Кандидоз, аспергиллез и мукороз животных (диагностика и меры борьбы)

У животных, павших от внутрисердечного заражения, основные изменения обнаружены в респираторных органах, сердце, печени и почках. В стенках бронхов и легочных альвеолах выявлены десквамированные клетки эпителия, фрагменты псевдомицелия и макрофаги. В патологически измененных участках эндокарда и почек отмечали элементы гриба и клетки белой крови.

Аспергиллез

После внутривенного заражения и гибели кроликов основные изменения обнаруживали в легочной ткани, бронхах и бронхиолах. В легких зарегистрирована абсцедирующая некротическая пневмония, в бронхах - катаральное воспаление. При микроскопических исследованиях пораженных участков тканей легких в клетках инфильтрата в большом количестве обнаруживали фрагменты мицелия грибов со скоплением лимфоцитов, макрофагов и гистиоцитарных клеток. Кроме легочной ткани в патологический процесс были вовлечены и паренхиматозные органы: печень, почки, селезенка. В них отмечена выраженная сосудистая реакция в виде геморрагий от токсического воздействия метаболитов гриба. На почках выявлены множественные гранулемы размером с просяное зерно. Микроскопическими исследованиями гранулем установлено, что состоят они из элементов гриба и лейкоцитов. У отдельных животных на сердце обнаружены инфильтраты, состоящие из лимфоидных клеток.

После перорального заражения мицелием и спорами гриба и дачи антибиотика ампициллина основные изменения обнаружены в желудке. На его слизистой оболочке отмечено ярко выраженное катарально-десквамативное воспаление. В пораженных участках желудка выявили фрагменты мицелия гриба Aspergillus и скопление лимфоидных клеток. Некоторые нити мицелия представляли собой лишь истонченные контуры из-за лизиса их фагоцитами.

Обнаружены, несмотря на пероральный способ заражения, изменения и в респираторных органах. Отмечена интерстициальная пневмония. Междольковые и межальвеолярные перегородки были расширены и инфильтрированы клеточными элементами, альвеолы заполнены фибринозно-геморрагическим экссудатом. На значительных участках ткани легкого выявляли гранулемы с некротическим распадом.

После аэрогенного заражения поражения локализовались в легочной ткани. Стенки бронхиол и кровеносных сосудов легких были проросшими мицелием гриба. Отмечали большое скопление мицелия под пульмональной плеврой. В воспалительном экссудате выявляли, в основном, гигантские клетки.

Мукороз

После внутривенного заражения в легочной ткани, бронхиальных и средостенных лимфоузлах отмечены гранулематозные поражения. В тканях легких обнаружены макрофаги и нейтрофильные лейкоциты. Макроскопически во всех долях легких выявлены геморрагические инфаркты. В печени и на почках - опухолевидные уплотнения. В тканях почек обнаружено большое скопление лейкоцитов и элементов гриба Mucor.

Поражения после перорального заражения: слизистая оболочка желудка была набухшей и инфильтрированной серозным экссудатом. На отдельных участках выявлялись некрозы. В подслизистом слое вокруг кровеносных сосудов обнаружен мицелий. Некоторые сосуды были заполнены гифами гриба.

После аэрогенного заражения патоморфологические изменения обнаружены в легочной ткани, сердце и почках. Характер поражений был схожий с патогистологическими изменениями при внутривенном заражении, но были менее выражены. Клеточная реакция на внедрение гриба проявлялась появлением гигантских клеток, лимфоцитов и скоплением их в месте локализации возбудителя.

Таким образом, грибы в пораженных тканях органов обнаруживаются только в мицелиальной форме (без конидий). В слизистых оболочках грибные нити мицелия окружены макрофагами, нейтрофилами и лимфоидными клетками. Нити грибов в отдельных ее участках выявляются в виде контуров, что свидетельствует об их лизисе макрофагами.

Особенности фагоцитоза грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor in vitro et in vivo

Установлено, что общим для всех изучаемых грибов является активная роль нейтрофильных лейкоцитов и макрофагов, которые фагоцитировали мелкие фрагменты грибов (конидии, бластоспоры). Гифы же грибов уничтожали гигантские клетки. Исследования иммуноклеточных реакций у телят при висцеральных микозах показали, что разрушение грибов, проникших в их организм, протекает с определенной закономерностью. Вначале грибные гифы облепляются тромбоцитами, функцию фагоцитов берут на себя нейтрофильные лейкоциты и макрофаги, затем в процесс фагоцитоза подключаются лимфоидные клетки, которые лизируют гифы грибов с помощью ферментов (протеолитических и др.). Гриб при этом разрушается на фрагменты, мелкие фагоцитируются нейтрофильными лейкоцитами и макрофагами, а крупные - гигантскими клетками.

Таким образом, фагоцитоз микроскопических грибов протекает несколько специфически. Аспергиллы, мукор и кандида из-за своих больших размеров разрушаются не только и не столько самими клетками-фагоцитами, а в основном лизируются за счет ферментов, секретируемых лимфоцитами.

Ассоциированное действие грибов и бактерий на организм животных

При выделении из патматериала авирулентной культуры C. albicans и слабовирулентного штамма E. coli, но продуцирующего термолабильный токсин и последующем ассоциированном заражении мышей в 80% случаев результат биопробы был положительный. Аналогичные результаты были получены при сочетанном заражении мышей авирулентными штаммами A. fumigatus, M. racemosus и слабовирулентными культурами эшерихий, стафилококков и стрептококков.

Усиление патогенного действия ассоциаций различных грибов, их токсинов, и кокковых бактерий на лабораторных животных установлено в экспериментах на белых мышах при внутрибрюшинной инокуляции им различных сочетаний микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности.

При ассоциированном введении белым мышам токсинов плесневых грибов или эшерихий и апатогенных микроорганизмов (E. coli, A. fumigatus, M. racemosus) наступала их гибель. Наиболее выраженной вирулентностью обладала ассоциация: A. fumigatus и токсин E. coli.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при выделении из патологического материала апатогенных (слабопатогенных) штаммов грибов и бактерий необходимо учитывать возможное ассоциативное действие микроорганизмов и их токсинов на организм животных.

Культурально-морфологические и патогенные свойства штаммов грибов C. albicans, A. fumigatus и M. racemosus, выделенных из патологического материала и кормов.

Объектами выделения грибов были слизистые оболочки ротовой полости, языка, пищевода и преджелудков, а также из экссудата пораженных четвертей вымени, молока и фекалий больных телят. Выделено 126 штаммов гриба С. albicans.

В 1994 году получен штамм C. albicans, который был выделен от теленка 22-х дневного возраста и в последующем был использован при конструировании вакцинных препаратов.

