реакцию расщепления белков с участием воды. В связи с этим важным моментом в подборе условий гидролиза является определение минимального гидромодуля для высокого гидролиза субстрата.

Постановка эксперимента заключалась в следующем: в семь колб объёмом в 100см³ вносили по 10 г гомогената шквары, затем одновременно раствор ферментного препарата и соответствующий объём воды. После внесения фермента и воды колбы закрывали и ставили на 3 часа в ультратермостат при 50^оС. Результаты эксперимента оценивали по степени накопления аминного азота (рис.6). Как видно на рисунке 6 для активного гидролиза белков сырья достаточен гидромодуль гомогенат / вода = 1/1 : 1,5. Дальнейший рост содержания воды в среде увеличения степени гидролиза не даёт.

Решающее значение в ферментативных реакциях имеет температура: при низких температурах фермент может быть практически не активен, а высокие температуры могут привести к инактивации фермента. Поэтому при постановке этого эксперимента особое внимание уделялось поддержанию строгого температурного режима. Эксперимент проводился в трёх поверхностях. В 15 колб по 100см³ вносили 10 г гомогената. Колбы помещали в термостаты при температурах 20, 30, 40, 50, 60^оС. Затем вносили по 3см³ фермента и 12см³ воды (согласно ранее полученным данным), плотно закрывали и вели гидролиз в течение 3 часов. По истечению 3 часов из каждой колбы отбирали по 10см³ субстрата и определяли аминный азот по методике Серенсена. Наибольшее накопление аминного азота, а, следовательно, и максимальная степень гидролиза наблюдается при температуре 50^оС. При температурах 20, 30, 40^оС гидролиз, видимо, идёт не до конца, т. е. эти температуры не обеспечивают достаточной катализирующей способности ферментного препарата и требуют увеличения продолжительности процесса гидролиза, что с точки зрения технологического процесса очень невыгодно.

Температура 60^оС приводит, по-видимому, к частичной инактивации фермента. Дальнейшее увеличение температуры приведёт, скорее всего к полной инактивации фермента, поэтому исследование действия ферментного препарата при температурах выше 60^оС не имеет смысла.

Таким образом, оптимальная температура гидролиза субстрата препаратом из Penicillium wortmannii 2091 равна 50^оС.

Дальнейшим этапом нашей работы было определение дозировки препарата. Дозировка препарата в большей степени отражается на экономической стороне процесса, так как ферментные препараты пока ещё имеют достаточно высокую стоимость. Эксперимент проводился по аналогии с предыдущим с учётом оптимальной температуры и внесением различного количества ферментного препарата. Фермент вносили (по ПА) в количестве 2,0, 2,5, 3,0, 4,0, 5,0 ед. (в расчёте на 10 г гомогената). После трёх часов гидролиза определяли аминный азот.

Исходя из полученных в ходе эксперимента данных можно сделать вывод о целесообразности внесения 4,0 ед. (по ПА) ферментного препарата в расчёте на 10 г белкового сырья.

Время гидролиза, необходимое для течения реакции, отражается на продолжительности всего технологического процесса. Именно с целью определения минимального времени гидролиза с максимальным эффектом накопления аминного азота был поставлен следующий эксперимент: гомогенат в количестве 40 г, с выбранным гидромодулем, помещали в термостат при 50^оС и добавляли раствор фермента в оптимальном количестве. Пробы отбирали каждый час с момента внесения фермента. Эксперимент проводился в трёх повторностях.

Анализируя результаты можно сказать, что первые пять часов идёт накопление аминного азота, следовательно, гидролиз ещё не окончен и целесообразно его продолжать. После 6 - 7 часов гидролиза изменение аминного азота незначительно, т. е. процесс гидролиза, видимо, находится на стадии завершения.

Таким образом, оптимальная продолжительность процесса гидролиза укладывается в 6 часов.

Для того, чтобы судить о ценности полученного гидролиза была проведена оценка полученного продукта в сравнении с исходным сырьём (табл. 5).

Таблица 5. Характеристика химического состава исследуемых продуктов.

