Атомно-силовая микроскопия

2

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

КАФЕДРА МЕДИЦИНСКОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ

Реферат:

Атомно-силовая микроскопия

Подготовил

Трус Алексей гр.122

Минск БГМУ 2010

Содержание

• 1. Атомно-силовой микроскоп
• 2. Принцип работы
• 3. Кантилевер
• 4. Особенности работы
• 5. Биомедицинские приложения сканирующей зондовой микроскопии
• 6. Список литературы

1. Атомно-силовой микроскоп

Атомно-силовой микроскоп был изобретён в 1986 году Гердом Биннигом и Кристофом Гербером в США. Атомно-силовой микроскоп применяется для измерения рельефа поверхности, модификации поверхности, а также для манипулирования микро- и нанообъектами на поверхности.

Атомно-силовой микроскоп (АСМ, англ. AFM - atomic-force microscope) - сканирующий зондовый микроскоп высокого разрешения, основанный на взаимодействии зонда кантилевера с поверхностью исследуемого образца.

Обычно под взаимодействием понимается притяжение или отталкивание зонда кантилевера, вызванное силами Ван-дер Ваальса. При использовании специальных кантилеверов можно изучать электрические и магнитные свойства поверхности. В отличие от сканирующего туннельного микроскопа, с помощью АСМ можно исследовать как проводящие, так и непроводящие поверхности. Кроме того, АСМ способен измерять рельеф образца, погружённого в жидкость, что позволяет работать с органическими молекулами, включая ДНК. Пространственное разрешение атомно-силового микроскопа зависит от радиуса кривизны кончика зонда. Разрешение достигает атомарного по вертикали и существенно превышает его по горизонтали.

2. Принцип работы

Принцип действия атомного силового микроскопа (АСМ) основан на использовании сил атомных связей, действующих между атомами вещества.

Рис.1. Принцип действия атомного силового микроскопа (АСМ)

Наиболее часто энергию ван-дер-ваальсова взаимодействия двух атомов, находящихся на расстоянии r друг от друга, аппроксимируют степенной функцией - потенциалом Леннарда-Джонса:

U_LD = U₀ {-2 (r₀/r) ⁶ + (r₀/r) ¹²}

На малых расстояниях между двумя атомами (около одного ангстрема, 1 ? = 10-8 см) действуют силы отталкивания, а на больших - силы притяжения. Совершенно аналогичные силы действуют и между любыми сближающимися телами. В сканирующем атомном силовом микроскопе такими телами служат исследуемая поверхность и скользящее над нею острие. Обычно в приборе используется алмазная игла, которая плавно скользит над поверхностью образца (как говорят, сканирует эту поверхность). При изменении силы F, действующей между поверхностью и острием, пружинка П, на которой оно закреплено, отклоняется, и такое отклонение регистрируется датчиком D. В качестве датчика в АСМ могут использоваться любые особо точные и чувствительные - прецизионные - измерители перемещений, например оптические, емкостные или туннельные датчики. На рисунке показан именно последний тип датчика, - фактически это такая же игла, какая применяется в сканирующем туннельном микроскопе. Величина отклонения упругого элемента (пружинки) несет информацию о высоте рельефа - топографии поверхности и, кроме того, об особенностях межатомных взаимодействий. Можно сказать, что в атомном силовом микроскопе сканирование исследуемого образца происходит по "поверхности постоянной силы", тогда как в СТМ - по поверхности постоянного туннельного тока. Принципы же прецизионного управления, основанного на обратной связи и улавливающего самые ничтожные изменения рельефа поверхности, в СТМ и АСМ практически одинаковы.

На рисунке изображена схема атомного силового микроскопа. О - острие (игла, кантилевер), П - пружина, на которой оно закреплено; P, Px, Py, Pz - пьезоэлектрические преобразователи. При этом Px и Py служат для сканирования образца под иглой, а Pz управляет расстоянием от острия до поверхности, D - туннельный датчик, который регистрирует отклонения пружинки с острием.

3. Кантилевер

Кантилевер в сканирующем электронном микроскопе (увеличение 1000Ч)

Кантилевер представляет собой массивное прямоугольное основание, размерами примерно 1,5Ч3,5Ч0,5 мм, с выступающей из него балкой (собственно кантилевером), шириной порядка 0,03 мм и длиной от 0,1 до 0,5 мм. Одна из сторон балки является зеркальной (иногда для усиления отражённого лазерного сигнала на неё напыляют тонкий слой алюминия), что позволяет использовать оптическую систему контроля изгиба кантилевера. На противоположной стороне балки на свободном конце находится игла, взаимодействующая с измеряемым образцом. Форма иглы может значительно изменяться в зависимости от способа изготовления. Радиус острия иглы промышленных кантилеверов находится в пределах 5-90 нм, лабораторных - от 1 нм.

