16. Із проростків сосни звичайної за використанням розробленої нами методики уперше очищено низькомолекулярний білок, який належить до рослинних дефензинів. Препарат цього білка за концентрації <1 мкМ пригнічує ріст широкого спектра фітопатогенних грибів, викликаючи морфологічні зміни їхніх гіфів. Антибактеріальних властивостей у дефензину сосни за концентрації <10 мкМ не виявлено. За функціональними властивостями цей білок належить до морфогенної групи рослинних дефензинів.

17. На основі виділеної із проростків сосни матричної РНК створено бібліотеку к ДНК генів, які експресуються у клітинах семиденних проростків сосни звичайної. Отримана бібліотека характеризується інформативністю (титр первинних фагів склав 1,2х10⁶ БУО/мл) і високою якістю (наявні лише 1,5 % нерекомбінантних фагів). Секвеновано 25 клонів і подано їхні нуклеотидні послідовності до dbEST GenBank (Нью-Йорк, США) під номерами EG418144-51 та EL342377-393. З цієї кДНК бібліотеки ампліфіковано дві нуклеотидні послідовності, які кодують структуру двох дефензинів сосни PsDef1 і PsDef2. При цьому кДНК цих білків депоновано в GenBank (Нью-Йорк, США) під номерами EF455616.1 та EF455617.1.

18. Для науково-методичного і практичного використання:

здійснено успішну експресію дефензину 1 сосни звичайної у бактеріальній системі Escherichia colі та отримано рекомбінантний білок, що дозволяє створювати на його основі фунгістатичні препарати із високою антифунгальною активністю;

розроблено методики виділення дефензину з рослинного матеріалу та отримання рекомбінантного дефензину сосни в біологічно активній формі;

отримано поліклональні антитіла (анти-дефензин 1), які специфічно розпізнають ендогенний і рекомбінантний дефензин при застосуванні методу Вестерн-блот та імуноензимному аналізах і виявляють його в насінні сосни, що дозволяє сформувати нові уявлення про механізми захисту останнього від фітопатогенів;

виявлено значне зростання рівня експресії дефензину в проростках сосни звичайної при ураженні їх патогенним грибом Heterobasidion annosum, що свідчить про антифунгальну дію цього білка і можливість з його допомогою підвищувати стійкість хвойних рослин до грибних інвазій;

опрацьовано концептуальні засади створення тест-систем для оцінки стійкості хвойних видів (зокрема сосни звичайної) до фітозахворювань при застосуванні поліклональних антитіл (анти-дефензину 1).

Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації

Статті у наукових фахових виданнях:

1. Гут Р.Т. Порівняльний аналіз загальних білкових спектрів фосфотирозинвмісних білків зародків насіння сосни звичайної (Pinus silvestris L.) в процессі їх проростання / Р.Т. Гут, Г.Т. Криницький, І.Т. Гут // Наук. вісник УкрДЛТУ: Зб. наук-техн. праць. - Львів: УкрДЛТУ. - 1999. - Вип.9.10. - С.86-90. (Автором сформульовано завдання дослідження, проведено аналіз зміни білкових спектрів, підготовлено статтю до друку).

2. Гут Р.Т. Молекулярні механізми дії ауксинів у рослинах / Р.Т. Гут, С.В. Гаврилов, О.С. Осьмак // Наук. вісник УкрДЛТУ: Зб. наук-техн. праць: Лісівницькі дослідження в Україні. - Львів: УкрДЛТУ. - 2002. - Вип.12.4 - С.219-225. (Автором проведено збір та аналіз даних літератури, підготовлено огляд до друку).

3. Гут Р.Т. Сучасні методи виділення сумарної ДНК з рослинних організмів / Р.Т. Гут, М.В. Радченко, Г.Т. Криницький // Наук. вісник УкрДЛТУ: Зб. наук-техн. праць. - Львів: УкрДЛТУ. - 2003. - Вип.13.2 - С.9-21. (Автором проведено аналіз сучасних методів виділення сумарної ДНК, підготовлено статтю до друку).

4. Гут Р.Т. Молекулярно-генетичні маркери та їх використання у лісовому господарстві / Р.Т. Гут, М.В. Радченко, Г.Т. Криницький // Лісівництво і агролісомеліорація. - 2003. - Вип.10.4. - С.58-67. (Автором зроблено узагальнення даних літератури, підготовлено статтю до друку).