Показатель	Гомогенат шквары	Гидролизат шквары
Плотность, кг/м3	1,005	1,005
рН	7,75	7,40
Сухие вещества, %	8,4	8,4
Жир, %	2,2	2,2
Общий азот, %	7,25	7,25
Белковый азот водорастворимый, %	2,5	0,91
Аминный азот, мг/г	1,6	11,0
Вязкость	42	4,2

Анализируя данные таблицы 6 можно сделать следующие выводы: полученный гидролизат значительно отличается по свойствам от исходного продукта. Гидролизат шквары характерен накоплением большого количества свободных аминокислот, о чём свидетельствует резкое увеличение аминокислот азота и снижение рН среды. Как показали наши исследования, заметные изменения произошли во фракционном составе белковых компонентов. В результате гидролиза высота нерастворённого осадка продукта уменьшилась в 4 раза, почти в 4 раза уменьшилось содержание водорастворимых белков. Накопление низкомолекулярных продуктов распада белков, видимо, является причиной потери желирующих свойств водорастворимой фракции и снижения вязкости среды в 10 раз.

Снижение жира практически не изменилось, т. е. фермент не обладает липазной активностью. Анализ свойств гидролизата дал возможность судить о ценности белкового продукта, полученного из шквары и возможности использования его в производстве в качестве заменителя основного сырья.

Мясная промышленность располагает большими резервами увеличения выработки ценных пищевых продуктов. В настоящее время большое внимание уделяется рациональному использованию малоценных продуктов убоя и переработки птицы для получения белковых гидролизатов, которые находят широкое применение не только как компонент пищи, но и как диетический продукт для лечебного питания. Питательная ценность белковых пищевых гидролизатов зависит от технологии их производства. В мировой практике широко используются процессы кислотного и щелочного гидролиза белков. Однако они имеют ряд недостатков. Так при щелочном гидролизе практически полностью разрушается серин, треонин, аргенин, цистеин. Полученные гидролизаты обладают неприятным вкусом. Кислотный гидролиз протекает быстрее и более специфично. Ферментативный гидролиз лишён этих недостатков, что позволяет значительно повысить питательную ценность получаемых продуктов и имеет ряд преимуществ. При его применении исключается жесткое воздействие на белковые молекулы, распад аминокислот, возможен подбор системы ферментов и условий процесса, что позволяет создать оптимальную технологию переработки разных видов белкового сырья. Путём подбора ферментов можно добиться получения гидролизата без горького привкуса.

ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

4.1 Межпредметность - современный принцип обучения

Совершенствование содержания образования в школе опирается на комплексное использование в обучении межпредметных связей. Это является одним из критериев отбора и координации учебного материала в программах смежных предметов.

Межпредметные связи всесторонне влияют на процесс обучения - от постановки задач до его организации и результатов. Им свойственны методологические, формирующие (образовательные, развивающие, воспитывающие) и конструктивные (системообразующие) функции в предметной системе обучения. Полифункциональность межпредметных связей определяет неоднозначность их понятийной трактовки. Наиболее полная реализация возможностей межпредметных связей, проявление всех их функций в единстве достигаются, когда межпредметные связи функционируют в процессе обучения как самостоятельный принцип построения локальных дидактических систем [21].

Рассмотрение межпредметных связей в русле методологических основ обучения позволяет видеть в них дидактическую форму общенаучного принципа системности. Они вносят системообразующее начало в предметное обучение, обеспечивают целостность процесса обучения, выполняя в нем обобщающие функции (методологическую, формирующую, конструктивную).

Межпредметные связи способствуют повышению теоретического и научного уровня обучения, их осуществление способствует приобщению школьников к системному методу мышления; формируют научное мировоззрение учащихся; обеспечивают систему в организации предметного обучения.

Таким образом, межпредметные связи являются важным фактором совершенствования процесса обучения в целом, на всех его уровнях.

Исходя из общности структуры учебных предметов и структуры процесса обучения, можно выделить три основных типа межпредметных связей: содержательно - информационные, операционно - деятельностные, организационно - методические.

Межпредметные связи на основе содержания знаний можно отнести к типу содержательно - информационных. Виды связей этого типа различаются:

по составу научных знаний (фактологические, понятийные, теоретические);

по знаниям о познании (философские, историко-научные, семиотические, логические);

по знаниям о ценностных ориентациях (диалектико-материалистические, идейно-политические, политико-экономические, эстетические, этические, правовые).