Как правило, вся конструкция, за исключением, быть может, иглы, является кремниевым монокристаллом. Также кантилеверы изготавливают из нитрида кремния (Si₃N₄) или полимеров. Процесс производства схож с производством кремниевого электронного оборудования, и включает сухое либо жидкофазное вытравливание подложки. Таким образом, кантилеверы удобны для массового производства.

Следующие два уравнения являются ключевыми для понимания принципа работы кантилеверов. Первое - так называемая формула Стоуни, которое связывает отклонение конца балки кантилевера д с приложенным механическим напряжением у:

где н - коэффициент Пуассона, E - модуль Юнга, L - длина балки, и t - толщина балки кантилевера. Отклонение балки регистрируется чувствительными оптическими и емкостными датчиками.

Второе уравнение устанавливает зависимость коэффициента упругости кантилевера k от его размеров и свойств материала:

где F - приложенная сила, и w - ширина кантилевера. Коэффициент упругости связан с резонансной частотой кантилевера щ₀ по закону гармонического осциллятора:

.

Изменение силы, приложенной к кантилеверу может привести с сдвигу резонансной частоты. Сдвиг частоты может измерен с большой точностью по принципу гетеродин.

Одной из важных проблем при практическом использовании кантилевера является проблема квадратичной и кубической зависимости свойств кантилевера от его размеров. Эти нелинейные зависимости означают, что кантилеверы довольно чувствительны к изменению параметров процесса. Контроль остаточной деформации также может представлять сложность.

4. Особенности работы

В сравнении с растровым электронным микроскопом (РЭМ) атомно-силовой микроскоп обладает рядом преимуществ. Так, в отличие от РЭМ, который даёт псевдо трёхмерное изображение поверхности образца, АСМ позволяет получить истинно трёхмерный рельеф поверхности. Кроме того, непроводящая поверхность, рассматриваемая с помощью АСМ, не требует нанесения проводящего металлического покрытия, которое часто приводит к заметной деформации поверхности. Для нормальной работы РЭМ требуется вакуум, в то время как большинство режимов АСМ могут быть реализованы на воздухе или даже в жидкости. Данное обстоятельство открывает возможность изучения биомакромолекул и живых клеток. В принципе, АСМ способен дать более высокое разрешение, чем РЭМ. Так было показано, что АСМ в состоянии обеспечить реальное атомное разрешение в условиях сверхвысокого вакуума. Сверхвысоковакуумный АСМ по разрешению сравним со сканирующим туннельным микроскопом и просвечивающим электронным микроскопом.

К недостатку АСМ при его сравнении с РЭМ также следует отнести небольшой размер поля сканирования. РЭМ в состоянии просканировать область поверхности размером в несколько миллиметров в латеральной плоскости с перепадом высот в несколько миллиметров в вертикальной плоскости. У АСМ максимальный перепад высот составляет несколько микрон, а максимальное поле сканирования в лучшем случае порядка 150Ч150 микронІ. Другая проблема заключается в том, что при высоком разрешении качество изображения определяется радиусом кривизны кончика зонда, что при неправильном выборе зонда приводит к появлению артефактов на получаемом изображении.

Обычный АСМ не в состоянии сканировать поверхность также быстро, как это делает РЭМ. Для получения АСМ-изображения, требуется от нескольких минут до нескольких часов, в то время как РЭМ после откачки способен работать практически в реальном масштабе времени, хотя и с относительно невысоким качеством. Из-за низкой скорости развёртки АСМ получаемые изображения оказываются искажёнными тепловым дрейфом, что уменьшает точность измерения элементов сканируемого рельефа.

Кроме термодрейфа АСМ-изображения могут также быть искажены из-за таких свойств пьезокерамики, как нелинейность, крип и гистерезис и перекрёстными паразитными связями, действующими между X, Y, Z-элементами сканера. Для исправления искажений в реальном масштабе времени современные АСМ используют программное обеспечение (например, особенность - ориентированное сканирование) либо сканеры, снабжённые замкнутыми следящими системами, в состав которых входят линейные датчики положения. Некоторые АСМ вместо сканера в виде пьезотрубки используют XY и Z-элементы, механически несвязанные друг с другом, что позволяет исключить часть паразитных связей.

5. Биомедицинские приложения сканирующей зондовой микроскопии

Тщательное и аккуратное применение сканирующей зондовой микроскопии позволяет получить полезную информацию об объектах живой природы нанометрового размера. Обаяние зондовой микроскопии лежит не только в информативности и наглядности метода, но и в возможности играть роль не только пассивного наблюдателя, но и активного творца, работающего на уровне отдельных атомов и молекул.

