Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных

В начальную фазу развития предовуляторного фолликула клетки лучистого венца обладают способностью подавлять хромосомные перестройки в ооците. Этот эффект снимается под действием предовуляторного выброса гипофизом лютеинизирующего гормона, что визуально сопровождается некоторым разжижением клеток кумулюса. При этом под разжижением следует понимать увеличение межклеточного расстояния и уменьшение плотности расположения клеток кумулюса вокруг яйцеклетки. Если же разжижение будет недостаточным, это уменьшит шансы спермиев проникнуть внутрь яйцеклетки.

Разжижение и постепенный отход клеток яйценосного бугорка и лучистого венца происходит под действием фермента гиалуронидазы, который выделяется спермиями и клетками слизистой яйцеводов самки. Считается, что полное освобождение яйцеклетки от клеток кумулюса не является обязательным условием проникновения спермиев в яйцеклетку. Однако, данные показывают, что недостаточная разжиженность клеток кумулюса препятствует формированию в яйцеклетке способности к дальнейшему дроблению.

Яйцеклетки самок сельскохозяйственных животных оплодотворяются одним спермием, в отличие, например, от яйцеклеток тритона, для которых полиспермное оплодотворение является нормальным явлением. Для предотвращения проникновения в яйцеклетку более одного спермия в ней предусмотрено существование механизма кортикальной реакции. Непосредственно под цитоплазматической мембраной яйцеклетки располагаются специальные образования - кортикальные гранулы. При проникновении первого спермия в месте проникновения начинается цепная реакция выделения содержимого гранул в околожелточную среду, изменение химических и физических параметров которой ведет к невозможности проникновения в яйцеклетку дополнительных спермиев. Одновременно с проникновением спермия в яйцеклетке завершается второе мейотическое деление, и она становится гаплоидной.

Некоторое время (5-6 часов) после проникновения спермий остается без видимых изменений. Затем он начинает постепенно набухать, теряет плазматическую мембрану и округляется. Этот этап знаменуется образованием мужского пронуклеуса. К этому времени хромосомный материал яйцеклетки, в свою очередь, формирует женский пронуклеус. Через некоторое время пронуклеусы начинают сближаться и, наконец, сливаются в одно образование, которое изолируется от окружающей цитоплазмы мембраной и образует ядро зиготы. На этом этапе новообразованная клетка восстанавливает диплоидность хромосом, характерную для всех соматических клеток. Именно этот момент можно считать началом формирования нового уникального организма.

Зигота - одноклеточный организм, существование которого ограничено несколькими часами (20-24 у коров и 14-16 у свиней). К концу этого срока в зиготе начинается перестройка внутреннего цитоскелета, что отражается утратой ею идеальной шарообразной формы, и которая завершается дроблением внутриклеточной массы на два почти равные клетки, именуемые бластомерами.

Примерно через двенадцать часов каждый из новообразованных бластомеров делится пополам. Новообразованные четыре бластомера, в свою очередь, приблизительно через такой же промежуток времени дают начало восьми бластомерам и так далее. Первые деления вплоть до восьми-шестнадцати бластомеров проходит практически синхронно, затем эта синхронность нарушается.

Развитие эмбриона до стадии восьми-шестнадцати бластомеров проходит в яйцеводе, после чего зародыш опускается в матку. Маточная среда стимулирует дальнейшее деление эмбриона, тогда как задержавшиеся в яйцеводах эмбрионы часто замирают на ранней стадии (так называемый 8-16-ти клеточный блок развития).

Дальнейшее деление бластомеров ведет к образованию некоторого клеточного скопления, именуемого морулой. Все клетки морулы являются тотипотентными , т.е., в принципе, могут дать начало целому организму. После того, как некоторая часть бластомеров оказывается окруженной со всех сторон соседними клетками, начинается этап компактизации морулы. При этом внешние клетки формируют слой тесно прилегающих друг к другу клеток, который изолирует внутренние клетки от внешней среды. Эти внешние клетки в дальнейшем формируют трофобласт, внутренние - эмбриобласт. Клетки трофобласта начинают делиться в плоскости перпендикулярной поверхности эмбриона, в результате чего площадь трофобласта начинает превышать площадь поверхности внутренних клеток. Эта разница ведет к формированию внутри зародыша полости, заполненной жидкостью и именуемой бластоцелью. С этого момента внутренние клетки, или клетки внутриклеточной массы становятся плюрипотентными, т.к. изолированные они могут дать начало лишь отдельным органам тела. Из клеток внутриклеточной массы в дальнейшем формируются зародыш и зародышевые оболочки, клетки трофобласта дают начало желточному пузырю. До этого момента делящийся эмбрион остается окруженным прозрачной оболочкой (т.н. зоной пеллюцида), защищающей его от внешних воздействий.

В дальнейшем под давление увеличивающегося трофобласта зона пеллюцида лопается и зародыш оказывается в маточной среде. К 10-15 дню (индивидуально для каждого вида животного) бластоциста прикрепляется (имплантируется, иначе, имеет место нидация эмбриона) к слизистой матки. С этого момента начинается эмбриональный период развития, который характеризуется закладкой и формированием провизорских органов, прикреплением зародыша к слизистой матки и дифференцировкой клеток с закладкой и началом функционирования жизненно важных органов. В этот период формируется амниотическая оболочка, а к концу периода - плацента. С момента плацентации (т.е. образования плаценты) зародыша наступает третий период внутриутробного развития - фетальный (плодный). В этот период питание плода осуществляется за счет функционирования плаценты, выполняющей одновременно функции легких, кишечника, печени, почек, эндокринные функции. Фетальный период характеризуется завершением развития морфологии и функции органов и систем организма плода, быстрым нарастанием массы тела.

На всем периоде развития зародыша имеются критические стадии развития, которые часто совпадают с переходом жизнедеятельности зародыша на новый функциональный уровень. Первым таким этапом следует, по-видимому, считать 8-16-ти клеточный блок, преодоление которого связано с передвижением зародыша в полость матки. На этой стадии в зародышах коров и овец происходит активизация собственного генома и нарушение ее тем или иным образом может вести в дальнейшем к формированию неполноценного зародыша или его гибели. Задержка зародыша в яйцеводе может обуславливаться снижением реснитчатой активности эпителия яйцеводов и изменением пропускной функции истмуса.