По культурально-морфологическим свойствам штамм C. albicans № 253 был представлен овальными (2:1) клетками с хорошо заметными вакуолями и небольшими ядрами.

На агаре Сабуро через 48 часов культивирования при температуре 28⁰С образовывались выпуклые белые колонии с небольшим кремовым оттенком сметанообразной консистенции с гладкой блестящей поверхностью и ровными краями. На 5-е сутки культивирования колонии - гладкие матовые, с кремовым оттенком, но со слегка волнистыми краями.

При культивировании на жидких питательных средах через 48 часов заметно помутнение бульона и образование компактного осадка.

Ферментативная активность штамма проявлялась на полужидкой среде Гисса с углеводами: с глюкозой и мальтозой - образованием кислоты и газа, сахарозой - только кислоты, а с лактозой активность не проявлялась.

При внутривенном и внутрибрюшинном введении белым мышам культуры штамма в дозе 1х10⁹спор/см³ и объеме 0,5 мл, а морским свинкам внутрисердечно в дозе 3х10⁹спор/см³ и объеме 2,0 мл гибели животных не вызывало. Внутримышечное введение кроликам в дозе 3х10⁹спор/см³ и объеме 5,0 мл вызывало местную гиперемию с небольшим отеком прилежащих тканей, проходящую через 48-96 часов.

Штамм C. albicans №253 депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) г. Москва, как вакцинный.

Объектами выделения грибов A. fumigatus были язвенно-некротические поражения пищеварительного тракта, гранулемы легких, фекалии больных телят и поросят, а также грубые и концентрированные корма, контаминированные аспергиллами. Выделено 216 штаммов гриба.

В 1991 году получен штамм A. fumigatus, который был выделен из фекалий больного теленка 1,5 месячного возраста и в последующем был использован при конструировании вакцинных препаратов. По культурально-морфологическим свойствам данный штамм A. fumigatus №6 характеризуется следующими признаками:

Морфологически аспергиллы были представлены ветвящимися переплетающимися гифами 3-5 мкм ширины с поперечными перегородками. Органы плодоношения имеют фляжкообразные утолщения на концах гиф с цепочками спор по периферии. В окрашенных по Граму мазках аспергиллы представлены в виде грамположительных гиф и их фрагментов.

При культивировании штамма на агаре Сабуро через 24-48 часов роста при 37⁰С образуется беловатый, пушистый налет. Через 72-96 часов вырастает массивная колония круглой формы с зеленовато-голубоватым оттенком в центре и беловатой каймой по периферии. В бульоне Сабуро на 3-и сутки культивирования отмечается поверхностный рост культуры бархатистого вида темно-зеленого цвета.

Вирулентные свойства штамма изучены методом заражения нелинейных белых мышей. Внутрибрюшинное введение культуры штамма в концентрации до 1х10⁸спор/см³ и объеме 0,5 мл гибели мышей не вызывает. При внутривенном введении культуры в объеме 0,5 мл LD₁₀₀ - 1х10⁸спор/см³, LD₅₀ - 1х10⁷спор/см³, LD₀ - 5х10⁶спор/см³. Гибель при LD₁₀₀ и LD₅₀ на 2-5-е сутки.

В дальнейшем штамм A. fumigatus №6 исследован и депонирован в Центре эпизоотического бюро ВГНКИ и классифицирован как вакцинный.

При выделении из патологического материала и кормов культур M. racemosus и последующем инкубировании при 37⁰С на питательных средах установлено, что большинство штаммов через 3-е суток на агаре Сабуро формируют объемные пушистые колонии с мощным, хорошо развитым воздушным мицелием сероватого цвета. В бульоне Сабуро к 3-м суткам отмечали поверхностный рост культуры в виде плотных дисков с менее развитым мицелием и образованием на дне пробирки ватоподобного осадка.

Объектами выделения грибов M. racemosus служили участки желудочно-кишечного тракта с язвенными поражениями, фекалии с примесью фибрина и крови, а также грубые и концентрированные корма с признаками поражения плесневыми грибами. Всего было выделено 295 штаммов гриба.

В 1991 году получен штамм M. racemosus, который был изолирован при высеве фекалий от теленка 15-ти дневного возраста с симптомами диареи. Данный штамм в дальнейшей работе использовался как продуцент антигенов, обладающих иммуногенными свойствами.

По морфологическим свойствам штамм, которому в центре эпизоотического бюро ВГНКИ г. Москва был присвоен порядковый номер 195, характеризовался хорошо развитым несептированным мицелием, имеющим ширину до 20 мкм на всем протяжении нитей. Кроме того, штамм отличался активно ветвящимся мицелием. Спорангиеносцы гриба прямолинейные, все спорангии шаровидные, без апофизы.

При культивировании штамма на агаре Сабуро при 37⁰С рост гриба проявляется через 24 часа в виде беловатого, пушистого налета. Через 72 часа формируется объемная пушистая колония с мощным, хорошо развитым мицелием белого цвета с серо-черными вкраплениями. В бульоне Сабуро к 3-м суткам культивирования в пробирках отмечается поверхностный рост в виде плотных «войлочных» дисков с развитым мицелием и одновременным образованием ватоподобного осадка.

Вирулентные свойства штамма определены с использованием белых мышей и крыс. Установлено, что внутрибрюшинное введение 3-х суточной культуры в объеме 0,5 мл и концентрации спор 1х10⁷ в см³ гибели белых мышей не вызывает, LD₅₀ - 5х10⁷спор/см3, LD₁₀₀ - 1х10⁸спор/см³ (гибель на 4-5сутки). Внутривенное заражение белых крыс в объеме 1,0 мл и концентрации спор от 1х10⁶ до 1х10⁷ в см³ вызывает гибель на 3-и сутки, а в дозе 7х10⁷ в см³ - на 2-е сутки у 100% животных.

Штамм M. racemosus №195 депонирован после проведения комиссионных испытаний в ВГНКИ г. Москва и в дальнейшей работе использовался при конструировании вакцинных препаратов против мукороза сельскохозяйственных животных.

Научно обоснованная система противомикозных мероприятий

Разработка средств специфической профилактики и прижизненной диагностики кандидоза, аспергиллеза и мукороза

Сравнительная оценка культуральных свойств авирулентных штаммов грибов при выращивании их на различных питательных средах

Основной целью экспериментов являлась оценка питательных сред по скорости роста, получению высокого «урожая» мицелия, поддержания жизнеспособности и выживаемости, а также устойчивого уровня спорогенеза грибов и выяснение зависимости иммунобиологических свойств получаемых антигенов от сроков культивирования и фазы развития микромицетов, выращиваемых на различных по составу субстратах.

