Культивирование, титрование и очистка тогавирусов

2. Белки. В качестве радиоактивной метки для белков чаще всего используют -метионин, поскольку он обладает высокой удельной радиоактивностью и относительно недорого стоит. Чтобы пометить белки тогавирусов, метионин используют в концентрации 5--50 мкКи/мл. Для мечения белков, не содержащих метионина, используют -цистеин, удельная активность которого такая же, как -метионина. Можно также использовать смесь -аминокислот. Обычно меченые аминокислоты используют в сочетании со средой, не содержащей данных аминокислот; такие среды имеются в продаже. Более удобный альтернативный подход состоит в том, что кратковременное мечение проводят в буферном растворе, например в растворе Хэнкса, содержащем 20 мМ HEPES в качестве буфера, 2% диализованной сыворотки крупного рогатого скота или 0,1% БСА.

3. Гликопротеины. Углеводные остатки гликопротеинов обычно метят, добавляя в среду -сахара. Чаще всего используют -маннозу и -глюкозамин в концентрациях 50--100 мкКи/мл. Иногда уровень включения удается повысить, используя среду с небольшим содержанием глюкозы или другого сахара в качестве источника энергии.

3.2 Концентрирование вирусов

Первый этап, необходимый для очистки вирусов, во всяком случае при их выделении из культуральной жидкости, -- это концентрирование. Поскольку вирусные частицы имеют несколько большие размеры по сравнению с другими компонентами культуральной жидкости, концентрирование приводит н к очистке вируса от низкомолекулярных контаминантов, например от любых соединений, используемых в качестве радиоактивной метки.

3.2.1 Удаление клеточного дебриса

Культуральная жидкость, собранная с зараженных клеток, кроме вируса может содержать значительное количество клеточного дебриса, образованного погибшими клетками и субклеточными частицами. Лучший способ удаления дебриса -- центрифугирование при высокой скорости с охлаждением. Для работы с большими объемами культуральной жидкости необходим достаточно вместительный ротор. Следует использовать пробирки с плотно закрывающимися крышками, а при работе с патогенными вирусами заполнять пробирки с таким расчетом, чтобы даже при поломке крышки жидкость не вылилась из пробирки. Обычно соответствующее значение объема приведено в инструкции по использованию центрифуги. После центрифугирования супернатант, содержащий вирус, осторожно переливают в подходящий сосуд, помещенный в ледяную баню; в пробирке при этом остается небольшой плотный осадок.

3.2.2 Осаждение вируса ультрацентрифугированием

Из относительно небольшого объема культуральной жидкости вирус можно сконцентрировать ультрацентрифугированием. Обычно тогавирусы осаждают центрифугированием при 50 000 g в течение 2 ч. Можно использовать как угловые роторы, так и бакет-роторы в зависимости от объема материала и имеющегося оборудования. Пробирки для угловых роторов следует тщательно закрывать, лучше всего термическим способом, предложенным фирмой Beckman.

Определенной степени очистки на этой стадии можно достигнуть, наслаивая содержащую вирус жидкость на небольшой объем буферного раствора, содержащего 20% сахарозы. При этом вирус проходит через сахарозную «подушку» и образует осадок, а низкомолекулярные контаминанты, включая растворимые белки, задерживаются «подушкой». Подходящим буфером является GTNE. Соответствующий объем раствора сахарозы в этом буфере вносят в каждую пробирку. При работе с угловыми роторами следует убедиться в том, что используемый объем достаточен, чтобы полностью покрыть осадок, даже после остановки ротора. На слой сахарозы осторожно наслаивают содержащую вирус жидкость; она должна медленно стекать по стенке пробирки. Чтобы избежать перемешивания при разгоне ротора, следует использовать приспособление для медленного разгона, если оно имеется, однако это не является строго необходимым.