5. Ковальова В.А. Експресія RUK/CIN85-споріднених адаптерних білків у проростаючому насінні сосни (Pinus silvestris L.) / Р.Т. Гут, В.А. Ковальова // Лісове господарство, лісова, паперова і деревообробна промисловість. Міжвідомч. наук. - техн. збірник. - Львів: УкрДЛТУ. - 2004. - Вип.29. - С.48-51. (Автором визначені завдання дослідження, підготовлені препарати, підготовлено статтю до друку).

6. Гут Р.Т. Використання ген-специфічних STS-маркерів для дослідження генетичного поліморфізму популяцій хвойних видів рослин / Р.Т. Гут, Ю. Новаковська // Наук. вісник УкрДЛТУ: Зб. наук-техн. праць: Стан і тенденції розвитку лісівничої освіти, науки та лісового господарства в Україні. - Львів: УкрДЛТУ. - 2004. - Вип.14.5 - С.45-53. (За участі автора зроблено збір та аналіз даних літератури, підготовлено статтю до друку).

7. Гут Р.Т. Встановлення генетичних зв'язків між видами родини Fagaceae I SSR-аналізом / Р.Т. Гут, М.В. Радченко, Г.Т. Криницький // Науковий збірник НАУ. - К.: НАУ. - 2004, № 71. - С.11-17. (Автором проведено збір польювих даних, статистичний аналіз, узагальнення отриманих результатів).

8. Гут Р.Т. Дефензини як фактор резистентності рослин до біотичного стресу / Р.Т. Гут, В.А. Ковальова // Наук. вісник УкрДЛТУ: Зб. наук-техн. праць: Стан і тенденції розвитку лісівничої освіти, науки та лісового господарства в Україні. - Львів: УкрДЛТУ. - 2004. - Вип.14.6 - C.49-55. (Автором зроблено узагальнення даних літератури, підготовлено статтю до друку).

9. Гут Р.Т. Використання ISSR-маркерів для встановлення конвергентних еволюційних зв'язків роду Fagus / Р.Т. Гут, М.В. Радченко, Г.Т. Криницький // Цитологія і генетика. - 2004. - Т.38, № 3. - С.60-65. (Автором проведено збір матеріалу, виділення та дослідження сумарної ДНК, проаналізовано отримані дані, зроблено висновки).

10. Гут Р.Т. Використання полімеразної ланцюгової реакції та ISSR праймерів при вивченні генетичного поліморфізму деревних порід / Р.Т. Гут, М.В. Радченко, О.Т. Данчук, Г.Т. Криницький // Наук. праці: Наук-методич. журнал МДГУ. - Миколаїв: МДГУ. - 2004. - Т.39. Вип.26. Екологія. - С.62-66. (Автором сплановані завдання дослідження, підготовлені препарати для аналізу, підготовлено статтю до друку).

11. Гут Р.Т. Значення SH3-доменів у функціонуванні клітин рослин / Р.Т. Гут // Біополімери і клітина. - 2004. - Т. 20. № 5. - С.380-387.

12. Гут Р.Т., Вербовицкая Ю.В., Криницкий Г.Т. Использование ПЦР и ISSR при изучении внутривидовой изменчивости у сосны обыкновенной (Pinus sylvestrys L.) / Р.Т. Гут, Ю.В. Вербовицкая, Г.Т. Криницкий // Сб. науч. трудов ИЛ НАН Беларуси: Проблемы лесоводства и лесоведения. - 2005. - Вып.63. - С.145-147. (За участю автора сформульовано завдання дослідження, проведено виділення ДНК, підготовлено статтю до друку).

13. Nоwакowska J. Zrуїnicowanie genetyczne wybranych pochodzeс sosny zwyczajnej (Pinus sylvestrys L.) z pogranicza polskiego i ukraiсskiego na podstawie analizy mitochondrialnego DNA / J. Nоwакowska, R. Gout, Yu. Verbovytska, J. Bieniek // Leњne Prace Badawcze. - 2005. - № 2. - S.141-147.14. (Автором проведено збір матеріалу, виділення сумарної ДНК, проаналізовано результати, зроблено висновки).