Вторым критическим этапом следует считать момент выхода зародыша из зоны пеллюцида, когда он остается один на один с маточным окружением. Ничем не защищенная бластоциста становится иммуногенной, т.е. организм может проявит на нее реакцию иммунного отторжения. Она не имеет надежного контакта со слизистой оболочкой матки, а следовательно, налаженного питания.

Приблизительно с этого момента зародыш начинает продуцировать особый белок - фактор тау, который предотвращает синтез маткой простагландинов и рассасывание желтого тела. Недостаточный уровень синтеза зародышем этого фактора является одной из причин ранних эмбриональных потерь. Если гибель зародыша произошла на этом этапе, половой цикл животного удлиняется.

Третьим критическим этапом является период имплантации зародыша в слизистую матки, при которой участок трофобласта под эмбриобластом рассасывается и он становится не защищенным от воздействия среды матки.

Наконец, четвертым критическим этапом следует считать время перехода к фетальному периоду развития. В начале эмбрионального периода питательные вещества, необходимые для роста и развития зародыша, поступают из желточного мешка. По мере роста зародыша такой уровень питания оказывается недостаточным, а плацентарная связь находится лишь в начале становления.

Эмбриональные потери могут быть обусловлены разными причинами, в числе которых: нарушение иммунных отношений в системе мать-плод, дородовый биологический отбор, нарушение питания матери, стрессовые воздействия на материнский организм, наличие патогенной микрофлоры в половых путях, нарушение гормонального равновесия материнского организма, радиоактивное облучение, токсикогенное, тератогенное и мутагенное действие на зародыш некоторых химических веществ, проникающих через плацентарный барьер. Как стрессовые факторы могут выступать тепловые и холодовые воздействия, избыточная инсоляция животных, нарушение светового режима (непрерывное освещение или, наоборот, постоянная темнота), сильные болевые раздражители, безвыгульное содержание, дефицит жизненного пространства, производственные шумы.

3. ЗООТЕХНИЧЕСКИЙ МЕТОД ИСКУССТВЕННОГО ОСЕМЕНЕНИЯ

3.1 Искусственное осеменение, его становление и развитие

Первыми опытами по искусственному осеменению можно считать работы итальянца Лазаро Спалланцани (1780), который вводил семенную жидкость кобеля в половые пути суки и получил щенят. Однако, он ошибочно связывал оплодотворяющую способность спермы с семенной плазмой. Последующие исследования французов Прево и Дюма показали, что оплодотворяющим агентом спермы выступают спермии.

Первые работы по практическому внедрению метода искусственного осеменения в сельском хозяйстве были проведены профессором И.И. Ивановым (1897-1907) в имении Ф.Э. Фальц-Фейна "Аскания-Нова". Он осеменял кобыл спермой жеребцов, которую собирал с помощью вставленных во влагалища других кобыл губок и получал жизнеспособное потомство. Позже им также были получены зеброиды - продукт искусственного осеменения кобыл спермой самца зебры.

И.И. Иванов назвал свой метод “искусственным оплодотворением” (плодотворением - созданием плода), однако уже в то время в связи с открытием метода искусственного вызывания дробления яйца без спермиев (Тихомиров) возникла необходимость в разграничении этих понятий. Со временем в обиход вошли термины “естественное и искусственное оплодотворение”, т. е. творение плода путем воздействия на яйцо, и “естественное и искусственное осеменение” для обозначения метода введения спермы в половые пути самки.

Вначале искусственное осеменение применялось как метод лечения бесплодия. Но уже тогда И. И. Иванов доказывал, что для широкого использования метода искусственного осеменения “…необходимо вывести его из узкого круга лечебных средств бесплодия”. Он подчеркивал, что лечение бесплодия не является основной задачей искусственного осеменения; “…его задача, - писал И. И. Иванов, - определяется теми широкими перспективами, которые открываются с разработкой техники искусственного осеменения для дела улучшения пород домашнего скота, притом с наименьшей тратой времени и денег”.

До 50-х годов 20-го века при искусственном осеменении использовали свежеполученное и охлажденное до 3-5 оС семя. Хотя применение авиации для транспортировки такого семени позволило расширить ареал его применения (примером чему служит восстановлении численности асканийских мериносовых овец после войны), все же недолговечность хранения спермы ограничивало как эффективность использования генетического потенциала лучших самцов, так и скорость селекции.

Прогресс наметился в 1952 году, когда Смирновым Игорем Владимировичем была демонстрирована возможность снижения температуры спермы млекопитающих до температуры сухого льда (минус 78 оС) с сохранением оплодотворяющей способности части спермиев. В дальнейшем англичанами Polge C. и Rowson L. была открыта криозащитная способность глицерина и разработана методика глубокой криоконсервации спермы быков и ее длительного хранения при температуре жидкого азота (минус 196 оС).

В дальнейшем была разработана методика криоконсервации спермы быков и баранов, которая обеспечила сохранение поступательного движения у 35-40 % спермиев. Однако снижение качества семени, которое неизбежно имеет место при его глубоком замораживании, обусловило необходимость поиска и разработки приемов повышения эффективности использования такого семени.

В настоящее время под методом искусственного осеменения подразумевают комплекс мероприятий, совместное применение которых обеспечивает возможность осеменения большого количества самок спермой избранного самца независимо от времени взятия семени и локализации самца и самки. Это обеспечивается за счет мероприятий по:

- рациональному использованию репродуктивного потенциала самца;

- взятию, разбавлению, дроблению на дозы, замораживанию и длительному хранению спермы самцов-производителей;

- правильного выявления половой охоты и своевременного введения размороженной спермы в половые пути самки.

Рациональное использование репродуктивного материала самцов-производителей подразумевает осуществление комплекса мероприятий, направленных на получение оптимального количества качественного репродуктивного материала (спермы) за время хозяйственного использования самца, и базируется на:

- обеспечении полноценного кормления самцов-производителей;

- соблюдении периодичности взятия спермы (обычно дуплетно два раза в неделю);

- своевременной профилактике и лечении заболеваний, передающихся половым путем.