В данных условиях вирус образует плотный осадок. Супер-натант декантируют и остаток жидкости удаляют, оставляя пробирку в перевернутом положении. Необходимо помнить, что супернатант содержит некоторое остаточное количество инфекционного вируса, и обращаться с ним следует осторожно. Осадок вируса медленно суспендируют в GTNE; для этого раствор приливают к осадку и оставляют на ночь при 4°С или обрабатывают в течение нескольких минут ультразвуком, помещая пробирку в водяную баню.

3.2.3 Осаждение вирусов полиэтиленгликолем

Вместо непосредственного ультрацентрифугирования вирус можно осадить центрифугированием при меньшей скорости после добавления ПЭГ. Преципитация обычно ускоряется при добавлении NaCl вместе с ПЭГ. Этот метод в общем более удобен при работе с большими объемами содержащей вирус жидкости, так как вместительные роторы для относительно низкоскоростного центрифугирования намного более доступны для большинства лабораторий, чем такие же роторы для ультрацентрифугирования. Кроме того, этот метод более мягкий и обычно приводит к меньшим потерям инфекционности, чем непосредственное ультрацентрифугирование. Описанная ниже методика пригодна для концентрирования некоторых тогавирусов, причем используемые концентрации NaCl и ПЭГ, по-видимому, не имеют принципиального значения, однако в конкретных случаях для оптимизации выхода вируса могут потребоваться отдельные модификации.

Определяют объем содержащей вирус жидкости и помещают ее в ледяную баню, расположенную на магнитной мешалке. При постоянном перемешивании медленно добавляют сухой NaCl до концентрации 0,5 М и ПЭГ 6000 до концентрации 7%. Суспензию продолжают осторожно перемешивать 20--30 мин до полного растворения ПЭГ и оставляют на 2 ч при 4°С для формирования агрегатов вируса. Затем суспензию центрифугируют 30 мин при 10 000 g. Осадок обычно распределен по стенке пробирки, поэтому супернатант следует сливать осторожно, держа пробирку так, чтобы осадок был расположен на верхней стороне. Остаток супернатанта, насколько возможно полно, удаляют с помощью пипетки и осадок ресуспендируют в небольшом объеме GTNE. Обычно осадок легко растворяется, если смыть его со стенки пробирки, а затем энергично пипетировать суспензию или пропустить через шприц с толстой иглой. Материал, который при этом не растворяется, удаляют центрифугированием в течение 5 мин при 10000 g.

3.3 Очистка вирусов градиентным центрифугированием

Материал, полученный одним из описанных выше методов, обычно контаминирован клеточными компонентами. Однако в тех случаях, когда высокая степень очистки не обязательна, его можно использовать уже на этой стадии. Тем не менее, для большинства исследований необходима дальнейшая очистка вируса с помощью зонально-скоростного или изопикнического центрифугирования в градиенте. При скоростном центрифугировании положение вируса в градиенте определяется его коэффициентом седиментации, а при изопикническом -- плавучей плотностью. Для достижения максимальной степени очистки вирусных частиц от примесей изменение концентрации образующего градиент вещества должно быть плавным; в то же время на промежуточных стадиях очистки нередко используют ступенчатые градиенты. В некоторых случаях принципы скоростного и изопикнического центрифугирования совмещаются; примером может служить использование градиентов глицерина -- тартрата калия. В таких градиентах концентрация тартрата калия возрастает в направлении дна пробирки, достигая плотности, соответствующей плавучей плотности вируса; концентрация глицерина, наоборот, максимальна на мениске, что препятствует продвижению медленно седиментирующего материала в направлении дна. Все типы градиентов обычно центрифугируют в бакет-роторах, но в случае изопикнических градиентов такие же или даже лучшие результаты можно получить в угловых или вертикальных роторах с помощью приспособлений для медленного разгона и остановки, обеспечивающих переориентацию градиента без перемешивания. При очистке конкретного вируса часто приходится проводить целую серию последовательных стадий центрифугирования в разных типах градиентов, чтобы добиться нужной степени очистки.