В течение 45-ти суточного культивирования отмечали динамику роста и развития грибов, как на жидких, так и на плотных питательных средах. В экспериментах испытывали жидкие и плотные среды Сабуро, Чапека, Городковой, дрожжевой и запаптентованные нами (с использованием солевого раствора Хенкса)

Так на бульоне Хенкса количество спор гриба уже к 3-м суткам культивирования, по сравнению с бульоном Сабуро, было в 1,5 раза больше. К 6 суткам это соотношение достигало уже двукратной разницы. Однако максимальное количество спор (на бульоне Сабуро - 3х10⁷клеток/см³, а на бульоне Хенкса - 5х10⁷клеток/см³) было выявлено к одному периоду времени инкубирования - 9 суткам. В последующем на всех средах отмечалась тенденция угасания спорогенеза. На бульоне Сабуро к 45-м суткам количество спор по сравнению с пиком спорообразования (9-15 сутки) было меньше в 4,8 раза, а на Хенкса - в 4,1 раза. Хотя и к этому времени количество спор на бульоне Хенкса оставалось в 2 раза больше, чем на среде Сабуро.

При анализе спорогенеза отмечаемого на агаризованных средах установлено, что к 3-м суткам на агаре Сабуро количество спор было выше, чем на субстрате Городковой (в 1,7 раза) и на Хенкса (в 1,2 раза). Однако на всех последующих этапах инкубирования наиболее интенсивное спорообразование шло на агаре, приготовленном с использованием солевого раствора Хенкса. Пик спорообразования на этой среде зафиксирован на 12-е сутки культивирования (1х10⁸клеток/см³), тогда как к этому времени на агаре Сабуро количество спор было 7х10⁷ в см³, а на субстрате Городковой - 5х10⁷клеток/см³.

Жизнеспособность и выживаемость гриба C. albicans на разных питательных средах была различной. Наиболее эффективной признана среда с компонентами солевого раствора Хенкса (табл. 2.1).

Таблица 2.1. Жизнеспособность и выживаемость C. albicans шт. №253

Питательный агар	Разведение
	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
	Жизнеспособность	Выживаемость %
Городковой	+	+	+	+	+	+	48,0
Сабуро	+	+	+	+	+	-	12,7
Хенкса	+	+	+	+	+	+	67,3

На плотной питательной среде с использованием солевого раствора Хенкса максимальный пик спорообразования депонированного штамма гриба C. albicans №253 зафиксирован к 12-м суткам культивирования. К этому же времени колонии гриба, представляющие собой как споры, так и псевдомицелий, имели характерный вид и были представлены клетками, обладающими высокой жизнеспособностью и выживаемостью при последующих пересевах на свежие питательные среды.

При выращивании гриба A. fumigatus шт. №6 на плотных питательных средах первые признаки развития в виде мелких полупрозрачных образований отмечали через 6-8 часов на агаре Хенкса, через 8-10 часов на агаре Сабуро и Чапека и через 12-14 часов на дрожжевом агаре.

В бульонах первые признаки роста гриба отмечали при культивировании на питательном субстрате Сабуро через 14-18 часов, дрожжевом и Хенкса - через 18-22 часа, на Чапека - через 24-28 часов после посева.

После первых 3-6-ти суток культивирования наиболее интенсивный процесс спорообразования идет на среде Сабуро. Однако к 9-м суткам по формированию спор уже бульон Хенкса превосходит все остальные среды. В этот же период зафиксирован первый пик максимального спорогенеза на бульонах Сабуро и Хенкса. Второй пик спорообразования на этих же средах отмечается к 12-м суткам (увеличение количества спор в 2 и 2,5 раза соответственно). Во все последующие временные отрезки уровень спорогенеза и его стабильность наиболее высоки на бульоне Хенкса.

Исследования по динамике спорогенеза на плотных питательных средах показали, что культивирование аспергилл на агарах способствует большему «урожаю» спор, но меньшему выходу мицелиальной массы.

Максимальное количество спор образуется уже к шестым суткам культивирования на всех испытуемых средах, за исключением дрожжевого агара, где пик спорообразования отмечен на 18-е сутки. Фаза максимального спорогенеза на агаре Чапека продолжается 12 суток, на Сабуро и Хенкса - 9 дней, на Дрожжевой среде - трое суток. Пиковые значения формирования спор затем сменяются фазой угнетения спорогенеза и одновременным прекращением роста и развития мицелия, что в первую очередь связано с постепенным обеднением среды и накоплением продуктов метаболизма гриба. На некоторых средах (Сабуро, Хенкса) зафиксирована повторная «вспышка» спорообразования на 33-36-е сутки культивирования с последующим резким снижением количество спор и визуально заметной инволюцией мицелия, что связано с тотальным обеднением питательных свойств субстрата.

Таким образом, при сравнении характера роста по признакам спорогенеза и формированию мицелия на жидких и плотных питательных средах можно сделать вывод, что агаризованные среды способствуют как спорогенезу, так и накоплению грибницы. Однако, при культивировании аспергилл в бульонах процесс спорообразования идет более плавно, как при достижении пиковых значений (на Сабуро к 15-м суткам, на других средах к 21-му дню), так и при понижении уровня спорогенеза. Кроме того, продукты метаболизма и аутолизиса гриба, на плотных средах диффундируют в агар, тогда как в бульонах они всегда остаются в составе культуральной жидкости.

Анализ выживаемости и жизнеспособности спор A. fumigatus №6 на 30-е сутки в сравнении с пиковыми значениями спорогенеза дал следующие результаты.

На агаре Чапека живых спор было - 12%, на дрожжевом - 17%, Сабуро 39%, Хенкса - 48%. Жизнеспособность спор в на свежей аналогичной среде отмечена во всех случаях до разведении 10^-5 включительно.

На бульоне Чапека сохранность спор составила 15%, на дрожжевом - 23%, на Сабуро - 48%, на Хенкса - 56%. Жизнеспособность спор проявлялась до разведения 10^-5 на всех испытуемых средах.

При культивировании гриба M. racemosus №195 на плотных питательных средах визуальное проявление начала формирования колоний происходило следующим образом: на дрожжевом агаре - через 8-10 часов после посева, на Сабуро и Хенкса - через 10-12 часов, на Чапека - через 16-18 часов. Скорость формирования грибницы проходила аналогичным образом. Сохранность спор гриба также зависела от питательного субстрата и составляла 13%; 45%; 51% и 46% на агаре Чапека, Сабуро, дрожжевом и Хенкса соответственно. Жизнеспособность спор была на уровне результатов, полученных в опытах по культивированию аспергилл.