В настоящее время самцов-производителей содержат на специализированных племпредприятиях, которые кроме взятия, замораживания и хранения спермы, занимаются отбором и выращиванием племенного молодняка, а также проверкой самцов на "улучшательство".

Существующие методики взятия, разбавления, замораживания и длительного хранения спермы.

Взятие спермы проводят при имитации садки самца на подставное животное, чучело или специальный станок. Естественный половой акт (введение пениса самца во влагалище самки) имитируется использованием искусственной вагины - специального прибора, который имитирует физические условия влагалища самки.

Полученная в спермоприемник сперма в дальнейшем оценивается, разбавляется в определенной пропорции растворами криозащитных веществ, делится на дозы и замораживается.

В настоящее время существуют несколько методик замораживания спермы быков, в том числе:

- в пайеттах (Франция, Cassou R., 1964);

- в открытых гранулах (Япония, Nagase H., 1964);

- в ампулах и соломинках (США, Almaquist J.O., 1968);

- в облицованных гранулах (Украина, Осташко Ф.И., 1969);

- в минитубах (ФРГ, Simmet L., 1972).

Каждая из методик имеет свои недостатки и преимущества по простоте использования, уровню бактериального загрязнения, необходимости наличия сложного оборудования и т.п.

Для спермы баранов применяется в основном методика замораживания спермы в открытых гранулах. В настоящее время разрабатываются методики замораживания спермы баранов в пайеттах и облицованных гранулах (с применением элементов технологии Осташко Ф.И.).

Для спермы хряков достаточно разработанной методики криоконсервации до настоящего времени не разработано, осеменение проводят свежеполученным разбавленным охлажденным семенем.

Замороженная по определенной методике сперма размораживается по соответствующей ей методике.

3.2 Сперма и организация работы с ней

Сперма представляет собой смесь спермиев (половых клеток) и секретов придаточных половых желез. Функция спермиев - оплодотворить яйцеклетку, функции секретов придаточных половых желез - поддержка жизнеспособности спермиев, создание необходимой кислотности во влагалище и шейке матки, частичная активация спермиев, их способности проникнуть в яйцеклетку.

Обоснование доз спермы при искусственном осеменении

Решающее значение при определении дозы спермы имеет динамика полового акта. При искусственном осеменении сперму вводят непосредственно в матку или шейку матки, минуя влагалище, поэтому следует вводить столько спермиев, сколько их туда обычно попадает при естественном осеменении. У овец, например, при естественном осеменении в шейку матки попадает около 100 - 150 млн. спермиев, т. е. примерно 1/20 - 1/30 объема эякулята. Поэтому и было предложено вводить в шейку матки овцы 0,05, а в шейку матки коровы 0,5 мл спермы. Большие дозы обычно не имеют преимуществ, а уменьшение снижают оплодотворяемость.

Овцам при влагалищном осеменении вводят 0,1 мл неразбавленной спермы, разбавленной - 0,2 - 0,3 мл; при цервикальном осеменении - соответственно 0,05 - 0,1 и 0,1 - 0,15 мл.

Коровам при влагалищном осеменении вводят 1 - 2 мл неразбавленной и 2 - 3 мл разбавленной спермы; при цервикальном осеменении - 0,3 - 0,5 и 1 - 1,5 мл.

Качество спермы

Успех осеменения зависит также от качества спермиев. Чем активнее их движение, тем меньшую дозу спермы можно применять. До недавнего времени при всех способах хранения спермы быков-производителей в одной дозе (1 мл) для осеменения коров и телок предусматривалось не менее 25 млн. активных спермиев. Уменьшение концентрации спермиев до 12,5 млн. спермиев обусловливает снижение оплодотворяемости телок на 11,9 - 20%. Поэтому рекомендовано государственным станциям по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных использовать замороженную в жидком азоте сперму быков с содержанием в дозе не менее 10 млн. живых спермиев, из которых 30% должны быть с активным прямолинейно-поступательным движением. Такое количество спермиев в дозе допустимо только при использовании спермы с высокой оплодотворяющей способностью.

У животных с маточным типом естественного осеменения сперма продвигается по просвету рогов матки к яйцепроводам. Поэтому малые дозы спермы при искусственном осеменении не дают положительных результатов.

Дозу спермы для свиней при фракционном методе введения устанавливают в зависимости от концентрации и активности спермиев. При этом число подвижных спермиев в дозе должно быть 3 млрд. для основных и 2 млрд. для ремонтных маток. При нефракционном способе осеменения используют разбавленную сперму. По методу ВИЖ ее вводят из расчета 1 мл на 1 кг массы тела, однако общее количество спермы не должно превышать 150 мл. В дозе должно содержаться не менее 4 - 5 млрд. активных спермиев.

Таблица 4

Животное	Количество спермиев с поступательным движением в дозе, млн.
КРС	12,0-15,0
Овцы	80,0
Свиньи	4000,0-5000,0

Оценка спермы по подвижности

Для проверки качества спермы необходимо использовать подогретые предметные и покровные стекла, находящиеся во время работы на обогреваемом столике микроскопа. Для взятия пробы на исследование вращательными движениями сперму смешивают, приоткрывают пробку флакона и берут стерильной стеклянной палочкой или пастеровской пипеткой каплю спермы и помещают на предметное стекло. Флакон со спермой немедленно закрывают пробкой и помещают обратно в термос. Дают сперме нагреться до 38°С на обогревательном столике микроскопа. После чего при увеличении микроскопа в 100-180 раз отыскивают поле зрения с наибольшей подвижностью спермиев.

Подвижность спермиев оценивают по десятибалльной шкале. Высшую оценку (10 баллов) получает сперма, в которой практически все спермин имеют прямолинейно-поступательное движение. При оценке 9 баллов таких спермиев 90%, 8 баллов - 80, 7 баллов - 70% спермиев движутся прямолинейно-поступательно и т.д.