3.3.1 Ступенчатые градиенты концентрации сахарозы

Минимальную концентрацию сахарозы подбирают таким образом, чтобы плотность соответствующего раствора была выше плавучей плотности вируса; при этом вирус проходит через верхний слой раствора сахарозы, обгоняя медленно седименти-рующие частицы, и образует узкую зону на границе слоев с различной концентрацией сахарозы. При работе с тогавиру-сами в качестве верхнего и нижнего слоев используют соответственно 20%-ный и 50%-ный растворы сахарозы в GTNE. В центрифужную пробирку вносят около 1/10 объема 50%-ного раствора сахарозы и осторожно наслаивают сверху около 3/10 объема 20%-ного раствора. Чтобы избежать перемешивания, пробирку следует держать в наклонном положении, а верхний раствор наносить медленно по стенке пробирки. На полученный ступенчатый градиент осторожно наслаивают раствор частично очищенного вируса. Градиенты центрифугируют 2--3 ч при 80 000--100 000 g и 4°С. После центрифугирования из градиента извлекают зону вируса, образующуюся на границе между слоями сахарозы.

3.3.2 Зональное центрифугирование в градиентах концентрации

сахарозы

Зональное центрифугирование лучше всего проводить в бакет-роторах или вертикальных роторах, чтобы избежать нежелательного взаимодействия материала со стенками пробирки. Линейные градиенты сахарозы готовят одним из стандартных методов и сверху осторожно наслаивают раствор вируса. Поскольку при использовании данного метода отсутствует эффект концентрирования в результате образования зоны с соответствующей плавучей плотностью, объем образца не должен превышать 1/10 объема градиента. Центрифугирование следует проводить при 4°С. Время и скорость центрифугирования во многом зависят от геометрии используемого ротора, поэтому можно дать лишь самые приблизительные указания относительно режима. Первоначально используемый режим центрифугирования обычно приходится модифицировать после первых опытов с учетом полученных результатов. В бакет-роторе, например SW27, центрифугирование в течение 2 ч при 27 000 об/мин позволяет получить достаточную степень очистки большинства тогавирусов.

3.3.3 Изопикническое центрифугирование и центрифугирование в

комбинированных зонально-плотностных градиентах

Для изопикнического центрифугирования большинства тогавирусов подходят 20--50%-ные непрерывные линейные градиенты концентрации сахарозы. В комбинированных градиентах глицерина -- тартрата калия верхнюю часть образует 30%-ный раствор глицерина в 50 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, а нижнюю --50%-ный раствор тартрата калия. рН раствора тартрата калия не должен быть ниже 8,5, так как при более кислых значениях образуется осадок. Из этих растворов обычными способами готовят линейные градиенты. Поскольку в таких градиентах вирус концентрируется в зоне с соответствующим значением плавучей плотности, объем вирусной суспензии, наслаиваемой на градиент, не имеет принципиального значения; он может доходить до 'Д объема градиента. Градиенты центрифугируют в течение ночи при 80 000-- 100000 g.

3.3.4 Обнаружение вирусов в градиентах и фракционирование

1. Фракционирование градиентов. Если очистке подвергают достаточно большое количество материала, то зону вируса в изопикническом градиенте можно идентифицировать визуально как голубовато-белый опалесцирующий слой. Чтобы зона была видна лучше, пробирку, расположенную на темном фоне, освещают лучом света. Если при этом вирус удается четко идентифицировать, его можно извлечь из градиента, прокалывая пробирку сбоку. Если пробирка была закрыта термическим способом, сверху проделывают небольшое отверстие для обеспечения доступа воздуха. Пробирку прокалывают сбоку непосредственно под зоной вируса иглой для подкожных инъекций, надетой на шприц объемом 5--10 мл; просвет иглы должен быть обращен вверх. Из пробирки медленно удаляют раствор до тех пор, пока не будет извлечена большая часть вируса. Если в градиенте видно несколько зон, то их извлекают по отдельности, начиная с верхней, и идентифицируют вирусную зону с помощью специфического теста. Однако при работе с патогенными вирусами прокалывание пробирки сбоку представляет слишком большую опасность, и зоны следует отбирать с помощью длинной загнутой иглы, которая вводится в градиент сверху.