Визуально начало развития гриба M. racemosus в бульонах характеризовалось помутнением среды и образованием культуральной пленки. На среде Чапека через 22-24 часа, Хенкса 16-20 часов, Сабуро - 12-14 часов, дрожжевой - 10-12 часов. Сохранность спор в бульонах составляла на среде Чапека - 14%, на Сабуро - 43%, на Дрожжевой и Хенкса - 50-51%. Показатель выживаемости имел значение - 10^-5.

Полученные результаты наблюдений по другим культуральным свойствам грибов так же, прямо или косвенно, подтверждают оптимальность той или иной питательной среды. Однако, исходя из поставленной задачи - получение высокоактивных антигенов оптимальными питательными средами были признаны субстраты Сабуро и приготовленные на основе растворов Хенкса. Данные среды наиболее универсальны и позволяют в более короткие сроки и с большей долей постоянства получать клетки грибов (обильную мицелиальную массу с достаточно высоким выходом спор). Применение этих же сред для хранения штаммов грибов позволяет проводить пересевы не чаще одного раза в месяц с сохранением достаточной степени жизнеспособности и выживаемости клеток грибов.

При изучении влияния объемов питательных сред на рост и развитие грибов, что в пробирках уже через 20-24 часа происходит образование поверхностной культуральной пленки. Количество спор увеличивается постепенно. После 68-72 часов культивирования отмечается резкая скачкообразная вспышка спорогенеза с интенсивным развитием мицелия, особенно в 48-56 часовых культурах.

При культивирование грибов в бутылях отмечена задержка формирования культуральной пленки на 12-16 часов и интенсивный спорогенез (до 6-х суток у мукора и до 9-ти - у аспергилл), по сравнению с малыми (пробирочными) объемами.

Таким образом, существенное влияние на характер роста и направленность метаболизма оказывают не только состав и агрегативное состояние питательных сред, но и их объемы.

Получение антигенов из культур грибов: С. albicans, A. fumigatus и M. racemosus

Установлено что самым эффективным и щадящим является способ разрушения клеток грибов ультразвуковой дезинтеграцией. Использование дезинтегратора с воздействием ультразвуковых волн в пределах 10-20 кГц, экспозиции 10-60 мин, в зависимости от объема культуральной жидкости, позволяло разрушать не менее 90% клеток грибов Candida и 50-60% - Aspergillus и Mucor. После разрушения мембран грибов для освобождения от поврежденных стенок и целых клеток использовали мембранные пластины типа «Владипор - МФА №3».

Разработка способа лабораторной оценки антигенов культур грибов

C. albicans №253, A. fumigatus №6 и M. racemosus №195 реакцией специфической агломерации лейкоцитов

Способ оценки иммуногенности культур грибов и антигенов из них, с использованием реакции специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ) основана на усилении склеивания (агломерирования) лейкоцитов крови донора при внесении антигена in vitro. Феномен агломерации, как и усиление амебовидной подвижности нейтрофилов, является первой фазой реакции клеток белой крови на антиген.

Методика постановки РСАЛ включает в себя несколько этапов. Вначале проводят подбор животных - доноров крови, с наименьшей естественной (физиологической) агломеративной способностью. Стабилизированную кровь разливают по 0,2 мл в пробирки Флоринского, добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки в рабочем разведении 1:20, встряхивают и инкубируют при 37⁰С в течение 1 часа.

Кровь из пробирок наносят на предметные стекла и делают тонкие мазки, которые подсушивают при комнатной температуре и фиксируют в метиловом спирте не менее 3 минут. Зафиксированные мазки окрашивают 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 минут. Окрашенные мазки просматривают под микроскопом при увеличении х450 в нескольких полях зрения и подсчитывают не менее 1000 лейкоцитов, учитывая при этом количество склеенных (агломерированных) клеток белой крови. Для каждого животного подсчитывают не менее 5 мазков.

Агломерированными считают те лейкоциты, которые склеиваются в количестве не менее трех. Кролик, кровь которого обладает наименьшей естественной агломерированной способностью, но не более 4%, используется в качестве донора. Кровь кролика-донора в последующем используют для иммунологической оценки культур грибов по индексу агломерации лейкоцитов.

Предварительно суспензии культур грибов разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5, после чего производят разрушение клеточной стенки спор и мицелия ультразвуком. Антигены в объеме 0,04 мл вносят в стабилизированную кровь и выполняют вышеописанные действия, с обязательной постановкой контролей. Контролями служат параллельная постановка реакций:

a) со стабилизированной кровью донора, антигеном, а вместо комплемента - физиологический раствор хлорида натрия.

б) стабилизированная кровь донора, комплемент, а вместо антигена - физиологический раствор хлорида натрия. При этом индекс в РСАЛ (А и Б) не должен превышать 4%.

Исследованиями антигенов культур грибов C. albicans №253, A. fumigatus №6 и M. racemosus №195 установлено, что агломеративная способность лейкоцитов при постановке реакции подвержена колебаниям в зависимости от возраста культур и плотности используемых для их выращивания питательных сред (бульоны или агары). Так для получения антигенов из грибов Candida предпочтительней использовать агаризованную среду с компонентами солевого раствора Хенкса, а для продуцирования иммуноактивных АГ грибов Aspergillus и Mucor - бульоны Хенкса. Низкий уровень агломерации лейкоцитов отмечен в пробах культур C. albicans шт. №253 с АГ 5, 6, 9, 12 и 18-ти суточных агаровых культурах. Наиболее низкий индекс зафиксирован в РСАЛ с АГ 6-ти суточной культурой - 6,0%. Наименьший показатель в РСАЛ отмечен у АГ 5-9 суточных бульонных культур - 7-8%. При постановке реакции с АГ агаровых культур аспергилл и мукора индекс агломерации лейкоцитов находился в пределах 9-32%, что значительно выше, чем у грибов Candida. Однако, АГ аспергилл, извлеченные из 15-ти суточных бульонных культур имели показатели в РСАЛ - 7,9%, а АГ гриба Mucor в 12-ти суточных культурах всего 6,9%.

Конструирование иммуногенных и аллергодиагностических препаратов из антигенов грибов: C. albicans (шт. №253), A. fumigatus (шт. №6),

M. racemosus (шт. №195)

Значительный разброс в показателях агломеративной способности грибов свидетельствовал об изменении антигенного состава кандиды, аспергилл и мукора в зависимости от возраста культур. Поэтому следующим этапом исследований было изучение иммуногенных и аллергогенных свойств АГ грибов с учетом значений индекса в РСАЛ.