Наблюдение основной биологической молекулы - ДНК - в зондовом микроскопе хотя и стало тривиальной работой но, тем не менее, требует определенных навыков и умения. При этом следует учитывать, что наблюдаемые размеры и конформация молекулы зависят от способа нанесения и выбранной подложки. Так, изображения ДНК на слюде дают в атомно-силовой микроскопии заниженную высоту по сравнению с наблюдениями на подложке графита. Кроме того, закрепление ДНК на модифицированной поверхности графита позволяет получать устойчивые изображения и в туннельном микроскопе. Атомно-силовая микроскопия ДНК в жидкости позволила определить характер конформационных переходов этой молекулы в компактную торроидальную форму.

Наблюдения однонитевой РНК было проведено как на поверхности слюды, так и графита. Надежные изображения РНК были получены при диссоциации вируса табачной мозаики - постепенном высвобождении РНК из белковой оболочки. Изучение морфологии и стабильности вирусов является важным вопросом вирусологии при исследовании молекулярных механизмов вирусных инфекций.

Изучение основных механизмов роста белковых кристаллов было проведено совместно с научной группой профессора Л.Н. Рашковича (физический факультет МГУ) и было направлено как на развитие технологии получения совершенных кристаллов белка, так и на изучение основных закономерностей их роста. Атомно-силовая микроскопия высокого разрешения поверхности кристалла лизоцима позволила определить основные кинетические параметры: скорость движения ступеней и изломов на ступенях, вероятность присоединения и отсоединения отдельных белковых молекул, а также статистические параметры шероховатости граней и ступеней. Было обнаружено новое явление для белковых кристаллов - реконструкция поверхности грани (010) лизоцима ромбической модификации, что приводит к удвоению размеров элементарной ячейки.

Изображение бактериальной клетки Helicobacter pylori.

Атомно-силовая микроскопия является информативным методом для описательной микробиологии, в частности, позволяет составлять атласы трехмерных изображений бактерий, проводить количественный анализ их морфологических и механических свойств. На рис.1 представлено изображение бактерий Helicobacter pylori, полученное на атомно-силовом микроскопе. Так, было обнаружено существенное различие в структуре поверхности родительской Escherichia coli и ее трансдуктантного мутанта, наследовавшего rfb-a3,4 ген Shigella flexneri, который ответственен за синтез О-специфических боковых цепей липополисахаридов. Развитие методов сканирующей зондовой микроскопии представляет особый интерес для задач бионаноскопии и биомедицины. Возможность удаленного управления, синхронная передача данных участникам исследования, динамическое переключение прав на управление микроскопом, встроенный протокол общения оказывают большую помощь при совместном проведении длительных экспериментов протяженностью в несколько дней или даже недель. Сканирующий зондовый микроскоп успешно применяется для экспериментального обучения, построения практических занятий.

В последнее время техника зондовой микроскопии стала родоначальником нового направления - мирокантилеверных сенсоров с рекордной чувствительностью. С помощью таких сенсоров достигнут абсолютный рекорд по измерению массы на уровне 10-21 г. Изменение массы регистрируется по сдвигу резонансной частоты кантилевера. Это открывает новые возможности по созданию химических и биологических сенсоров, работающих в газовых средах. Нами разработан метод калибровки кантилеверов с помощью эталонных масс - калиброванных полистирольных шариков заданной массы. Использование кантилеверов с известными параметрами позволило определить адсорбционные свойства микро - и наночастиц сорбентов. Для жидких сред наиболее оптимальным методом измерений является регистрация статического изгиба кантилевера (рис.2). С этой целью на одной из сторон кантилевера формируется рецепторный слой, избирательно взаимодействующий с молекулами определенного вида. В простейшем случае для молекул тиолов материалом такой поверхностью может служит золото, а для органосиланов - кремний. При формировании монослойной пленки адсорбата латеральные силы - межмолекулярное взаимодействие, направленное вдоль рецепторной поверхности - приводит к изгибу кантилевера. Зная плотность посадки молекул, не трудно определить силы парного взаимодействия между молекулами.

Изображение кантилевера - чувствительного элемента биосенсора. На верхней поверхности кантилевера сформирован рецепторный слой антител. Сорбция антигенов на монослойной пленке антител приводит к изгибу кантилевера за счет дополнительных латеральных сил, обусловленных межмолекулярным взаимодействием.

6. Список литературы

1. ?????? ??????????? ???????? ???????????. ?.?. ???????.

2. ??????????? ?????????? ?????????????. ??????? ???????. ??????, ?????????? ????????? ???.