Связи в способах учебно-познавательной деятельности и умений учащихся в обучении разным учебным предметам относят к типу операционно -деятельностных. Виды связей данного типа:

практические, которые способствуют выработке у учащихся двигательных, трудовых, конструктивно - технических, вычислительных, экспериментальных, речевых умений;

познавательные, которые формируют общенаучные обобщенные умения мыслительной, творческой, учебной, операционно - познавательной, самообразовательной деятельности;

ценностно - ориентационные, необходимые для выработки умений оценочной, коммуникативной, художественно-эстетической деятельности, что имеет большое значение в формировании мировоззрения школьника.

Межпредметные связи функционируют в процессе обучения и осуществляются с помощью методов и организационных форм. Это позволяет выделить вторичный, подчиненный первым двум тип организационно-методических связей, имеющих самостоятельное значение. Межпредметные связи этого типа обогащают методы, приемы и формы организации обучения.

Виды связей данного типа различаются:

по способам усвоения связей в различных видах знаний (репродуктивные, поисковые, творческие);

по широте осуществления (межкурсовые, внутрицикловые, межцикловые);

по времени осуществления (преемственные, сопутствующие, перспективные);

по способу взаимосвязи предметов (односторонние, двусторонние, многосторонние);

по постоянству реализации (эпизодические, постоянные, систематические);

по уровню организации учебно-воспитательного процесса (поурочные, тематические и др.);

по формам организации работы учащихся и учителей (индивидуальные, групповые, коллективные).

Межпредметные связи реализуются в различных формах организации учебной и внеурочной деятельности [9].

Урок межпредметного характера должен удовлетворять определенным дидактическим требованиям. Урок такого типа должен иметь четко сформулированную учебно-познавательную задачу, для решения которой необходимо привлечение знаний из других предметов; обеспечить высокую активность учащихся по применению знаний из других предметов; содержать выводы мировоззренческого характера, обобщающих и опирающихся на связь, синтез знаний из разных предметов, причинно-следственные связи, сущность изучаемых явлений; вызвать положительное отношение учащихся, возбуждать у них интерес к познанию связей между знаниями из разных курсов; быть нацеленным на обобщение определенных разделов учебного материала смежных учебных предметов [9,19, 22, 25].

Методические приемы осуществления межпредметных связей на уроке [22].

Обычные методы и приёмы, ориентированные на установление межпредметных связей.	Специфические для межпредметных связей, обогащающие мотивацию системы методов обучения.
Домашние задания по другим предметам. Включение в изложение учителя межпредметного материала другого предмета. Беседа и воспроизведение знаний другого предмета. 4. Применение наглядных пособий, приборов, фрагментов диа- и кинофильмов. 5. Постановка проблемных вопросов. 6. Решение количественных и качественных задач, кроссвордов межпредметного характера. 7.Сообщения учащимся по материалам другого предмета.	Работа с учебниками по нескольким предметам на уроке. Использование и изготовление комплексных наглядных пособий, обобщающих учебный материал нескольких предметов. Выполнение письменных самостоятельных работ, которые разрабатываются и оцениваются учителями разных предметов. Комплексные задания, межпредметные тесты, дифференцированные по предметам групповые задания. Введение межпредметных тетрадей (выполнение заданий по разным предметам, направленные на решение общей учебной проблемы). Групповая работа учителей по организации изучения межпредметных проблем.

4.2 Межпредметные связи на уроках химии

Реализация межпредметных связей химии с другими дисциплинами предполагает осуществление комплексного подхода к отбору учебного материала, т.е. привлечение теоретических и эмпирических сведений из смежных дисциплин для многоаспектного освещения основных вопросов школьного курса химии с целью формирования у учащихся целостных и системных знаний по предмету. Механизм формирования таких знаний - межпредметный синтез, результаты которого должны стать средством добывания новых знаний, основой дальнейшего познания и развития личности учащегося.

Наиболее важными и перспективными для формирования научного мировоззрения и мышления школьников, их экологического образования и воспитания, формирования целостного восприятия реальных предметов и явлений являются связи химии с предметами естественно-математического цикла.