14. Гут Р.Т. Роль фосфоліпази у сигнальних механізмах рослин / Р.Т. Гут // Физиология и биохимия культурных растений. - 2005. - Т.37, № 1 - С.3-15.

15. Гут Р.Т. Характерные особенности выделения суммарной ДНК с листьев и почек древесных растений при изучении генетического полиморфизма. / Р.Т. Гут, М.В. Радченко, Г.Т. Криницкий // Лесной журнал. ИВУЗ. - 2005. - № 5. - С.25-30. (Автором сплановані завдання дослідження, підготовлені зразки ДНК, проаналізовано результати, підготовлено статтю до друку).

16. Ковальова В.А. Новий метод виділення білка з протигрибковою активністю з проростків насіння сосни звичайної / В.А. Ковальова, Р.Т. Гут // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. - Львів: НЛТУ України. - 2005. - Вип.15.4 - C.30-34. (За участі автора сформульовано завдання роботи, проаналізовано результати, зроблено висновки).

17. Гут Р.Т. Порівняльний аналіз різних методів виділення ДНК з хвої сосни звичайної (Pinus sylvestrys L.) / Р.Т. Гут, Ю.В. Вербовицька // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. - Львів: НЛТУ України. - 2005. - Вип.15.5 - С.116-121. (Автором сплановані завдання дослідження, проаналізовано результати, підготовлено статтю до друку).

18. Гут Р.Т. Встановлення генетичного різноманіття в популяції Pinus sylvestrys L. за допомогою хлоропластних мікросателітів / Р.Т. Гут, А. Дзялук // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. - Львів: НЛТУ України. - 2006. - Вип.16.1 - С.99-104. (Автором проведено збір матеріалу, виділення сумарної ДНК, дослідження хлДНК, підготовлено статтю до друку).

19. Ковальова В.А. Характеристика двох дефензиноподібних білків з проростків сосни звичайної / В.А. Ковальова, І.Т. Гут, Р.Т. Гут // Біополімери і клітина. - 2006. - T.22, № 2. - C.126-131. (Автором сформульовані завдання щодо аналізу антимікробної активності дефензиноподібних білків, підготовлено статтю до друку).

20. Криницький Г.Т. Динаміка росту півсібсових потомств сосни звичайної на Львівському Розточчі / Г.Т. Криницький, В.К. Заїка, Р.Т. Гут // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. - Львів: НЛТУ України. - 2006. - Вип.16.2 - С.9-12. (Автором проведено збір польових даних, статистичний аналіз, узагальнення отриманих результатів, підготовлено статтю до друку).

21. Криницький Г.Т. Ріст і продуктивність півсібсових потомств сосни звичайної / Г.Т. Криницький, В.К. Заїка, Р.Т. Гут // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. - Львів: НЛТУ України. - 2006. - Вип.16.3 - С.52-58. (Автором проведено збір польових даних, статистичний аналіз, узагальнення отриманих результатів).

22. Ковальова В.А. Виділення білків із фунгіцидною активністю з проростків сосни звичайної / В.А. Ковальова, Р.Т. Гут // Физиология и биохимия культурных растений. - 2007. - T.39, № 2. - C.114-120. (За участю автора сформульовано завдання дослідження, проведено виділення білків з фунгіцидною активністю, підготовлено статтю до друку).

23. Ковальова В.А. Створення та аналіз бібліотеки генів сосни звичайної / В.А. Ковальова, Р.Т. Гут // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. - Львів: НЛТУ України. - 2007. - Вип.17.3 - С.65-69. (За участю автора сплановано завдання дослідження, проаналізовано кДНК бібіліотеку проростків сосни, проведено ідентифікацію позитивних клонів, підготовлено статтю до друку).

24. Ковальова В.А. Kлонування та аналіз кДНК дефензину 1 сосни звичайної / В.А. Ковальова, І.Т. Гут, Р.Г. Киямова, В.В. Філоненко, Р.Т. Гут // Біополімери і клітина. - 2007. - T.23, № 5. - C.398-404. (Автором сформульовані завдання роботи, проведено клонування дефензину 1 сосни звичайної, проаналізовано результати, зроблено висновки).