Замороженную сперму оценивают после оттаивания. При использовании спермы в соломинке один конец ее, закрытый специальной пробкой (стеклянный шарик и др.), отрезают стерильными ножницами и опускают во флакон с раствором 2,9%-ного лимоннокислого натрия, подогретого до 38°С. Затем отрезают второй закрытый конец соломинки и оттаянную сперму выливают во флакон. Полученную смесь тщательно размешивают и с помощью соломинки берут каплю спермы для оценки на подвижность под микроскопом. Из каждой партии проверяют 1-2 соломинки.

При использовании спермы в облицованных гранулах, оболочка которых выполнена из оптически прозрачного полимерного материала, качество спермы оценивают перед осеменением животных без предварительной разгерметизации спермодозы. Для этого, предварительно протерев стерильной салфеткой, гранулу размещают на предметном стекле и прижимают ее вторым аналогичным стеклом с помощью специального зажима. Участок гранулы, расположенной между стеклами, подводят под объектив микроскопа и определяют процент спермиев с прямолинейно-поступательным движением.

В соответствии с ГОСТ 26030-83 (Изменение № 1) «Сперма быков замороженная» к использованию допускается сперма быков-производителей, имеющая следующие характеристики:

- подвижность спермиев, баллы (%), не ниже 4 (40);

- число спермиев с прямолинейно-поступательным движением (ППД) в дозе, млн., не менее 15;

- объем дозы, см³, 0,1-1,0;

- выживаемость спермиев при 38°С не менее 5 часов;

- коли-титр отрицательный;

- микроорганизмы, вызывающие инфекционные заболевания, не допускаются.

От высокоценных быков-производителей и улучшателей, а также от быков, происходящих от родителей, признанных улучшателями, допускается к использованию сперма с подвижностью для свежеполученной не ниже 7 балов, для размороженной не ниже 3 баллов и числом спермиев с прямолинейно-поступательным движением в дозе не менее 12-15 млн. спермиев в одной дозе.

Хранение и оттаивание спермы

При работе с семенем (спермой) следует помнить, что на жизнеспособность спермиев влияют следующие факторы:

- свет - солнечные лучи убивают спермиев, поэтому сперму надо хранить в темном месте, а работать с ней при рассеянном (неярком) дневном или искусственном свете; лучше иметь окно и электролампы с матовым белым стеклом. Стол, за которым работают со спермой, устанавливают вне зоны прямого освещения; температура - нагревание выше 42°С и охлаждение до минус 1°С опасны для спермиев. Сперму следует хранить при установленных температурах, не допуская резкого ее охлаждения или нагревания, а работу с ней проводить в лаборатории при комнатной температуре; вода - губительно действует на спермиев, в связи с чем сперму необходимо помещать в сухую, чистую, герметически закрываемую посуду, а при хранении в тающем льду или при появлении в термосе холодной воды упаковывать так, чтобы вода не могла проникнуть в однодозовую пробирку (флакон); спирт - вызывает гибель спермиев, поэтому инструменты и посуду после обеззараживания спиртом следует обмывать 1%-ным стерильным раствором бикарбоната натрия или 2,9%-ным раствором лимоннокислого натрия.

Запрещается хранить медикаменты и дезинфицирующие средства, не предусмотренные для использования на пунктах по осеменению животных. Курить в помещении, где хранят сперму, запрещается.

На пункты искусственного осеменения для использования сперму доставляют с племпредприятия (станции по искусственному осеменению животных) и хранят одним из способов.

Сперму, сохраняемую при низких температурах (криоконсервация), замораживают на племпредприятиях при минус 196°С в соломинках, необлицованных и облицованных гранулах.

При работе со спермой следует соблюдать следующие правила:

- не допускается преждевременное оттаивание спермы и повторное ее замораживание. Кратковременное повышение температуры, например при перекладывании расфасованной спермы из стационарного хранилища в транспортный сосуд Дьюара или из одного сосуда в другой, оказывает отрицательное воздействие на ее качество. До использования криоконсервированную сперму необходимо постоянно хранить в жидком азоте;

- перед использованием оператор в защитных очках и перчатках извлекает дозу спермы (соломинку или гранулу) из сосуда Дьюара и оттаивает, предварительно подготовив все необходимые инструменты и оборудование для этой работы.

Сперму, сохраняемую при 2-4°С (кратковременное хранение), после взятия у производителей разбавляют и постепенно охлаждают, затем отправляют на пункты упакованные в одноразовые пробирки или ампулы (флаконы) в термосе со льдом. При транспортировке лед должен находиться в термосе под и над упаковкой со спермой.

Получив термос со спермой, нужно:

- проверить количество и расположение льда, слить накопившуюся воду из термоса, проконтролировать качество упаковки пробирок или ампул (флаконов), дополнить термос тающим льдом, обеспечив дальнейшее хранение спермы при температуре не выше 4°С. Пробирки, ампулы или флаконы должны быть в теплоизолирующей обертке (ватно-марлевая слоем 1 -2 см или поролоновая) и в водонепроницаемых полиэтиленовых мешочках;

- использовать сперму необходимо в течение 3 суток с момента взятия ее у быка, при этом подвижность спермиев на третьи сутки хранения должна быть не ниже 7 баллов;

- перед осеменением сперму осторожно перемешать вращением пробирки, ампулы или флакона и проверить подвижность спермиев под микроскопом при температуре нагревательного столика 38°С.

Оттаивание спермы в соломинках. Правой рукой поднимают крышку сосуда Дьюара и кладут рядом, а левой - поднимают пластмассовый стакан из канистры (со спермой нужного быка) до нижнего края горловины емкости. Правой рукой берут пинцет и концы его охлаждают в жидком азоте до прекращения кипения. Охлажденным пинцетом вынимают одну соломинку, быстро и энергично стряхивают остатки жидкого азота и немедленно переносят в воду для оттаивания. Канистру с оставшимися соломинками опускают на дно сосуда, который сразу же закрывают крышкой.

Оттаивание спермы в соломинках проводят с использованием термостата-оттаивателя для оттаивания криоконсервированного семени. Затем соломинку вынимают, насухо протирают стерильной салфеткой. Одновременно оттаивают не более 2 доз при условии немедленного их использования (в течение 10-15 мин). Качество спермы определяют по общепринятой методике.