Курс химии связан с предметами этого цикла (биологией, географией, физикой, математикой) разными видами межпредметных связей: предшествующие, сопутствующие, перспективные, понятийные, фактические, теоретические и др. [23].

Общими для учебных предметов химии и физики, например, являются: система понятий о веществе и его строении, которая необходима для усвоения фундаментальной физико-химической теории строения вещества; система понятий об энергии. Химию, биологию и физику объединяет система понятий о материи, формах ее движения и уровнях организации. В процессе осуществления межпредметных связей «биология - химия - физика» учащиеся глубже осознают общность и особенности живых и неживых макротел, универсальность многих физико-химических законов и теорий. У них развивается диалектический метод мышления [9, 18, 21].

Комплексный подход к отбору учебного материала для реализации межпредметных связей включает:

Анализ учебного материала курса химии с целью выявления вопросов, для многоаспектного освещения которых необходимо привлечь межпредметный материал.

Анализ и отбор материала смежных дисциплин, связи с которыми учитель предполагает реализовать в учебном процессе.

Дозирование межпредметного материала, включаемого в содержание урока и прогнозирование предполагаемых результатов межпредметного синтеза.

В курсе химии 8 класса преобладают предшествующие и сопутствующие связи, а в курсе химии 9 класса - сопутствующие и перспективные. В связи с этим цели реализации межпредметных связей различны. Если в 8 классе важнейшая цель - формирование у учащихся прочной понятийно-теоретической базы, на основе которой будет строиться дальнейшее изучение курса, то в 9 классе - формирование системных знаний по предмету, многоаспектное освещение изучаемого материала и расширение научного кругозора учащихся.

С учетом этого авторы [23] предлагают следующие принципы отбора межпредметного материала к уроку:

соответствие межпредметного материала направленности и специфике общеобразовательного учреждения;

соответствие межпредметного материала целям и предметному содержанию обучения;

направленность межпредметных связей на решение целесообразных учебных проблем;

использование разнообразных видов межпредметных связей при лидирующем значении предшествующих и сопутствующих связей в 8 классе и сопутствующих и перспективных в 9 классе [23].

4.3 Методические рекомендации по реализации принципов межпредметных связей при изучении тем, связанных с понятием «ферментные препараты»

Впервые в курсе химии понятие о ферментах как о веществах, ускоряющих химические реакции, может быть представлено при изучении темы: «Скорость химической реакции. Факторы, влияющие на скорость химической реакции», а более полно при изучении темы «Катализ». (9 класс в школах с углубленным изучением химии).

Тема урока: «КАТАЛИЗ». (9 класс).

Методические рекомендации.

1.В начале урока проводят беседу с учащимися, в ходе которой закрепляются их знания по пройденному материалу:

-Что такое скорость химической реакции? Приведите примеры реакций протекающих мгновенно, медленно, очень замедленно.

-Назовите условия, которые влияют на скорость химической реакции.

-Что такое катализатор? Какие из изученных вами реакций протекали в присутствии катализатора?

2.Учитель демонстрирует опыт окисления оксида серы (IV) в присутствии оксида железа (III). В ходе проведения опыта обсуждают ускоряющую роль катализатора в этой реакции. Учитель разъясняет, в чем состоит сущность течения каталитических реакций, сущность катализатора. Подчеркивают, что катализаторы обладают способностью образовывать с реагирующими веществами очень активные промежуточные соединения с малой продолжительностью существования (использует схему). Далее отмечают, что действие катализаторов строго специфично, при этом важно соблюдать их химическую чистоту.

3.Каталитические процессы широко распространены в жизни животных организмов. Учащиеся отвечают на вопросы:

-Приведите примеры катализаторов в живой природе.

-Как обычно биологи называют эти вещества?

Остановимся на самой главной функции белков - ферментативной. Все ферменты содержат в своем составе белки, поэтому биохимические реакции находятся под контролем белков. Термин «фермент» с латинского языка переводится как «закваска».

Затем следует сравнить ферменты и прочие катализаторы. Обращают внимание на то, что обычные катализаторы - вещества небелковой, а ферменты - вещества белковой природы; один катализатор может изменить скорость нескольких реакций, а фермент ускоряет только одну реакцию; ферменты эффективно работают при температуре человеческого тела, а при высокой температуре и давлении разрушаются; ферменты в клетках располагаются не случайно, а в определенном порядке и их действие контролируют гуморальная и нервная системы.