С этой целью готовили препараты из АГ, давшие наименьшие и наибольшие показатели в РСАЛ. Для получения иммуногенных препаратов АГ подвергали воздействию формальдегида в 0,4% концентрации в течение 3-х недель. При изготовлении аллергенов АГ консервировали 0,25% раствором фенола.

Исследования препаратов кожно-аллергической пробой проводили на кроликах, зараженных теми или иным возбудителям висцеральных микозов. Аллергены вводили внутрикожно на 3-6 день после заражения. Учет реакции проводили через 24, 48 и 72 часа после введения аллергенов. АГ, имевшие в РСАЛ наиболее высокий индекс (свыше 20%), у больных аспергиллезом давали увеличение кожной складки 6-11 мм с ярко выраженной гиперемией, у больных мукорозом 5-9 мм, у зараженных возбудителем кандидоза - 3-4 мм. Использование в качестве аллергенов АГ с показателями в РСАЛ ниже 15% давало слабо выраженную реакцию, проходящую в течение 24 часов.

Внутримышечное введение препаратов, приготовленных по технологии вакцин из АГ, имевших различный индекс в РСАЛ, дало прямо противоположные результаты. АГ, имевшие показатели в РСАЛ от 6 до 16%, обладали наибольшей иммуногенной активностью, обеспечивая при этом высокий уровень защиты кроликов и морских свинок при их последующем контрольном заражении.

Следует подчеркнуть, что величина индекса в РСАЛ в 6-% получена при культивировании C. albicans шт. №253 на агаре Хенкса в течение 6-ти суток при t⁰ 28⁰C, а A. fumigatus шт. №6 и M. racemosus № 195 при выращивании их в бульоне Хенкса при t⁰C 37⁰С в течение 15 и 12 суток соответственно (в матрасах и бутылях).

Таким образом, исходя из вышеизложенного, АГ грибов Candida (шт. №253) при величине индекса агломерации в РСАЛ (6-10%) проявляли иммуногенные свойства, АГ грибов Aspergillus (шт. №6) при 6-16%, АГ грибов Mucor (шт. №195) при показателях в 6-15%. При величине в РСАЛ свыше 16%, вакцинные свойства грибов снижались, а их аллергенная активность наоборот возрастала.

Технология получения иммуногенных препаратов из антигенов грибов C. albicans (шт. №253), A. fumigatus (шт. №6) и M. racemosus (шт. №195)

В результате проведенных исследований разработана унифицированная технология изготовления противомикозных вакцин.

Получение вакцины против кандидоза и оценка ее иммуногенности

Штамм гриба C. albicans №253 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 28⁰С в течение 3-х суток. Затем культуру штамма смывают физиологическим раствором хлористого натрия и высевают на матрасы с питательным агаром, приготовленным с использованием солевого раствора Хенкса. Проводят дальнейшее культивирование в термостате при 28⁰С в течение 6-ти суток. Полученную культуру смывают дистилированной водой из расчета 25,0 мл на каждый матрас. Определяют концентрацию спор (обычно колеблется в пределах 8х10⁸-1х10⁹спор/см³). Концентрацию спор затем доводят до 4,5х10⁸-5,5х10⁸ м. т. в см³ дистиллированной водой.

Выделяют АГ из клеточной стенки и цитоплазмы полученной суспензии гриба, используя метод разрушения микроорганизмов с помощью ультразвукового дезинтегратора больших объемов - «Solana» (Erlan industries). Воздействие дезинтегратором осуществляют при длине волны 10-20 кГц и экспозиции 60 минут. Освобождение от разрушенных и не разрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану «Владипор» МФА-МА №3 при помощи вакуумнасоса. Полученный фильтрат представляет собой растворимый комплекс белковополисахаридных антигенов.

Проводят оценку полученных АГ по индексу агломерации лейкоцитов.

Для этого фильтрат разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5. В пробирки вносят по 0,04 мл антигенсодержащего материала и туда же добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки. Смесь выдерживают 30 минут при 37⁰С, затем вносят по 0,2 мл цитратной крови кролика-донора. При этом контролем служат пробирки с антигеном, а вместо комплемента - тот же объем физиологического раствора и стабилизированную кровь кролика. Другим контролем служат пробирки со стабилизированной кровью кролика, комплемент морской свинки и изотонический раствор хлорида натрия, вместо антигена. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют при 37⁰С в течение 45 минут.

Смесь из пробирок наносят на предметные стекла и делают мазки, которые подсушивают, а затем фиксируют метиловым спиртом в течение 20 минут. Окраску мазков проводят 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 минут.

Окрашенные мазки просматривают при увеличении микроскопа х450. Для анализа выбирают 100 лейкоцитов и выявляют среди них число агломерированных (склеенных в конгломерат в количестве не менее 3). При наличии склеенных (агломерированных) лейкоцитов от 6 до 10% от общего числа подсчитанных 100, АГ считаются потенциально иммуногенными и соответственно пригодными для дальнейшей работы по созданию вакцины.

К АГ, имеющим индекс в РСАЛ 6-10%, добавляют формалин в конечном разведении смеси - 0,4%.

В АГ - формалиновый комплекс вносят адъювант - 6% раствор гидроокиси алюминия в соотношении 10:1.

Комплекс: АГ - формалин - адъювант помещают в термостат и инкубируют при температуре 37⁰С в течение 21 суток.

На конечном этапе проводят оценку иммуногенных свойств вакцины.

Для этого полученный препарат вводят в дозе: мышам и морским свинкам - по 0,5 мл и кроликам - 1,5 мл внутримышечно. Вакцину вводят двукратно с 7-10-ти дневным интервалом. Напряженный иммунитет наступает через 14 дней после ревакцинации.

Оценку напряженности иммунитета проводят с использованием внутривенного заражения для кроликов и мышей и внутрисердечного для свинок. Для заражения используют бласто- и хламидоспоры трехсуточной вирулентной культуры C. albicans с концентрацией 3х10⁹спор в 1см³ и объеме: мышам и морским свинкам - по 0,5 мл и кроликам - по 1 мл.

Для серологической оценки гуморального иммунитета используют реакцию преципитации (РП) и иммуноферментные тест-системы (ИФТС) производства НПО «Аквапласт» (г. Санкт-Петербург). Кровь для исследований берут от иммунированных кроликов через 14 суток после ревакцинации. Титр специфических АТ в РП достигает значений 1:8-1:16, в ИФТС-1:3125.