В тех случаях, когда визуально идентифицировать вирусную зону не удается, приходится фракционировать весь градиент. Это делается одним из двух способов. В первом случае дно пробирки смазывают силиконовой смазкой, осторожно прокалывают толстой иглой, чтобы не ввести пузыри воздуха, которые могут нарушить градиент; после этого градиент раскапывают на фракции равного объема, подсчитывая вытекающие капли. Во втором случае в верхнюю часть пробирки осторожно, чтобы не повредить градиент, вводят тонкий шланг, присоединенный к перистальтическому насосу, и с помощью коллектора медленно собирают фракции.

2. Локализация вируса во фракциях градиента. Методы, используемые для идентификации содержащих вирус фракций градиента, можно разделить на две группы: а) основанные на специфических свойствах вируса, например инфекционности или гемагглютинации, и б) неспецифические методы, например определение поглощения в ультрафиолете или радиоактивности. Разрабатывая схему очистки ВИ' руса, следует иметь в виду, что для локализации нужных фракций лучше использовать специфический метод, но, однако, в дальнейшем при стандартной работе можно ограничиться неспецифическим методом. Методы определения инфекционно-сти и гемагглютинации описаны выше; их можно без всяких изменений применять к очищенным препаратам вирусов. При необходимости измеряют поглощение неразведенных фракций градиентов при длине волны 260 или 280 нм. Для локализации радиоактивно меченного вируса небольшие аликвоты из каждой фракции наносят на пронумерованные квадраты бумаги Whatman ЗММ со стороной 1 см. Все квадраты промывают в одном и том же сосуде тремя сменами 5%-ной трихлоруксусной кислоты, затем двумя сменами этанола и высушивают на воздухе. Далее квадраты помещают в сцинтилля-тор и определяют радиоактивность при помощи сцинтилляци-онного счетчика. Использование этого метода позволяет отмыть остаток невключившейся метки и избежать трудностей, связанных с тушением флуоресценции содержащимися в градиенте примесями.

3. Получение вирусов из фракций градиентов. На последней стадии очистки необходимо удалить вещество, образующее градиент. На промежуточных стадиях обычно достаточно развести содержащие вирус фракции равным объемом буферного раствора, чтобы материал можно было непосредственно наносить на следующий изопикнический градиент. Поскольку для зонального центрифугирования объем образца должен быть небольшим, разведение фракций предыдущего градиента в этом случае, как правило, невозможно; поэтому предпочтительно проводить зональное центрифугирование перед изопикническим, если используемая схема очистки включает оба варианта центрифугирования. Полного удаления вещества, образующего градиент, достигают диализом, гель-фильтрацией через колонку с сефадексом G-50 или разведением с последующим ультрацентрифугированием. Диализ очищенного материала проводят в нескольких сменах подходящего буферного раствора. Колонку с сефадексом уравновешивают, пропуская через нее пятикратный по отношению к образцу объем того буферного раствора, в котором должен быть растворен очищенный вирус. Появление вируса в свободном объеме колонки при элюции регистрируют по поглощению в ультрафиолете или по радиоактивности; содержащие вирус фракции объединяют. Дополнительным преимуществом ультрацентрифугирования является достигаемое при этом концентрирование вируса. Объединенные фракции градиента разводят буферным раствором по крайней мере вдвое для уменьшения плотности и центрифугируют 2,5 ч при 80 000--100 000 g и 4°С. Супернатант удаляют по возможности полностью; образующийся осадок вируса должен быть бесцветным и прозрачным. Его ресуспендируют в УЗ-дезинтеграторе; при этом образуется голубовато-белая опалесцирующая суспензия, которую хранят при --70°С.