Учащиеся по группам выполняют лабораторную работу «Действие желудочного сока на белки». Каждая группа исследует одно из условий. Итоги работы обсуждаются и заносятся в таблицу.

Условия действия желудочного сока на белки.

Условия опыта.	Наблюдения.	Выводы.
Белок и желудочный сок при температуре 400С. Крахмал и желудочный сок при температуре 400С. Белок и желудочный сок при 00С. Белок и кипяченый желудочный сок. Белок и желудочный сок с добавлением щелочи.	Взвесь растворяется. Взвесь остаётся. Взвесь остаётся. Взвесь остаётся. Взвесь остаётся.	Фермент работает при температуре тела. Фермент действует только на определенный субстрат - белок. Фермент снижает активность при понижении температуры. Фермент является белком, а белки при кипячении свертываются. Фермент работает только при определенной кислотности среды.

Затем, из курса анатомии вспоминают, какие ферменты присутствуют в пищеварительных соках организма человека и какие питательные вещества они расщепляют (используют схему) [18].

Тема урока: «БЕЛКИ». (11 класс).

В начале занятия целесообразно поставить вопрос: Почему многие люди отождествляют понятие «белок» с понятием «жизнь»?

Раскрытие содержания урока пойдет в следующем порядке (схема):

1.Строение и состав белков. Внимание учащихся обращается на формулы некоторых белков: пенициллин - C₁₆H₁₈O₄N₈, молоко - C₁₈₄₆H₃₀₂₁O₅₇₆N₄₆₈S₂₁, гемоглобин - C₃₀₂₂H₄₈₁₆O₈₇₂N₇₈₀S₈Fe₄.

Формируется вывод о сложности белков, о важнейшем значении их для жизнедеятельности всего живого на Земле.

Далее учитель рассказывает об аминокислотах, их классификации и значении.

2.Структура белков (уровень организации белковой молекулы): первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура.

3.Классификация белков по структуре и функциям:

а) по структуре: - простые и сложные белки

-глобулярные и фибриллярные белки

б) по функциям белков.

Самой главной функцией белков является ферментативная. Учение о ферментах выделяют в самостоятельную науку - энзимологию. Далее учитель дает классификацию ферментов. Затем более подробно останавливается на механизме действия ферментов. Весь процесс действия фермента можно разделить на три стадии:

1) распознавание ферментом (E) субстрата (S) и связывание с ним;

2) образование активного комплекса (ES);

3) отделение продукта (P), образовавшегося в ходе ферментативной реакции.

Схема каталитической реакции:

E+S ES E+P

4.Физико-химические свойства белка. Рассматриваются свойства денатурации и ренатурации; факторы, способные вызывать денатурацию (физические и химические).

5.Химия питания. Здоровый образ жизни - прежде всего сбалансированное питание. Учитель предлагает ознакомиться с веществами, входящими в состав пищевых продуктов.

Задание: «О чем расскажет упаковка». Ребятам предлагается по желанию отобрать несколько упаковок из-под пищевых продуктов, которые наиболее часто употребляются в пищу и которые являются любимыми лакомствами. Они должны определить:

1)какие основные биохимические компоненты входят в состав продукта и в каком количестве;

2)какие компоненты продукта в нем являются источниками белков, жиров и углеводов.

Основной полезный компонент пищи - белки.

1.Биологическая ценность белка. Задание: Определить биологическую полноценность белка различных пищевых продуктов и лимитирующих аминокислот (используя таблицу об аминокислотном составе некоторых пищевых продуктов).

2.Потребность человека в белках и аминокислотах.

3.Основная белковосодержащая пища. Совместимость белкового питания. Учитывая аминокислотный состав (аминокислотный скор) различных продуктов питания, подобрать их комбинацию, наиболее соответствующую потребностям нашего организма в незаменимых аминокислотах (использовать таблицы об аминокислотном составе пищевых продуктов).

Далее ребятам предлагается тест, рассчитанный на два уровня знаний (первый уровень рассчитан на «4» балла, а второй уровень - на «5» баллов) [29].