Для осеменения коров и телок спермой в соломинках применяют осеменительный инструмент, состоящий из металлической трубки с держателем и фиксатором, стержня и защитного чехла.

Перед осеменением оператор берет пакет с одноразовыми пипетками, протирает тампоном, смоченным 96°-ным спиртом, один из углов пакета и надрезает его стерильными ножницами или прорывает концом пипетки. Выдвинув пипетку да 1\3 длины, соединяет ее со стерильным шприцем при помощи муфты (полиэтиленовой, резиновой) или с полиэтиленовой ампулой, предварительно срезав ее колпачок. Затем он пипетку извлекает полностью, а надрезанный конец ампулы запаивает.

Уголок мешка с защитными чехлами, обработанный спиртовым тампоном, отрезают ножницами так, чтобы из отверстия можно было взять один чехол, конец которого выдвигают на 20-30 мм, при этом остальная часть его остается стерильной.

Левой рукой берут инструмент для осеменения, а правой - соломинку с оттаянной спермой. Соломинку следует слегка встряхнуть, держа за кончик, чтобы воздушный пузырек поднялся к пробке. Обычно встряхивают 2 раза. Поршень инструмента для осеменения оттягивают примерно на 90 мм и в трубку до упора вставляют соломинку со спермой. Конец ее отрезают продезинфицированными ножницами строго перпендикулярно у самой пробки (или стеклянного шарика) после воздушного пузырька. Ножницы должны быть острыми и использоваться только для отрезания соломинок. При отрезании пробки недостаточно острыми ножницами кончик соломинки сдавливается и становится овальным. В таком случае часть спермы при выталкивании из соломинки остается в защитном чехле.

Оттаивание спермы в гранулах. Гранулы бывают трех видов: необлицованные малого объема 0,1-0,2 мл (с высокой концентрацией спермиев при разбавлении дозы перед осеменением изотоническим раствором лимоннокислого натрия); необлицованные большого объема 0,5-1,0 мл (со средней концентрацией спермиев, не требующей при оттаивании разбавления дозы раствором цитрата натрия); облицованные в полимерную оболочку объемом 0,25 мл.

Для оттаивания гранул объемом 0,1-0,2 мл необходимо иметь: стеклянные стерильные флаконы из-под пенициллина, 2,9%-ный раствор лимоннокислого натрия промышленного производства, расфасованного по 1 мл в ампулах вместимостью 3 мл; водяную баню вместимостью не менее 1 л; мерные стеклянные пипетки на 5-10 мл (по одной); пинцет анатомический длиной 25-30 см.

Для оттаивания гранул объемом 0,1-0,2 мл берут 1-2 ампулы или флакона с раствором лимоннокислого натрия и ставят в водяную баню (38°С) на 2-3 мин. Быстро (за 4-5 с) подтягивают к горловине сосуда Дьюара канистру (со стаканом) или матерчатый мешочек с гранулами, извлекают стерильным и охлажденным в жидком азоте пинцетом нужное число их и опускают в подготовленные флаконы или ампулы с раствором лимоннокислого натрия.

Ампулы или флаконы с гранулами спермы оттаивают 8-10 с и сразу же вынимают из водяной бани, не допуская дальнейшего нагревания спермы, вытирают насухо полотенцем или марлевой салфеткой и ставят в штатив. У подогретой до 18-25°С спермы определяют качество. От оттаивания до введения спермы животному должно проходить не более 10-15 мин.

Оттаивание гранул объемом 0,5-1,0 мл проводят без добавления раствора лимоннокислого натрия. Флакон погружают в водяную баню, подогревают до температуры воды 38°С, выдерживают 2-3 мин, затем в него вносят 2 гранулы замороженной спермы и дают постоять до перехода их в жидкую фазу. Флакон со спермой извлекают из водяной бани, вытирают насухо наружную поверхность и оценивают качество спермы.

Сперму в облицованных гранулах объемом 0,25 мл оттаивают следующим образом. Облицованную гранулу извлекают из сосуда Дьюара пинцетом с широкими браншами, быстро помещают в водяную баню с температурой 38°С и оттаивают в течение 8-10 с. Затем насухо протирают гранулу стерильной салфеткой и проверяют ее на герметичность путем легкого сжатия между двумя пальцами. После этого сперму оценивают на подвижность.

4. ТЕХНИКА ИСКУССТВЕННОГО ОСЕМЕНЕНИЯ

4.1 Методы искусственного осеменения коров

4.1.1 Способы выявления половой охоты коров

Наиболее точным признаком готовности самки к спариванию и оптимальным сроком осеменения является период половой охоты при наличии течки и полового возбуждения.

В настоящее время существует несколько способов определения половой охоты и других признаков полового возбуждения у коров и телок.