3.3.5 Определение степени чистоты

Лучший метод, позволяющий определить степень чистоты препаратов тогавирусов, -- это электрофорез структурных белков в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na. Исследованные до сих пор альфа- и флавивирусы имеют небольшое число структурных белков характерного размера, образующих при электрофорезе в геле уникальный набор. Вирионы альфа-вирусов содержат нуклеокапсидный белок с мол. массой 30-- 35 кД и 2 более крупных гликопротеина оболочки с мол. массами 45--55 кД. Вирионы флавивирусов содержат белок оболочки, обычно гликозилированный, с мол. массой 50--55<кД и 2 более мелких внутренних структурных белка с мол. массами 15 и 7 кД.

Удобно использовать систему диск-электрофореза Лэммли. Гели в виде пластин обладают преимуществами по сравнению с трубчатыми гелями, поскольку в пластине можно параллельно анализировать несколько образцов, что дает возможность с высокой точностью сравнивать степени очистки на разных стадиях. Для анализа белков альфавирусов подходит 10%-ный разделяющий гель; в то же время эффективное разделение вирионных белков флавивирусов достигается в 8--20%-ном градиентном геле. В исследуемом образце вирионы разрушают, добавляя 1/5 объема раствора, содержащего 10% ДДС-Na, 5% 2-меркаптоэтанола, 50% глицерина и 0,05% бромфенолового синего. Смесь прогревают 2 мин в кипящей водяной бане, охлаждают и наносят на гель; в качестве контроля используют стандартный набор белков с известными мол. массами. Когда бромфеноловый синий дойдет до конца геля, электрофорез прекращают и гель окрашивают, инкубируя его 2 ч при постоянном перемешивании в растворе, содержащем 1% кумасси синего, 25% изопропанола и 10% уксусной кислоты;

после этого в течение ночи отмывают избыток красителя раствором, содержащим 10% изопропанола и 10% уксусной кислоты. При анализе радиоактивно меченных вирусных белков гель высушивают и проводят авторадиографию.

Общие выводы

Выделение и культивирование тогавирусов не представляет принципиальных трудностей благодаря значительному разнообразию возможных экспериментальных систем. Для молекуляр-но-биологических исследований, как правило, необходим вирус в очень высоком титре. В случае альфавирусов подобные титры можно получить на культуре клеток. С другой стороны, многие флавивирусы дают в культуре более низкие титры, и это может потребовать соответствующей модификации условий эксперимента. Например, относительно высокой множественности инфекции достигают, выращивая клетки в виде монослоя на поверхности небольших культуральных сосудов.

Флавивирусы сравнительно мало изучены и открывают для исследователей особенно широкое поле деятельности, поскольку многие из них представляют опасность для человека и, кроме того, данный род состоит из огромного количества видов. Применяемые для флавивирусов методы очистки сходны с используемыми для других вирусов. Однако и здесь имеются большие возможности для создания новых, более эффективных методов, которые позволили бы идентифицировать неструктурные белки и детально изучить механизмы репродукции.

Многие из описанных здесь методов титрования исходно создавались для диагностических целей; тем не менее, они вполне применимы и для исследования антигенного родства между вирусами или механизмов репродукции. Титры инфекционное™ одного и того же вируса, определенные разными методами, как правило, неодинаковы. Обычно максимальный титр получают при внутримозговом заражении новорожденных мышат, однако материал из мозга животных иногда невозможно использовать без дополнительной многостадийной очистки.

Еще одна до сих пор нерешенная проблема заключается в вариабельности вируса при серийном пассировании в одном и том же хозяине или при смене хозяина. Известно, что многие тогавирусы в клетках комаров дают персистентную инфекцию, в то время как в клетках млекопитающих персистенция может и не наблюдаться. Вирус, образующийся при таких персистентных инфекциях, часто имеет сниженную вирулентность для мышей и для человека. Возможность подобных изменений нужно иметь в виду, например, при получении гемагглютинина из длительно культивируемых зараженных клеток.