Получение вакцины против аспергиллеза и оценка ее иммуногенности

Технология приготовления вакцины против аспергиллеза аналогична способу получения противокандидозного препарата, за исключением:

Используется штамм гриба A. fumigatus №6, который вначале также засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 37⁰С в течение 3-х суток. Количество засеваемых пробирок делается из расчета - 1 пробирка на 1 литр бульона, приготовленного на растворе Хенкса. Дальнейшее культивирование проводят в 10-ти литровых микробиологических бутылях при t⁰ 37⁰C в течение 15-ти суток. Определяют концентрацию спор. «Урожай» спор обычно достигает: 2,5-3,0х10⁸ клеток на 1см³.

Выделение АГ аналогично описанному в получении АГ из грибов Candida.

3. Ход проведения оценки полученных АГ идентичен описанному при анализе АГ грибов Candida. Однако АГ считаются иммуногенными и соответственно пригодными для дальнейшей работы при индексе в РАЛ от 6 до 16%.

К АГ, имеющим агрегативную способность 6-16%, добавляют формалин.

Аналогично, как и при приготовлении вакцины против кандидоза.

Аналогично, кандидозной вакцины.

Оценка иммуногенных свойств вакцины. Вакцину вводят кроликам внутримышечно в дозе 2,5 мл двукратно с 8-10-ти дневным интервалом. Напряженный иммунитет наступает через 14 дней после ревакцинации. Учитывая, что в естественных условиях возбудитель аспергиллеза проникает в организм алиментарным путем, поражая при этом органы пищеварительного тракта, оценку напряженности иммунитета проводят с использованием перорального заражения кроликов, вакцинированных по описанной выше схеме. С помощью интрагастрального зонда в желудок кроликов вводят культуру вирулентного штамма A. fumigatus с концентрацией возбудителя 1,0х10⁶спор/см³ и в объеме вводимой суспензии клеток гриба - 10,0 мл.

У невакцинированных животных клинические признаки заболевания (отказ от корма, расстройство пищеварения, явления угнетения нервной системы) проявляются через 3-4 суток после заражения. Гибель интактных кроликов наступает через 3-6 суток после появления первых клинических признаков болезни. У вакцинированных животных клинические симптомы заболевания отсутствуют.

Серологическую оценку гуморального иммунитета проводят также с использованием РП и ИФТС. Кровь для исследований берут от иммунизированных и для контроля от интактных кроликов через 14 суток после ревакцинации. Титр специфических АТ в РП достигает значений 1:8-1:16, в ИФТС - 1:3125.

Получение вакцины против мукороза и оценка ее иммуногенности

Технология приготовления вакцины против мукороза во многом аналогична способу получения противоаспергиллезного препарата. Однако имеются и различия:

1. Используется штамм гриба M. racemosus №195. После культивирования в бульоне Хенкса в течение 12-ти суток «урожай» спор обычно колеблется в пределах 0,5-0,6х10⁶спор/см³.

2, 3, 4, 5 и 6 этапы выполняются аналогично описанным в способе приготовления вакцины против аспергиллеза.

7. Оценку иммуногенных свойств полученного препарата проводят на кроликах. Вакцину вводят внутримышечно двукратно в дозе 2,5 мл. Интервал между введениями 7-10 дней. Напряженный иммунитет наступает через 2 недели после реиммунизации. Контрольное заражение проводят перорально культурой вирулентного штамма M. racemosus c концентрацией спор возбудителя 1,0х10⁶спор/см³ и в объеме вводимой суспензии клеток гриба - 10,0 мл.

У невакцинированных животных клинические признаки заболевания (отказ от корма, диарея, симптомы расстройства в центральной нервной системе и т.д.) проявляются на 5-7 сутки после заражения. Гибель животных на 10-20 сутки после появления признаков заболевания. У вакцинированных животных признаки болезни отсутствуют или проявляются снижением аппетита и быстропроходящей диареей).

Серологическую оценку гуморального иммунитета проводят постановкой только РП из-за отсутствия других методов. РП с сывороткой крови иммунизированных животных достигает значений 1:8 - 1:16, а интактных - не выше 1:4.

Антигены, использованные для конструирования кандидозной, аспергиллезной и мукорозной вакцин были подвергнуты биохимическим исследованиям. Результаты исследований представлены в таблицах 2.2-2.4.

Таблица 2.2. Характеристика антигенов грибов по липидному составу

№ п.п.	Наименование и состав компонентов	Антигены
		A. fumigatus №6	M. racemosus №195	C. albicans №253
1.	Общее содержание липидов, %	2,24	2,05	0,22
Содержание кислот в % к общим липидам
2.	Линолевая кислота	1,50	11,5	2,05
3.	Линоленовая кислота	5,31	3,77	5,22
4.	Олеиновая кислота	76,8	66,5	76,2
5.	Насыщенные кислоты	17,9	14,7	15,8

Таблица 2.3. Характеристика антигенов грибов по составу углеводов

№ п.п.	Наименование углеводов	Антигены
		количество углеводов, мг%
		A. fumigatus №6	M. racemosus №195	C. albicans №253
1.	Моносахариды	0,24	49,1	49,5
2.	Дисахариды	1395	1379	14,0
3.	Полисахариды	н/о	н/о	76,0

Таблица 2.4

Характеристика антигенов грибов по полипептидному составу

№ п.п.	Наименование компонентов	Антигены
		A. fumigatus №6	M. racemosus №195	C. albicans №253
		Состав компонентов, мг %
1.	Общий азот	31,2	28,8	3,7
2.	Полипептиды с М. м. > 10 кД	134,2	12,4	86,4
3.	Полипептиды с М. м. 5,0 - 10 кД	8,1	7,1	1,1
4.	Полипептиды с М. м. 1,5-5,0 кД	20,0	21,4	2,5
5.	Полипептиды с М. м. < 1,5 кД	142,8	128,5	17,1

Белки антигенов гриба A. fumigatus шт. №6 имели основные пептиды с М. м. 15,25,35,75 и 100 кД.

В антигенах грибов M. racemosus №195 превалировали белковые структуры с М.м. 75-50 кД., а также незначительное количество с М. м. 25 кД.

Белки грибов C. albicans шт. №253 были представлены в основном полипептидами с молекулярной массой 75 кД.

В исследованных образцах большее количество пептидов приходилось и на низкомолекулярные соединения (М.м.<1500Д и от 1500 до 5000Д).

Технология получения аллергодиагностических препаратов из антигенов грибов C. albicans (шт. №253), A. fumigatus (шт. №6) и M. racemosus (шт. №195) и испытание их на лабораторных животных.