25. Гут Р.Т. Зміна морфометричних показників сіянців сосни звичайної під впливом екзогенних стимуляторів / Р.Т. Гут // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. - Львів: НЛТУ України. - 2007. - Вип.17.5 - С.49-53.

26. Ковальова В.А. Аналіз експресії дефензину в процесі проростання насіння сосни звичайної / В.А. Ковальова, Г.Т. Криницький, Р.Т. Гут // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. - Львів: НЛТУ України. - 2007. - Вип.17.8 - С.24-27. (За участі автора сформульовано ідею дослідження, визначено рівень експресії дефензину 1 у тканинах проростків, підготовлено статтю до друку).

27. Гут Р.Т. Особливості росту сіянців сосни звичайної в умовах гормональної стимуляції / Р.Т. Гут // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. - Львів: НЛТУ України. - 2008. - Вип.18.5 - С.14-19.

28. Ковальова В.А. Отримання рекомбінантного дефензину1 сосни звичайної та його антифунгальна активність / В.А. Ковальова, Р.Т. Гут, І.Т. Гут // Біополімери і клітина. - 2008. Т, № 5. - С.377-385. (Автором визначені завдання дослідження, очищено рекомбінантний дефензин, підготовлено статтю до друку).

29. Gout R. Ograniczanie wzrostu organizmуw fitopatogennych za pomoc№ defenzyny sosny pospolitej (Pinus sylvestris L.) / R. Gout, V. Kovalyova // Sylwan. - 2008. V.152, nr.8. - S.54-58. (Автором сплановано мету дослідження, вичено антифунгіцидну активність рекомбінантного дефензину, підготовлено статтю до друку).

30. Ковальова В.А. Молекулярне клонування та характеристика дефензину 2 сосни звичайної / В.А. Ковальова, Р.Т. Гут // Цитология и генетика. - 2008. - Т.42, № 6. - С.55-60. (За участю автора сформульовано ідею дослідження, проведено клонування рекомбінантного дефензину 2, підготовлено статтю до друку).

31. Гут Р.Т. Вплив кліматичних чинників на ширину річних кілець дерев сосни звичайної різних селекційних категорій в ценопопуляціях / Р.Т. Гут // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. - Львів: НЛТУ України. - 2008. - Вип.18.9 - С. 20-25.

32. Гут Р.Т. Взаємозв'язок основних морфометричних показників дерев сосни звичайної різних ценопопуляцій / Р.Т. Гут, М.М. Король // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. - Львів. НЛТУ України. - 2008. - Вип.18.11. - С.133-138. (Автором проведено збір матеріалу, статистичний аналіз, узагальнення отриманих результатів, підготовлено статтю до друку).

Матеріали і тези конференцій:

33. Gout R. T. Expression Of Proteins In Seed Germ Of Scots Pine During Germination /R. T. Gout // Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals And Their Target Enzyme: 4^th Parnas Conf., September 15-17, 2002: - Abstract book. - Wroclaw, 2002. - Р.85.

34. Гут Р.Т. Регуляція ростових процесів сіянців сосни звичайної в умовах гормональної стимуляції / Р.Т. Гут // Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти: I міжнар. конф., 18-21 серп. 2004р.: тези доп. - Львів, 2004. - С.105.

35. Вербовицька Ю.В. Використання ISSR-аналізу при вивченні внутрішньовидового поліморфізму у Pinus / Ю.В. Вербовицька, Р.Т. Гут // Молодь і поступ біології: І міжнар конф. студ. та аспір., 11-14 квіт. 2005р.: тези доп. - Львів, 2005. - С.139.

36. Kovalyova V. The analysis of tyrosine phosphorylation in the process of seed germination of Scots pine / V. Kovalyova, R. Cramer, I. Gout, R. Gout // Molecular mechanisms of cellular signaling: 5^rd Parnas Conf., April 26-29, 2005.: Український біохімічний журнал. - 2005. - T.77, № 2 (спец. вип.). - С.119-120.

37. Кrynytskyy G. T. Present situation and perspectives for development of Pinus sylvestris L. selection in Ukraine / G. T. Кrynytskyy, R. T. Gout // Ochrona leњnych zasobуw genowych i hodowla selekcyjna drzew leњnych w Polsce - stan i perspektywy: Miкdzynarodowa Konf. Naukowo-Techniczna, czerwiec 12-14, 2005: - Abstract book. - Malinowka, 2005. - P.147.