Наконец, не подлежит сомнению, что культуры клеток комаров, как правило, высокочувствительны к природным изолятам вирусов, что является их преимуществом; однако во многих случаях заражение культур клеток млекопитающих дает столь же хорошие результаты, причем в большинстве лабораторий работать с этими клетками проще.

Приложение

1. Среды для культур тканей

В составе всех сред указана эмбриональная телячья сыворотка; однако она вполне заменима сывороткой новорожденных телят. Можно снизить концентрацию сыворотки в среде до 5%; это не влияет на рост клеток. Кроме того, триптозо-фосфатный бульон используется не во всех лабораториях. Поэтому лучше всего подобрать конкретные условия роста нужной линии клеток.

1. Среда Игла --80 мл ЭТС -- 10 мл

ТФБ -- 10 мл Пенициллин-- 100 ед./мл Стрептомицин -- 100 мкг/мл

Бикарбонат натрия -- 0,275%

На данной среде растут все культуры клеток млекопитающих, однако для этого необходим СОг-инкубатор.

2. Среда Лейбовича L-15 -- 80 мл ЭТС -- 10 мл

ТФБ -- 10 мл

Пенициллин-- 100 ед./мл

Стрептомицин -- 100 мкг/мл На данной среде также растут все упомянутые в тексте культуры, однако некоторые из них могут потребовать специальной адаптации. С02-инкубатор в данном случае не нужен. рН среды доводится НС1 перед стерилизацией фильтрованием.

3. RPMI-1640 --80 мл ЭТС -- 10 мл, ТФБ -- 10 мл

Бикарбонат натрия -- 0,1%

Пенициллин-- 100 ед./мл

Стрептомицин-- 100 мкг/мл Среда содержит в качестве буфера HEPES, поэтому С02-инкубатор для культивирования клеток не нужен. Эта среда подходит для выращивания клеток линии С6/36 при 28--33 °С.

4. Среда MM/VP 12 --85 мл

ЭТС -- 15 мл

Пенициллин-- 100 ед./мл

Стрептомицин -- 100 мкг/мл На этой среде клетки могут расти в отсутствие СОг. На этой среде особенно хорошо растут клетки комара Aedes pseudos-cutellaris линии АР61 при 28 °С. Состав этой среды описан Вар-ма и Пудни.

2. Среды для поддержания культур клеток

1. Во всех средах, используемых для поддержания культур, кроме MM/VP12, концентрацию сыворотки снижают до 1--2%. В случае клеток АР61 вместо MM/VP 12 используют среду Лей-бовича L-15, содержащую 2% ЭТС.

2. Среда для покрытия, содержащая карбоксиметилцеллю-лозу

Среда Лейбовича L-15 --44 мл КМЦ --44 мл ТФБ -- 10 мл ЭТС -- 2 мл

Пенициллин -- 100 ед./мл

Стрептомицин-- 100 мкг/мл 3%-ную КМЦ готовят, добавляя 3 г КМЦ к 100 мл дистиллированной воды. Суспензию перемешивают в течение ночи при 56 °С до растворения КМЦ, после чего раствор делят на порции по 44 мл, автоклавируют 10 мин при 1 атм и хранят при 4°С.

3. Среда для покрытия, содержащая агарозу Агароза') -- 10 г

Дистиллированная вода -- 100 мл Для приготовления среды с агарозой суспензию помещают в кипящую водяную баню, до того как агароза расплавится. Затем раствор автоклавируют 10 мин при 1 атм, охлаждают до 42--44 °С и добавляют 10 мл данного раствора к 90 мл среды для поддержания культур, нагретой до 44 °С.