Таблица 5. - Способы выявления половой охоты у коров

Способ выявления	Применяемые вспомогательные средства	Наблюдаемые явления при наличии половой охоты	Недостатки данного способа
Визуальный	Визуальное наблюдение за поведением животных	Животные проявляют беспокойство, издают звуки, переступают с ноги на ногу, оглядываются, у них снижен аппетит. Самки проявляют поисковую реакцию на самца. Животные обнюхивают и облизывают эрогенные зоны (вымя, клитор, область паха), допускают прыжки на себя и спокойно стоят при этом - рефлекс неподвижности. В начальный период полового возбуждения из половой щели истекает слегка беловатая слизь, иногда с белыми прожилками, которая к середине охоты становится прозрачной, а в конце охоты начинает слегка мутнеть и густеть.	Невыявляемость половой охоты у животных с "тихой" охотой и у животных с больными конечностями.
Рефлексологический	Использование быка-пробника (вазоэктомированого или с отведенным в сторону половым членом).	Животные допускают прыжки быка на себя, проявляют общую поисковую реакцию на самца.	Применение пробника на привязи, которого подводят поочередно к привязанным коровам, нередко дает ошибки, т.к. часто стельные коровы принимают быка без заметного сопротивления и, наоборот, молодые телки отбивают пробника при наличии охоты.
Вагинальный	Осмотр влагалища и шейки матки при помощи влагалищного зеркала.	Наблюдается набухшая и покрасневшая слизистая оболочка влагалища, канал шейки расслаблен и приоткрыт, из него истекает слизь, которая скапливается на дна влагалища, а затем самотеком вытекает из половой щели.	Необходимость фиксации животного при осмотре. У некоторых животных, особенно молодых раскрытие шейки матки выражено не сильно. Кроме того, в зимние месяцы покраснение стенок влагалища не всегда очевидно.
Ректальный	Прощупывание яичников через прямую кишку (ректу) с целью определения степени развития предовуляторного фолликула.	Зрелый фолликул четко выступает на поверхности яичника. При осторожном надавливании пальцем чувствуется движение фолликулярной жидкости (флюктуация), стенки фолликула мягко вдавливаются. Незрелый фолликул незначительно выступает на поверхности яичника и твердый на ощупь.	Необходимость хорошей квалификации оператора и частых повторений манипуляций. Возможность разрыва фолликула и выхода яйцеклетки с ее дальнейшей утратой при неосторожной манипуляции с яичниками.
Гормональный	Определение содержания гормона прогестерона в крови, моче или молоке животных.	Содержание прогестерона.	Необходимость наличия специальных реактивов. Кроме того, при персистентном желтом теле содержание прогестерона повышено, что часто интерпретируется как стельность.
Электрометрический	Измерение электрического сопротивления слизистой оболочки преддверия влагалища	Время максимального выделения слизи сопровождается понижением электрического сопротивления слизистой преддверия влагалища и часто совпадает с оптимальным временем осеменения.	Снижение электрического сопротивления преддверия влагалища наблюдается при некоторых заболеваниях половых органов, после мочеиспускания, при авитаминозе и др. Кроме того, приборы не всегда дают верные показания.
Ультразвуковой	Ультразвуковое исследование степени развития предовуляторного фолликула.	С помощью прибора для ультразвукового сканирования исследуют степень развития предовуляторного фолликула.	Необходимость наличия дорогостоящей аппаратуры.

4.1.2 Оптимальное время и кратность осеменения

Выбор сроков осеменения самок - один из наиболее важных факторов при организации и проведении искусственного осеменения. Оптимальным сроком осеменения является период, наиболее благоприятный для встречи спермиев с яйцеклеткой.

При выборе срока осеменения при искусственном осеменении играют роль три фактора:

Во-первых, способность яйцеклетки к оплодотворению довольно ограничена (приблизительно 5-10 часов). После этого яйцеклетка стареет, что уменьшает ее вероятность слияния со спермием и увеличивает вероятность ненормального развития и гибели. Это обстоятельство определяет то, что спермии к моменту овуляции яйцеклетки должны уже находиться в половых путях животного.

Во-вторых, исследования показали, что для соединения спермия с яйцеклеткой самому спермию необходимо пройти в половых путях самки некоторую подготовительную процедуру, именуемую капацитацией. Это своего рода подготовительная процедура подготовки внешних структур спермия к прохождению короны радиаты яйцеклетки. Продолжительность этой процедуры у сельскохозяйственных животных составляет приблизительно 5-6 часов. Это обстоятельство требует необходимости введения спермы в половые пути коров за 5-6 часов до предполагаемой овуляции.

В-третьих, жизнеспособность спермиев в половых путях самки при естественном покрытии самцом составляет, в среднем, 24-48 часов. Жизнеспособность замороженно-оттаянных или свежеразбавленных спермиев намного ниже, в среднем, 12 часов. Этот факт требует введения спермы не более чем за 12 часов до предполагаемой овуляции.

Указанные три фактора определяют необходимость точного знания сроков овуляции предовуляторного фолликула у коров и телок.

У самок крупного рогатого скота в отличие от других видов сельскохозяйственных животных овуляция происходит в стадию торможения, через 10-12 часов после окончания половой охоты, у 80% животных в ранние утренние часы (3-4 часа утра).

Все указанные факторы определяют оптимальный срок искусственного осеменения коров и телок в конце половой охоты. Так как у 70% животных средняя продолжительность половой охоты составляет 12 часов (с колебаниями от 8 до 20 часов), то, если начало охоты приходится на утренние часы, таких животных осеменяют вечером (в 17-19 часов вечера). Если же начало охоты фиксируют в вечернее время, таких животных осеменяют рано утром (в 5-6 часов утра).

При осеменении дойных коров следует соблюдать следующее правило:

- проводить осеменение до дойки или через два часа после нее. Это связано с тем, что при доении в головном мозге возникает доминанта, препятствующая осуществлению всасывающей функции шейки матки, что снижает результативность искусственного осеменения.

Важным фактором плодотворного осеменения животных наряду с выбором времени осеменения является кратность осеменения. В соответствии с инструкцией коров и телок осеменяют дважды: первый раз после выявления у них половой охоты и второй раз - через 10-12 часов. В случае продолжения охоты дополнительные осеменения проводят через каждые 12 часов, вплоть до окончания признаков половой охоты.

4.2 Техника искусственного осеменения коров и телок

Разработка способов искусственного осеменения коров и телок базируется на трех основных положениях:

Во-первых: Крупный рогатый скот принадлежит к животным с влагалищным типом осеменения, т.е. при естественном половом акте сперма самца изливается в переднюю часть влагалища. Шейка матка, при этом, выполняет всасывающую функцию - своим сокращением она как бы втягивает сперму внутрь. Кроме того, шейка матки у крупного рогатого скота выполняет функцию промежуточного сберегателя спермиев. В ней создается некоторое депо спермиев, которые затем порциями поступают в матку. Этим определяется то, что сперма быков должна быть введена в переднюю часть влагалища, как можно ближе к вагинальной части шейки матки. В одной дозе для осеменения должно быть не менее 10 млн. активных спермиев с поступательным движением.

Во-вторых: При естественном половом акте количество спермиев, вводимых во влагалище животного очень велико, в то время как при искусственном осеменении количество спермиев в одной дозе значительно меньше. Как показали исследования, 95% спермы, поступающей при естественном половом акте, гибнет, и только 5% попадет в шейку и сохраняет там свою жизнеспособность. Следовательно, при искусственном осеменении вся доза должна быть введена непосредственно в шейку матки.