38. Ковальова В.А. Виділення та характеристика дефензину з проростків сосни (Pinus sylvestris L.) / В.А. Ковальова, Р.Т. Гут // Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія: міжнар. конф., 4-6 жовт. 2005р.: тези доп. - К., 2005. - C.97.

39. Гут Р.Т. Вплив гормональних речовин на зміну морфометричних показників сіянців сосни звичайної / Р.Т. Гут // Проблеми збереження, відновлення та збагачення біорізноманітності в умовах антропогенно зміненого середовища: міжнар. конф., 16-19 трав. 2005р.: тези доп. - Кривий Ріг, 2005. - С.34-35.

40. Kovaleva V. Isolation and the antifungal activity of defensin-like protein from Scots pine roots / V. Kovaleva, R. Gout // Population genetics and genomics of forest trees: from gene function to evolutionary dynamics and conservation: joint conf. UIFRO, October 1-6, 2006: - Abstract book. - Madrid, 2006. - P.188-189.

41. Ковальова В.А. Очистка та характеристика дефензину з коренів Pinus sylvestris L. / В.А. Ковальова, І.Т. Гут, Р.Т. Гут // ІХ Укр. біохім. з'їзд, 24-27 жовт. 2006 р.: тези доп. - Х., 2006. - С.45-46.

42. Kovalyova V. Molecular cloning and characterization of the Scots pine defensin / V. Kovalyova, G. Krynytskyy, I. Gout, R. Gout // Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти: III міжнар. наук. конф., 4-6 жовт., 2007р.: тези доп. - Львів, 2007. - С. 194.

43. Kovalуоva V. Investigation of antifungal activity of recombinant defensin 1 from Scots pine / V. Kovalyova, I. Gout, R. Gout // II З'їзд Укр. товар. клітин. біол., 23-26 жовт. 2007 р.: тези доп. - К., 2007. - С.246.

44. Gout R. T. Molecular cloning and characterisation of defensin 1 from Scots pine roots: the implication in regulatory phosphotyrosine signalling / R. T. Gout, V. A. Kovalyova // 5^th International Symposium on Adventitious Root Formation, June, 16-20, 2008: - Abstract book. - Madrid, 2008 - P.83-84.

45. Dzialuk A. Genetic variation of Pinus sylvestris in Eastern Carpathians assessed by cpSSR markers / A. Dzialuk, R. Gout, I. Chybicki // International IUFRO-CTIA 2008: Joint Conference, August 24 - 29, 2008: - Abstract book. - Quebec City, Kanada, 2008. - S.152.

46. Гут Р.Т. Мінливість мітохондріальної ДНК у локальних популяціях сосни звичайної Українських Карпат / Р.Т. Гут, Г.Т. Криницький // Значення та перспективи стаціонарних досліджень для збереження біорізноманіття: міжнар. наук. конф.23-27 верес. 2008р.: тези доп. - Львів, 2008. - C.101 - 102.

Всього за темою дисертації опубліковано 54 наукові праці.

47. Гут Р.Т. Морфогенетична мінливість та біохімічні механізми стійкості сосни звичайної у ценопопуляціях заходу України. - Рукопис.

Анотації

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 06.03.03 - лісознавство і лісівництво. - Національний лісотехнічний університет України. - м. Львів, 2009.