3. Растворитель для природного материала

Солевой раствор Хэнкса -- 75 мл ЭТС -- 25 мл Пенициллин -- 500 ед./мл Стрептомицин -- 500 мкг/мл

*) Существует несколько разных типов агарозы, и большинство из них подходит для приготовления данной среды. Тем не менее полезно проверить тот или иной тип, прежде чем заказывать его в больших количествах.

4. Приготовление суспензии природного материала

Образец ткани помещают, в бутылку с 8--10 стеклянными бусинами диаметром 5--6 мм и заливают растворителем. Крышку крепко завинчивают и бутылку интенсивно встряхивают 30 с, предпочтительно с помощью миксера. Препарат центрифугируют, отбирают супернатант, используют его немедленно или хранят при --70 °С.

5. Обработка сывороток, используемых в РТГА

Сыворотку прогревают 30 мин при 56 °С. 0,1 мл сыворотки смешивают с 1,0 мл промытого кислотой каолина. Смесь интенсивно встряхивают 15 мин при комнатной температуре и центрифугируют 10 мин при 200 g. Прозрачный супернатант отбирают и добавляют к плотному осадку эритроциты гуся или цыпленка с таким расчетом, чтобы получить 10%-ную суспензию. Суспензию инкубируют 1 ч при комнатной температуре, ресуспендируя эритроциты каждые 15 мин, и затем центрифугируют 5 мин при 1500 g. Супернатант отбирают, используют немедленно в РТГА или хранят при --20°С.

6. Реактивы и буферные растворы

Краситель нафталиновый черный:

Нафталиновый черный -- 1 г

Ледяная уксусная кислота -- 60 мл

Ацетат натрия -- 13,6 г

Дистиллированная вода -- до 1000 мл Боратный буферный раствор:

Хлористый натрий -- 7,02 г

Борная кислота -- 3,09 г Оба вещества растворяют в небольшом объеме теплой дистиллированной воды и доводят объем до 100 мл. рН доводят до 9,0 концентрированным NaOH, стерилизуют раствор авто-клавированием 10 мин при 1 атм и добавляют 4 г порошка бычьего сывороточного альбумина. Глюкозо-желатиновый буферный раствор:

Веронал -- 0,58 г

Желатин -- 0,60 г

Веронал натрия -- 0,38 г

Хлористый кальций -- 0,02 г

Сульфат магния --0,12 г

Хлористый натрий -- 8,5 г

Глюкоза -- 10,0 г

Дистиллированная вода -- до 1 л Вначале растворяют веронал и желатин примерно в 250 мл воды при 56 °С, затем добавляют остальные реактивы. После стерилизации автоклавированием в течение 10 мин при 1 атм доводят рН до нужного значения. Растворы для доведения рН суспензии эритроцитов:

Раствор А:

Хлористый натрий -- 8,76 г

Двухзамещенный фосфат натрия -- 28,39 г

Дистиллированная вода -- до 1 л

Раствор Б:

Хлористый натрий -- 8,76 г

Однозамещенный фосфат натрия -- 31,20 г Чтобы получить нужное значение рН для постановки реакции гемагглютинации, растворы А и Б смешивают, как указано в приведенной таблице.

Объем раствора в каждом случае доводят до 100 мл добавлением соответствующего количества раствора Б. Фосфатный буферный раствор:

Этот буфер имеется в продаже в виде таблеток; каждую таблетку растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор версена:

PBS -- 100 мл

Версенат натрия -- 0,2 г

Глюкоза -- 0,2 г Следующие растворы стерилизуют фильтрованием:

Раствор трипсина --2 мл

Раствор версена-- 18 мл Трипсин разливают на порции по 2 мл и хранят при --20 °С. Перед употреблением порцию оттаивают, смешивают с версеном, нагревают смесь до 37 °С и используют немедленно. Версен можно в течение длительного времени хранить при 4°С. Смесь трипсин -- версен при 4°С хранить не следует.