В-третьих: Стенки влагалищ рожавших коров вследствие их растяжения при беременности образуют складки, или кармашки, что требует необходимости точного знания локализации влагалищного отверстия шейки матки при искусственном осеменении.

Эти три фактора определяют существование четырех способов искусственного осеменения крупного рогатого скота.

Кроме того, следует помнить, что искусственное осеменение связано с введением в половые органы самок инструментов, вызывающих у животного ответную реакцию. Одни из признаков ее проявления у животных - изгиб шейки матки и подтягивание ее к телу. При этом складки влагалища как бы «наползают» и закрывают вход в цервикальный канал. Они плотно сжимаются, и оставшееся между ними маленькое отверстие легко можно принять за вход в канал шейки матки. На самом деле вход в цервикальный канал будет находиться у дна наружного зева (чаще внизу или сбоку) на глубине 3-5 см. Иногда складки образовывают два углубления (в два этажа), и при осеменении коров катетер (пипетка) попадает в одно из них. Как только действие раздражителя прекращается, шейка матки занимает нормальное положение. При этом она «выпячивается» в каудальном (заднем) направлении и введенная в «мешок» сперма выливается во влагалище. Во избежание этого привод коров и телок на пункт, фиксацию их в станке и осеменение необходимо производить, не допуская приемов, вызывающих стрессовое состояние (удары, ущемление слизистой оболочки влагалища зеркалом, введение горячего или холодного зеркала и т.п.). Перед осеменением корове надо дать постоять в станке, чтобы она успокоилась.

После каждого осеменения коров необходимо выдерживать в стойле или в манеже пункта до прекращения у них признаков охоты.

4.2.1 Эпицервикальный способ осеменения

Название способ получил по греческим словам "эпи" - около и "цервикс" - шейка. Иными словами - введение спермы как можно ближе к каналу шейки матки. Таким образом, при таком способе осеменения частично имитируется естественный способ, при котором сперма изливается как можно ближе к влагалищному отверстию канала шейки матки. Используется только при осеменении телок.

Возможность применения этого способа обусловлена отсутствием у телок растягиваний (кармашек) влагалища. Это определяет то, что при глубоком введении катетера кончик его почти совпадает с влагалищным отверстием шейки матки. В этом случае вводимая сперма изливается на влагалищное отверстие шейки матки и, при стимуляции ее всасывающей функции путем легкого массажа клитора, попадает в канал шейки матки.

В набор инструментов входят: стерильная полиэтиленовая ампула для спермы или пластмассовый шприц, стерильный полистироловый катетер 35-40 см. В одной дозе для осеменения должно быть не менее 10 млн. активных спермиев с поступательным движением.

Техника осеменения:

Животное фиксируют.

Подготавливают инструменты. Для этого полиэтиленовую ампулу присоединяют к катетеру. Проводят размораживание и оценку спермы по определенной методике. Затем ампулу сдавливают для удаления из нее воздуха и засасывают порцию замороженно-оттаянного или свежеразбавленного семени. После тщательного туалета наружных половых органов телки катетер вводят в преддверие влагалища и проталкивают катетер приблизительно на половину его длины под углом приблизительно 20-30 градусов вверх от линии позвоночника. После этого направление движения катетера ориентируют в направлении приблизительно 20-30 градусов вниз от линии позвоночника. Катетер продвигают до упора, содержимое ампулы выдавливают. Ампулу отсоединяют и делают легкий массаж клитора, наблюдая визуально за продвижением спермы по катетеру. Осторожно вытягивают катетер.

После осеменения обеспечивают спокойные условия для животного.

Недостаток способа: применяется только для телок. Показатель оплодотворяемости телок - около 60-70 %.

4.2.2 Маноцервикальный способ осеменения

Название способ получил по греческим словам: "мано" - рука и "цервикс" - шейка. Иными словами - осеменение в канал шейки матки c одновременным контролем локализации влагалищного отверстия шейки матки рукой. Применяется только для осеменения коров.

В набор инструментов входят:

стерильная полиэтиленовая ампула для спермы, стерильный катетер (10 см), полиэтиленовая или резиновая перчатка.

Техника способа:

Животное фиксируют.

Подготавливают инструменты. Для этого полиэтиленовую ампулу присоединяют к катетеру. Проводят размораживание и оценку спермы по определенной методике. Затем ампулу сдавливают для удаления из нее воздуха и засасывают порцию замороженно-оттаянного или свежеразбавленного семени. После тщательного туалета наружных половых органов коровы на руку одевают перчатку, омывают ее стерильным физиологическим раствором или 2,9%-ным раствором цитрата натрия , осторожно вводят руку во влагалище проверяют состояние и делают легкий массаж шейки матки. Затем другой рукой подают заряженную порцией спермы ампулу с катетером и под контролем указательного пальца подталкивают катетер до тех пор, пока он не будет введен в шейку на глубину 5-6 см. Затем выдавливают содержимое ампулы. Осторожно вытягивают руку и 1-2 минуты делают легкий массаж клитора для стимуляции всасывающей функции шейки. На последнее обстоятельство следует обратить особое внимание, так как легкий массаж клитора способствует не только сокращению шейки матки, но и стимулирует выход (овуляцию) яйцеклетки, уменьшая, таким образом, вероятность задержки овуляции и яловость.

Недостаток способа: невозможность использования для осеменения животных с узким влагалищем. Показатель оплодотворяемости - 65-70 %.

4.2.3 Визоцервикальный способ осеменения

Способ получил название по греческим словам: "визо" - смотрю и "цервикс" - шейка. Иными словами - осеменение с визуальным контролем локализации шейки матки.

В набор инструментов входят: влагалищное зеркало с осветителем, шприц-катетер разных конструкций.

Техника способа:

Животное фиксируют.

Инструменты готовят в лаборатории пункта, где на столе располагают пронумерованные стеклянные банки емкостью 100 мл с притертыми крышками. В банки 1, 3 и 4 наливают свежеприготовленный стерильный раствор 2,9%-ного лимоннокислого натрия (цитрата натрия), в банку 2 - 70%-ный спирт; раствор в банках 3 и 4 должен быть теплым (38-40 градусов), чтобы шприц нагревался перед наполнением его спермой.