При проведении сравнительной оценки спорообразования было установлено, что максимальное количество спор при культивировании C. albicans (шт. №253) формировалось к 18-21-м суткам (2х10⁹спор/см³), A. fumigatus (шт. №6) к 6-9-м суткам (3х10⁸спор/см³) и M. racemosus (шт. №195) к 18-м суткам (8х10⁷спор/см³). В указанные сроки коэффициент РСАЛ у всех изучаемых грибов достигал значений не менее 21-23%.

Получение кандидозного аллергена

Штамм гриба C. albicans №253 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 28⁰С в течение 3-х суток. Выросшую культуру штамма смывают физиологическим раствором хлористого натрия и высевают в матрасы также с агаром Сабуро. Проводят дальнейшее культивирование в термостате при 28⁰С в течение 18-21-х суток. Полученную культуру смывают дистиллированной водой из расчета 25,0 мл на каждый матрас. Определяют концентрацию спор. Количество спор обычно колеблется в пределах 2 млрд 100 млн - 2 млрд 200 млн спор/см³.

Выделяют АГ используя ультразвуковой дезинтегратор. Воздействие дезинтегратора осуществляют при длине волны 20 кГц и экспозиции 90 минут. Освобождение от разрушенных и неразрушенных вегетативных и споровых клеток проводят методом фильтрации через мембрану «Владипор МФА-МА №3» при помощи вакуум насоса. Отфильтрованный дезинтеграт содержит АГ гриба.

Проводят оценку полученных АГ по индексу агломерации лейкоцитов. При наличии агломерированных лейкоцитов не менее 20% и выше АГ считаются аллергенными.

К АГ, имеющим коэффициент в РСАЛ 20% и выше, добавляют в качестве консерванта раствор фенола в 2,5% конечной концентрации.

На конечном этапе проводят оценку аллергенных свойств полученного препарата на белых мышах.

Для этого на 3-и сутки после внутрибрюшинного заражения белых мышей вирулентным штаммом C. albicans в дозе 1х10⁶спор/см³ и объеме 0,5 мл аллерген вводят внутрикожно с внутренней стороны бедра в количестве 0,05 мл. Учет реакции проводят через 24-48 и 76 часов. В качестве контроля используют интактных животных. У зараженных возбудителем кандидоза мышей через сутки отчетливо выражена гиперемия, повышенная температура кожи в месте введения аллергена и увеличение кожной складки на 1-3 мм, которая сохраняется не менее трех суток. У интактных мышей через 24 часа на месте введения аллергена реакция отсутствует.

Получение аспергиллезного аллергена

Технология приготовления аспергиллезного аллергена аналогична способу получения кандидозного препарата за исключением:

Используется штамм гриба A. fumigatus № 6, который вначале также на 3-е суток засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют при 37⁰С, а затем в матрасах в течение 6-9 суток и достижения «урожая» спор 300 млн клеток/см³.

2-3 п.п. Выделение АГ и их оценку проводят аналогично описанному выше при работе с грибом C. albicans.

К АГ с коэффициентом в РСАЛ 20% и выше в качестве консерванта вносят раствор фенола в 2,5% конечной концентрации.

На последнем этапе проводят оценку аллергенных свойств полученного препарата на лабораторных животных.

Для этого на 3-и сутки после внутрибрюшинного заражения белых мышей вирулентным штаммом A. fumigatus в дозе 1х10⁶спор/см³ в объеме 0,5 мл аллерген вводят внутрикожно в количестве 0,05 мл. Учет реакции проводят аналогично описанному при испытании кандидозного аллергена.

Получение мукорозного аллергена

Используется штамм гриба M. racemosus №195. Полученный посевной материал после трехсуточного культивирования при 37⁰С в пробирках засевают в матрасы и инкубируют еще 18 суток. Концентрация спор к этому времени достигает 80 млн клеток/см³.

2-4 п.п. Выполняются аналогично описанным при работе с грибами

C. albicans и A. fumigatus.

5. Оценку аллергенных свойств полученного препарата проводят также с использованием белых мышей. Для этого на 3 суток после внутрибрюшинного заражения вирулентным штаммом M. racemosus в дозе 1х10⁶спор/см³ и объеме 0,5 мл аллерген белым мышам вводят в дозе 0,05 мл. Учет реакции проводят аналогично кандидозного аллергена. Биохимический состав аллергенов представлены в таблицах 2.5-2.6.

Таблица 2.5.

Характеристика антигенов (аллергенов) грибов по составу полипептидов

№ п.п.	Наименование компонентов	C. albicans, шт. №253	A. fumigatus, шт. №6	M. racemosus, шт. №195
		количество, мг%
1	Общее содержание азота	10,7	64,3	59,1
2	Полипептиды с Мм > 250 кД	51,4	156,3	149,1
3	Полипептиды с Мм 150-250 кД	31,6	53,1	49,4
4	Полипептиды с Мм 50-150 кД	2,6	4,3	4,1
5	Полипептиды с Мм < 50 кД	0,8	2,0	1,4

Таблица 2.6.

Состав и свойства аллергенов грибов

Род, вид и штамм гриба	Общее содержание липидов, %	Соотношение белок/углеводы
C. albicans, шт. №253	0,29	1/4
A. fumigatus, шт. №6	12,6	1/3
M. racemosus, шт. №195	11,4	1/2

Антигены гриба C. albicans (шт. №253) отличаются от АГ плесневых грибов (M. racemosus шт. №195 и A. fumigatus шт. №6) по общему содержанию белкового азота. Соотношение же полипептидов с различной молекулярной массой (М.м.) примерно равное у АГ всех грибов. Основные пептиды аллергенов имеют М.м. > 250 кД.

В составе аллергенов как дрожжеподобных, так и плесневых грибов отмечено повышенное содержание липидных компонентов.

При отработке дозы внутрикожно вводимых аллергенов было установлено, что оптимальный объем - 0,2 мл. При этой дозе отчетливая кожно-аллергическая реакция проявляется в 100% случаев у зараженных возбудителем того или иного микоза. Постановка кожно-аллергических проб возможна уже на 2-3 сутки после заражения. Учет реакции можно проводить через 24 часа после инъецирования аллергенов. Оптимальный срок - 48-72 часа.

У больных аспергиллезом кроликов увеличение кожной складки варьирует от 6 до 11 мм с ярко выраженной гиперемией, у больных мукорозом от 5 до 9 мм, у зараженных возбудителем кандидоза от 3 до 6 мм. У ммунизированных мукорозной и аспергиллезной вакциной кожно-аллергическая проба (КАП) тоже дает положительную реакцию, проявляющуюся увеличением складки на 3-4 мм. У кроликов, иммунизированных противокандидозным препаратом, реакция на введение аллергена выражается покраснением, повышением местной температуры и незначительным увеличением кожной складки. Аллергическая реакция у вакцинированных тем или иным препаратом кроликов сохраняется не менее трех месяцев после иммунизации. Перекрестное введение аллергенов не давало ложноположительных результатов. У кроликов с хроническим течением микозов КАП проявлялся в течение двух месяцев болезни. У клинически здоровых животных испытуемые аллергены не давали положительных реакций.