Дисертація присвячена вивченню генетичного потенціалу ценопопуляцій сосни звичайної на заході України та впливу гормональних речовин на ріст і розвиток сіянців сосни, а також молекулярних механізмів, які забезпечують стійкість останніх до дії фітопатогенів. Досліджено багаторічну динаміку і циклічність радіального приросту сосни звичайної різних селекційних категорій у ценопопуляціях заходу України протягом останнього століття (1925-2004 роки) в зв'язку із коливаннями опадів та температури. Досліджено внутріпопуляційну та міжпопуляційну мінливість у рівнинних та гірських ценопопуляціях сосни звичайної заходу України за допомогою мікросателітного анализу хлоропластної ДНК (сpSSR). Cуттєвих відмінностей між рівнинними і гірськими ценопопуляціями сосни за частотою алелей в локусах хлоропластної ДНК не виявлено. Встановлено наявність тільки одного гаплотипу a в рівнинних та гірських ценопопуляціях сосни звичайної заходу України, в словяногірській ценопопуляції сосни у Донецькій області і в кліматичних екотипів географічних культур сосни. Проаналізовано зміни білкового складу насіння сосни у процесі його проростання під дією стимуляторів росту, також вплив останніх на морфометричні та фізіолого-біохімічні показники у сіянців. Знайдено захисний білок - дефензин сосни (PsDef1), який очищено із проростків, досліджено його антимікробні властивості, клоновано його ген та отримано рекомбінантний білок. Отримано антитіла проти дефензину, які використано для дослідження рівня експресії дефензину в проростках сосни звичайної при ураженні їх патогенним грибом Heterobasidion annosum.

Ключові слова: сосна звичайна, півсібсове потомство, генетична мінливість, фітогормони, дефензин

Гут Р.Т. Морфогенетическая изменчивость и биохимические механизмы стойкости сосны обыкновенной в ценопопуляциях запада Украины. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 06.03.03 - лесоведение и лесоводство. ­ Национальный лесотехнический университет Украины. - г. Львов, 2009.

Диссертация посвящена изучению генетического потенциала ценопопуляций сосны обыкновенной на западе Украины и влияния гормональных веществ на рост и развитие сеянцев сосны, а также молекулярных механизмов, которые обеспечивают стойкость последних к действию фитопатогена.

Для проведения морфо-генетических исследований в плюсовых насаждениях бусской и лопатинской ценопопуляциях и в нормальном насаждении страдчанской ценопопуляции отобрано по 30 модельных деревьев сосны обыкновенной разных селекционных категорий, которые характеризуют генофонд этих популяций. Результаты двадцатилетних наблюдений за ростом полусибсовых потомств модельных деревьев показали, что наряду с высокой интенсивностью роста у большинства семейств не только плюсовых, но и нормальных и минусовых деревьев существуют определенные особенности в унаследовании ростовых процессов от материнских деревьев. Установлено, что реализация генетического потенциала полусибсовых потомств сосны обыкновенной проявляется до 20-30-летнего возраста, то есть в периода, когда под влиянием фитоценотических факторов проявляются их конкурентные свойства.

Дендрохронологические индексы годового прироста деревьев сосны обыкновенной в исследуемых ценопопуляциях на протяжении 1925-2004 годов изменялись в пределах 0,86-1,34, отличий в динамике индексов прироста деревьев сосны разных селекционных категорий на протяжении вышеуказанного периода не выявлено. Индивидуальная изменчивость деревьев сосны по реакции индекса радиального прироста на изменение температуры и осадков оказалась слабой и умеренной.

Изучено внутрипопуляционную и межпопуляционную изменчивость в равнинных и горных ценопопуляциях сосны обыкновенной запада Украины с помощью микросаттелитного анализа хлоропластной ДНК (сpSSR). В ценопопуляциях реликтовой сосны обыкновенной Украинских Карпат обнаружено 52 аллели в 10 локусах хлоропластной ДНК, в равнинных ценопопуляциях - 50 аллелей в 9 локусах. Существенных отличий по частоте аллелей в локусах хлоропластной ДНК между равнинными и горными ценопопуляциями сосны не выявлено.

Исследование особенностей опыления материнских деревьев сосны обыкновенной бусской ценопопуляции и влияния опылителей на рост полусибсовых потомств показало, что процессы опыления в насаждениях носят стохастический характер и перемещение пыльцы, в основном, происходит с северо-востока на юго-запад. Генетическая изменчивость материнских деревьев и их полусибсовых потомств по большинству локусов слабая. Влияния опылителей на интенсивность роста деревьев в полусибсовых потомствах не выявлено.

Исследовано полиморфный участок интрона (екз. В/С) гена nad 1 (NADH дегидрогеназа) митохондриальной ДНК у деревьев сосны обыкновенной горных карпатских ценопопуляций, Малого Полесья, Волынского Полесья, Донецкого кряжа, а также у климатических экотипов географических культур Расточья с помощью полимеразно-цепной реакции со специфическими праймерами. Установлено наличие только одного гаплотипа а во всех популяциях.