Шприц обрабатывают отмыванием раствором из банки 1, затем обеззараживают спиртом из банки 2, затем промывают растворами из банок 3 и 4.

Набрав порцию замороженно-оттаянного или свежеразбавленного семени в шприц, его держат вертикально, катетером вверх. Влагалищное зеркало увлажняют теплым 1%-ным раствором хлорида натрия или пищевой соды, затем вводят его во влагалище, предварительно раскрыв половые губы рукой. При введении во влагалище зеркало держат ручками в сторону. После введения ручки зеркала поворачивают вниз. Осторожно раскрывают зеркало и, отыскав отверстие шейки матки, вводят в него шприц-катетер на глубину 5-6 см. Медленно, нажимая на поршень шприца, выдавливают сперму. После этого шприц-катетер, а затем и зеркало осторожно извлекают. При осеменении нескольких коров спермой одного быка наружную поверхность катетера после каждого животного обязательно дезинфицируют спиртовым тампоном.

Влагалищное зеркало после осеменения каждой коровы моют теплым 2-3%-ным раствором пищевой соды, вытирают насухо и протирают. Если есть возможность, зеркало прожаривают в жаровом шкафу.

При осеменении животных с помощью влагалищного зеркала с продольным вырезом катетер шприца после введения его в канал шейки матки слегка прижимают к верхнему своду влагалища и, придерживая шприц другой рукой, осторожно извлекают зеркало из влагалища. Через 20-30 с. после того, как животное успокоится, плавным нажатием на поршень вводят сперму в шейку матки и вынимают шприц из половых путей самки.

Осеменение телок проводят также, как и коров, но применяют зеркало меньшего размера.

Недостаток способа: возможность нанесения травм стенкам влагалища при неосторожных манипуляциях с зеркалом. Показатель оплодотворяемости - 50-60 %.

4.2.4 Ректоцервикальный способ осеменения

Способ получил название по греческим словам: "ректа" - прямая кишка и "цервикс" - шейка. Иными словами - осеменение с контролем локализации шейки матки через прямую кишку. Наилучший способ осеменения, так как при этом обеспечивается точное введение спермы в канал шейки матки, а также одновременный массаж половых органов животного.

В набор инструментов входят: стерильная полиэтиленовая ампула для спермы или пластмассовый шприц, стерильный полистироловый катетер 35-40 см с полиэтиленовым чехлом, полиэтиленовая перчатка.

Техника способа:

Животное фиксируют.

Подготавливают инструменты. Для этого полиэтиленовую ампулу или шприц присоединяют к катетеру. Проводят размораживание и оценку спермы по определенной методике. Затем ампулу сдавливают для удаления из нее воздуха и засасывают порцию замороженно-оттаяного или свежеразбавленного семени. После тщательного туалета наружных половых органов коровы на руку одевают перчатку, омывают ее стерильным физиологическим раствором или 2,9%-ным раствором цитрата натрия. Другой рукой раздвигают половые губы и вводят катетер во влагалище. Во избежание попадания в отверстие мочеиспускательного канала катетер сначала продвигают снизу вверх и вперед, далее горизонтально до упора в шейку матки. Руку в перчатке вводят в прямую кишку, фиксируют шейку матки между указательным и средним пальцами. Большим пальцем прощупывают отверстие канала шейки и вводят туда катетер. Некоторую трудность представляет фиксация отверстия шейки из-за ее несколько большего диаметра по сравнению с диаметром самой шейки. Чтобы преодолеть это можно, ухватив шейку, слегка подтянуть ее на себя. Повторив эту процедуру 2-3 раза, добиваются расслабления шейки и возможности захвата влагалищного отверстия шейки путем последовательных перехватов ее по длине. При попадании катетера в канал шейки матки вращательными движениями шейку натягивают на катетер. Катетер продвигают в шейку насколько возможно глубже. Наилучшим приемом есть прохождение катетером всей шейки и выдавливание спермы в полость тела матки. После этого руку осторожно извлекают из прямой кишки. От катетера отсоединяют шприц или ампулу. Затем катетер начинают осторожно и медленно вытягивать, сопровождая эту процедуру легким массажем клитора. Визуально наблюдают всасывание остатков спермы из катетера, что является подтверждением наличия всасывающей функции шейки. После извлечения катетера массаж клитора продолжают еще 1-2 минуты. После осеменения животному обеспечивают покой.

Недостаток способа: необходимость высокой квалификации оператора. Вероятность травм канала шейки при неосторожных манипуляциях катетером. Показатель оплодотворяемости - около 70-75 %.

4.2.5 Способы диагностики стельности коров и телок

На сегодня достаточно разработанными являются три способа определения стельности коров и телок:

- гормональный способ,

- ректальная пальпация,

- с помощью ультразвуковой техники.

Гормональный способ определения стельности коров и телок

Базируется на определении уровня гормона прогестерона в крови или молоке животных. С момента овуляции у самок на месте овулировавшего фолликула формируется временная гормонсинтезирующая железа - желтое тело. При наступлении беременности эта железа не дегенерирует как в случае полового цикла не завершившегося беременностью, а продолжает свое развитие. Она является местом нарастающего синтеза гормона прогестерона, который играет важную роль в поддержании беременности. Наивысшая концентрация этого гормона отмечается на месяц стельности, после чего уровень гормона несколько снижется. Наличие стельности определяют по уровню данного гормона в крови животных на 18-22 день (день предположительной охоты при неуспешном осеменении).

Уровень гормона прогестерона в крови беременных животных составляет - нг/мл. Уровень этого гормона в стадию половой охоты составляет - нг/мл.

Недостатком данного метода является значительная вариабельность показателя содержания прогестерона у различных животных. Кроме того, аналогичная картина повышения содержания прогестерона в крови наблюдается при персистенции желтого тела, которое возникает как результат нарушения механизма лютеинизации желтого тела.

Ректальный способ определения стельности коров и телок

Наиболее доступный способ определения стельности.

Способ заключается в прощупывании матки и рогов матки через прямую кишку с целью определения ее морфологии.

Ультразвуковой способ определения стельности коров и телок