Изучение аллергенных, пирогенных и реактогенных свойств противогрибковых вакцин

Для изучения пирогенных и реактогенных свойств вакцин, тест-дозу в объеме 1 см³ вводили внутривенно (Г.Ф. ХI, выпуск 2, с. 183).

Испытания проводили на 15 клинически здоровых кроликах. Вакцины вводили в краевую ушную вену. Разница в температурах до введения препаратов и после не превышала ±0,2^оС на всем протяжении испытаний.

Реактогенность препаратов определяли методом клинических визуальных наблюдений и исследований. Отклонений от физиологических показателей отмечено не было.

Аналогичные исследования проводились на 20 клинически здоровых телятах и 60 поросятах. Возраст телят от 1 до 4-х месячного, поросят - 1-3 месяца.

Аллергенность препаратов изучали внутрикожным введением в дозах от 0,1 до 0,5 мл. Пирогенные и реактогенные свойства экспериментальных вакцин изучали внутривенным введением в дозе 1 см ³.

После внутривенного введения вакцин, каких-либо изменений в состоянии животных, а также в их поведении не отмечали. Динамика нарастания массы тела животных в опытных и контрольных группах не различались. Физиологические показатели животных (температура тела, пульс, частота дыхания, а также частота сокращения рубца у телят), опытных групп соответствовали контрольным. Гибели животных опытных групп не отмечали.

Однократное подкожное и внутримышечное введение телятам (возраст 3 мес.) кандидозной вакцины в дозе от 1 до 10 мл., и поросятам (возраст 4 мес.) в дозе от 1 до 5 мл., а также аспергиллезной и мукорозной вакцины в дозе от 1 до 5 мл., изменений в физиологических показателях и поведении не вызывало.

Установлено, что подкожное инъецирование в отдельных случаях вызывает припухлость в месте введения препаратов, которая исчезает в течение 6-12 часов при использовании объемов вакцин менее 5 мл. и в течение 18-24 часов при дозе от 5 до 10 мл.

Двух- и трехкратное инъецирование препаратов с интервалом между введениями в 5 - 10 дней телятам в дозе от 1 до 5 мл. в возрасте 1 - 4 мес. (ж.м. 30 - 60 кг.), а также поросятам в дозе от 1 до 3 мл. в возрасте 1 - 2 мес. (ж.м. от 6 до 30 кг), реактогенностью, пирогенностью и аллергенностью не обладало.

Гематологические, иммунологические и биохимические показатели у лабораторных и сельскохозяйственных животных, вакцинированных противокандидозными, противоаспергиллезными и противомукорозными препаратами.

Исследования крови кроликов проводили до вакцинации и через 14 дней после реиммунизации. Вакцины вводили внутримышечно в дозах - 1,5 мл. Интервал между вакцинациями - 7- 10 дней.

Установлено, что изменения после введения кандидозной вакцины характеризуются повышением количества: гемоглобина на 8 г/л, лейкоцитов на 0,8х10⁹/л; увеличением относительного содержания палочкоядерных нейтрофилов с 4,6 до 5,8%, моноцитов с 2,8 до 3,4%, при снижении количества эозинофилов с 2,2 до 1,6% и базофилов - до 0 (не определены).

Изменение тех же показателей крови кроликов после реиммунизации аспергиллезной вакциной имели аналогичный характер: увеличение содержания гемоглобина на 8 г/л, количества лейкоцитов - на 1,0х10⁹/л, моноцитов с 4,8 до 6,0% и снижение эозинофилов с 2,2 до 1,8%.

После вакцинации кроликов мукорозной вакциной обнаружено достоверное увеличение содержания гемоглобина крови на 5 г/л, лейкоцитов на 0,7х10⁹/л, моноцитов с 6,2 до 7,6% и снижение содержания эозинофилов с 2,2 до 1,8%.

Иммунологические и биохимические исследования крови кроликов после вакцинации противокандидозными препаратами характеризовались повышением общего количества Т-лимфоцитов - на 7,6%, Т-активных клеток на 7,2%, Т-хелперов - на 9,6%, ЦИКов - на 4 у.е., снижением Т-супрессоров на 2%. Отмечено падение уровня альбуминов - на 13%, при соответствующем возрастании глобулиновой фракции (13%), -глобулинов - на 3,6%, -глобулинов - на 7,8%. После двукратной иммунизации кроликов аспергиллезной вакциной изменения иммунологических и биохимических показателей были следующими: отмечено увеличение содержания Т-лимфоцитов - на 7,8%, Т-активных - на 7,8%, Т-хелперов - на 10,6%, соотношение Т-х/Т-с возрастало на 3,2%, ЦИКов - на 3,2% при снижении Т-супрессоров на 3,0%.

Изменение соотношения белковых фракций выражалось в снижении альбуминов - на 9,8%, с соответствующим увеличением глобулинов - 9,8%, -глобулинов - на 4,0%, -глобулинов - на 6,0%.

Биохимические показатели крови после иммунизации мукорозной вакциной были следующими: снизилось содержание альбумина на 14,2% и соответственно увеличилось относительное содержание глобулинов: -глобулинов - на 3,8%, -глобулинов - на 9,8%.

Иммунологические показатели в поствакцинальном периоде: общее содержание Т-лимфоцитов возросло на 5,8%, Т-активных - на 12,8%, Т-хелперов - на 11,8%, ЦИКов - на 4,0у.е.; снизилось содержание Т-супрессоров на 5,8%; соотношение Т-х/Т-с увеличилось на 5,0 единиц.

Иммунологические и биохимические показатели крови морских свинок, иммунизированных противокандидозными препаратами, выражались увеличением общего количества Т-лимфоцитов - на 8,8%, Т-активных - на 6,6%, В-лимфоцитов - на 4,4%. Биохимическими исследованиями зафиксировано снижение уровня альбуминов - на 6,6%, увеличением общего белка плазмы - на 5,6%, -глобулинов - на 6,6% и -глобулинов - на 6,0%.

После двукратной иммунизации морских свинок аспергиллезной вакциной отмечено нарастание общего количества Т-лимфоцитов - на 5,8%, Т-активных - на 7,2%. В биохимических показателях крови произошло снижение альбуминовой фракции на 10,4% при одновременном увеличении глобулинов (-глобулинов - на 2,4%, -глобулинов - на 4,8%.