Выявлено стимулирование энергии прорастания семян сосны растворами новых украинских регуляторов роста (тримана-1, емистима С, агростимулина, зеастимулина). Положительный эффект эти вещества оказывали и на рост сеянцев сосны обыкновенной в высоту и в диаметре. При достижении сеянцами двухлетнего возраста общая тенденция к увеличению накопления фитомассы, обнаруженная в однолетних сеянцев, сохранялась.

Показано, что запасные белки семян сосны представлены полипептидами с молекулярными массами 46-49, 36-38, 27-29, 25-27, 22-23 та 11-16 кДа и составляют около 80 % общего содержания протеинов мегагаметофита и 50 % - зародыша. Обработка семян сосны зеастимулином, емистимом С или триман-1 существенно ускоряла скорость протеолиза запасных белков альбуминовой группы. В экстрактах из тканей проростков сосны обнаружен широкий спектр фосфорилированных по остаткам тирозина белков, который изменялся в процессе их роста и развития, что позволило предположить наличие фосфотирозиновой сигнализации у сосны. Методом аффинной хроматографии из проростков сосны выделено два фосфотирозинсвязывающих белка, идентифицированных как альдозо-1-епимераза и дефензин.

Разработано методику очистки дефензина из проростков сосны обыкновенной. Очищенный белок обладает высокой активностью против фитопатогенных грибов (Fusarium oxysporum, F. solani, Heterobasidion annosum и Botrytis cinerea, Alternaria alternatae). Ген дефензина сосны (PsDef1) клонировано и секвенировано, кодирующую нуклеотидную последовательность депонировано в GenBank (Нью-Йорк, США) под номером EF455616.1. Путем экспрессии кДНК PsDef1 в бактериальной системе получен рекомбинантный дефензин сосны в фунционально активной форме. Получены специфические поликлональные антитела против дефензина, с помощью которых обнаружено усиление экспрессии этого белка в проростках сосны при прорастании семян, а также после их инокуляции грибом Heterobasidion annosum, что указывает на возможность его использования для повышения стойкости сосны к грибным инвазиям.

Ключевые слова: сосна обыкновенная, полусибсовое потомство, генетическая изменчивость, фитогормоны, дефензин

Gout R.T. Morphogenic variability and biochemical mechanisms of the resistance of Scots pine at cenopopulations of the West Ukraine. - Manuscript.

Thesis for a Doctor's degree in biological sciences on speciality 06.03.03 - silviculture and forestry. - The National Forestry University of Ukraine. - Lviv, 2009.

The main objective of the thesis is to study genetic potential of cenopopulations of Scots pine in the Western Ukraine and the influence of phytohormones on the growth and development of Scots pine seedlings, as well as molecular mechanisms of their resistance to phytopathogens. Correlations between the radial growth of Scots pine from various plant-breeding categories in cenopopulations in the western Ukraine and annual variations in temperature and precipitation had been investigated between 1925 and 2004. To characterize inter - and intrapopulation genetic variations of Scots pine, grown in the valleys and mountains in western Ukraine, the analysis of chloroplastic and mitochondrial DNA markers has been carried out with the use of сpSSR methodology. No significant differences were observed in allels of the chloroplast DNA between cenopopulations of Scots pine grown in the valleys and mountains. The study has revealed the existence of one haplotype "a" in cenopopulations grown in the valleys and mountains in western Ukraine, Donezk region and various geographic ecotypes of Scots pine. The changes in the protein expression profile were investigated at various stages of Scots pine seeds germination in response to exogenous phytohormones. Moreover, the effect of phytohormones on morphometric, physiological and biochemical parameters of germinating seeds was studied. A novel antimicrobial protein, termed PsDef1, was discovered in Scots pine germinating seeds and its antifungal and antibacterial properties investigated. This study has provided the base for molecular cloning of a corresponding cDNA clone, expression of a recombinant protein in bacteria and generation of polyclonal antibodies specific towards PsDef1. The availability of generated antibodies allowed the investigation of PsDef1 expression in Scots pine seedlings infected with pathogenic fungi, such as Heterobasidion annosum.

Keywords: Scots pine, half-sib progeny, genetic variations, phytohormones, defensin.

Размещено на Allbest.ru