Первый уровень.	Второй уровень.
Какова роль ферментов в организме? Как образованы названия групп ферментов? Какие функциональные группы входят в состав аминокислот, какие свойства они определяют? Что такое первичная структура белка? то представляет собой вторичная структура белка? Что такое третичная структура белка? 7. Опыт: К раствору белка добавьте хлорид натрия. Пронаблюдайте и объясните изменения. Добавьте воды до растворения белка. Сделайте вывод. 8. Известно, что при продолжительности жизни 70 лет, Обновление белков в организме происходит в среднем 200 раз. Предположите, сколько раз произошло обновление белков в вашем организме. 9. Задача: Известно, что для взрослого человека необходимо 1,5 г белка на 1 кг массы тела в день. Зная свою массу, определите суточную норму потребления белка для своего организма.	Предположите, каковы функции каждой группы ферментов. Приведите примеры известных вам ферментов, назовите их функции. По аналогии с примером на доске, напишите уравнение реакции получения трипептида из дипептида (используйте формулу цистеина или серина). Назовите полученный трипептид. Могут ли измениться свойства белка при нарушении последовательности аминокислотных звеньев в линейной полимерной цепи? Чем отличается первичная структура белка от вторичной? Чем отличается третичная структура от первичной и вторичной? Опыт: К раствору белка добавьте концентрированный раствор сульфата меди (II) или другой соли тяжелого металла. Пронаблюдайте и объясните изменения. Добавьте воды, объясните явление. В чем заключается сущность гидролиза? 9. Предположите, можно ли пищевые белки заменить другими компонентами рациона (например, жирами и углеводами), чтобы обеспечить важнейшие процессы в организме?

Подводя итог урока, учитель повторяет, что понятия «жизнь» и «белок» неразрывно связаны. Чтобы ответить на вопрос, что такое жизнь, надо знать, что такое белки. Насколько многообразны белки, настолько сложна и многолика сама жизнь [15, 23,29].

ВЫВОДЫ

Для осаждения препарата протеиназы целесообразно применять этанол или изопропанол.

Компонентный состав препарата представлен четырьмя фракциями, две из которых протеолитические.

Выяснены температурные оптимумы протеолитических ферментов - для протеиназы I - 60, а для протеиназы II - 40⁰С.

Протеиназа I обладает коллагенолитическим действием.

Протеиназа I является достаточно термостабильной, инактивируется при 60⁰С в течение 60 часов.

Протеиназа I обладает специфичностью к белкам животного происхождения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Антипова Л.В., Глотова И.А., Кочергина Н.И. Микробные ферментные препараты для обработки вторичного сырья мясной промышленности. // Конференция «Биосинтез ферментов микроорганизмами»: Тез. докл., Москва, 26 - 27 октября 1993г - Москва, 1993. - С.33.

Антипова Л.В., Глотова И.А., Кочергина Н.И., Чурсин В.И., Макарова Е.Г. Разработка и использование специальных микробных препаратов для обработки кожевенного сырья. // Кожевенно-обувная промышленность. - 1994. - № 5 - 8. - С.25 - 27.

Антипова Л.В., Кочергина Н.И. Специальные микробные препараты ферментов в рациональном использовании вторичного мясного сырья. // Всесоюз. науч.-техн. конф. «Совершенствование технологических процессов производства новых видов пищевых продуктов и добавок. Использование вторичного сырья пищевых ресурсов». - Киев, 1991. - Ч.1. - С.222.

Антипова Л.В., Насонова Л.В. Исследование возможности получения белкового концентрата из кератинсодержащего сырья методом микробной ферментации. // Тез. докл. 2 науч.-практ. конф. «Разработка и внедрение безотходных технологий, использование вторичных ресурсов», Киров, 30 - 31 мая 1989г. - Киров, 1989. - С.80 - 81.

Антипова Л.В., Глотова И.А. Основы рационального использования вторичного коллагенсодержащего сырья мясной промышленности. - Воронеж. - 1997. - С.246.

Василевская И.А. Актиномицеты - продуценты биологически активных веществ. - Киев:Высшая школа. - 1979. - С.43.

Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. - М.: Агропромиздат. - 1987. - С.391.

Детерман Г. Гель-хроматография. - М.: Мир. - 1970. - С.352.

Зверев И.Д., Максимова В.Н. Межпредметные связи в современной школе. - М.: Педагогика. - 1981. - С.96.

Иванов К.А., Шанушкова Л.П.,Нарыжная Т.В. Использование шквары для пищевых целей. // Мясная индустрия СССР. - 1982. - № 11. - С.11 - 15.

Извекова Г.И. Протеолитические свойства гриба Em. glabra. // Микробиология. - 1985. - т.54. - С.62 - 65.

Каверзиева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеиназ. // Приклад. биохимия и микробиология. - 1971. - т.7. № 2. - С.225 - 228.

Калунянц К.А., Дорохов В.В., Лосякова Л.С., Величко Б.А. Направленный биосинтез ферментов микроорганизмами. // Труды ВНИИсинтезбелок. М.: 1974. - В.2. - С.220.

Караваева Н.Н., Садыкходжаева Н.Г. Получение высокоустойчивого препарата протеолитических ферментов гриба Torula thermophila шт.Уз. ПТ при культивировании в ферментере. // Приклад. биохимия и микробиология. - 1985. - Т.XXI. - № 1. - С.24 - 27.

Колычева З.И. Химия и питание. // Химия в школе. - 1997. - № 4. - С.86 - 88.

Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. - М.: Высшая школа. - 1980. - С.272.

Крестьянова И.Н., Васильева Л.И., Бартошевич Ю.Э., Ахпаров В.Л., Нахапетян Л.А. Изоэлектрическое фокусирование препарата протеолитических ферментов из Streptomyces 771. // Приклад. биохимия и микробиология. - 1983. - Т.XIX. - № 2. - С.217 - 225.

Крылова Н.В. Интеграция как важная составляющая учебного процесса. // Химия в школе. - 1997. - № 1. - С.21 - 26.

Кулагин П.Г. Межпредметные связи в процессе обучения. - М.: Просвещение. - 1981. - С.96.

Кавренова Г.И., Руденская Т.Н. Афинная хроматография протеиназ. // Химия протеолитических ферментов. Материалы 2 Всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов. - Углич. - 1979. - С.134.

Максимова В.Н. Межпредметные связи в учебно-воспитательном процессе в современной школе. - М.: Просвещение. - 1987. - С.160.

Межпредметные связи в учебном процессе. - М.: Просвещение. - 1974. - С.

Назаренко В.М. Что нужно знать о продуктах, которые мы употребляем в пищу. // Химия в школе. - 1997. - № 5. - С.16 - 25.

Насонова Л.В. Биотехнология получения протеиназы актиномицета Streptomyces chromogtnis. // Афтореф. дисс. канд. техн. наук. - Воронеж. - 1988. - С.24.

Осуществление межпредметных связей в процессе обучения. - Владимир. - 1984. - С.136.

Расулундзатуву М.З. Биосинтез и исследование протеолитического комплекса Streptomyces fulvoviricus ВКМАс - 161. // Автор. дисс. канд. техн. наук. - Воронеж. - 1989. - С.21.

Рожанская Т.И., Морголина Н.А., Андреева Т.В. Использование ультрафильтрации в процессах очистки протеолитических ферментов. // Материалы 2 Всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов. - Углич. - 1979. - С.134.

Фрашель Б., Шишкова Э.А. Свойства протеолитических ферментов, содержащихся в культуральной жидкости Actinomyces rimous. // Приклад. биохимия и микробиология. - 1968. - № 6. - С.627 - 631.

Шаталов М.А. Межпредметные связи в формировании системных знаний. // Химия в школе. - 1997. - № 5. - С.26 - 29.

Aussein M., Magdel-Din, Abdel-Gawald E.M. Protease and amylase activities of Asp. flawis grown on hudrocarbons and oxygenated hydrocarbous // Biotechnol. And Bioeng. - 1983. - v.25. - Nr.12. - p.3197 - 3199.

Knud Aunstrup - Proteinases // Novo Research Institute, Bagsvaerd, Denmark, - 1979. - p.114.

Odibo F.I., Obi S.K. Purification and some properties of a thermostable protease of Jherm. Thal // j. Appl. Microbiol. And Biothehnol. - 1988. - v.3. - p.327 -332.