Морфофункциональные особенности кровеносных сосудов потомков курящих родителей

2.5 Флюориметрический метод определения нитрозотиолов

Основные факторы транспорта и накопления эндогенного оксида азота являются S- нитрозотиолы. В сыворотке крови и гомогенатах сосудов определяли содержание S-нитрозотиолов (стабильный метаболит NO) спектрофлюориметрическим методом [23].

Принцип метода. Конверсия нитрозо группы S-нитрозотиолов в нитриты (с помощью хлорида ртути) и последующее кислотокатализируемое нитрозотирование 2,4-диаминонафталина. Перед этим NO2 должен быть полностью удален с помощью аммония сульфата (редуцирует NO2 до N2 в кислых условиях). Проведение метода. Раствором аммония сульфата с концентрацией 0,1мМ/л осаждают нитриты из разведенной физраствором в 7 раз сыворотки или гомогенатов тканей. Центрифугировали, К 50 мкл надосадочной жидкости добавляли 200мкл реакционной смеси, состоящей из 1 части 1,1мМ HgCl2 и 4 частей 0,05 г/л диаминонафталина в 0,62М НCl, инкубировали 10 минут в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 20мкл 2,7М NaOH, Измеряли флюорисценцию при 360/ 450 нм. Расчет производили по калибровочной кривой,построенной с использованием различных концентраций восстановленного глютатиона (от 0,15 до 10,0 мкмоль/л восстановленного глютатиона в 1М HCl). Из восстановленного глютатиона получали нитрозо-глютатион путем инкубирования с нитритом натрия (10,0 мкмоль/л) при комнатной температуре.

2.6 Метод определения содержания АТФ в тканях

В гомогенатах сосудов новорожденных крысят определяли содержание АТФ методом электрофореза в цитратном буфере с последующим спектрофотометрическим анализом [16].

Проведение метода. Электрофоретическую камеру заполняют цитратным буфером рН 5,1, смачивают бумагу для электрофореза. На линию старта равномерной поперечной полосой наносят по 0,05 мл гомогенатов сосудов. Проводят электрофорез при напряжении 12-14 В/см при силе тока 0,5 -1 мА на 1 см поперечного сечения ленты в течение 3,5 часов. После этого электрофореграммы высушивают в темноте и рассматривают при освещении ультрафиолетовым светом. Бумага слегка флюоресцирует за счет примесей, а адениловые нуклеотиды, которые сильно поглощают свет в этой области, видны в виде темных пятен. Ближе к старту находится АДФ, дальше от старта - АТФ. Контуры пятен обводят карандашом, вырезают и элюируют 5 мл 0,01 н HCl в течение 4 часов. Одновременно экстрагируют аналогичный участок бумаги, не содержащий нуклеотидов (холостая проба). Экстинции всех растворов измеряются пр длине волн 260 и 290 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см, из первой величины вычитают вторую. Расчет основывается на данных молярного коэффициента экстинции при длине волны 260 нм, который у разных нуклеотидов несколько различается, однако этим различием можно пренебречь и принять его равным 14,2. Это значит, что такая величина оптической плотности получиться, если фотометрировать в кювете с длиной оптического пути 1 см раствор концентрации 1моль/л и вычесть из этой величины оптическую плотность при 290 нм. Для раствора концентрации 1 мкмоль/лвеличина будет 0,0142.

2.7 Определение содержания ТБК-активных продуктов в сыворотке крови

К ТБК - активным продуктам относятся соединения, способные при высокой температуре образовывать комплексы с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Одним из таких соединений является малоновый диальдегид (МДА) -конечный продукт перекисного окисления липидов. Содержание ТБК-активных продуктов определяли спектрофотометрическим методом [9; 17]. Принцип метода. Метод основан на реакции между МДА и ТБК, которое при высокой температуре (100° С) в кислой среде (рН 2,5-3,5) протекает с образованием окрашенного триметилового комплекса. Интенсивность окраски измеряется на спектрофотометре при длинне волны 532 нм. Расчет количества МДА (мкмоль) по формуле : МДА= Д 16,5 /0,156. Д - экстинция пробы, 16,5 - коэффициент разведения сыворотки в пробе, 0,156 - коэффициент микромолярной экстинции окрашенного комплекса при 532 нм.

2.8 Определение содержания диеновых конъюгатов (гидроперекисей липидов) в сыворотке крови

Содержание диеновых конъюгатов в сыворотке крови новорожденных крысят определяли спектрофотометрическим методом [9].

Принцип метода. Для первичных продуктов свободнорадикального окисления (гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот, имеющих в структуре сопряженные диены0 характерно поглощение в ультрафиолетовой области спектра с максимумом при 220-230 нм. Коэффициент милимолярной экстинции диеновых конъюгатов - 24,4 ммоль1 см1.

2.9 Скрининг-метод определения молекул средней массы

Определение концентрации молекул средней массы (МСМ) в сыворотке крови новорожденных крысят проводили спектрофотометрическим методом [9].

Проведение метода исследования. Белки сыворотки крови осаждали 10% ТХУ, центрифугировали пробы при 3000g 20 минут, надосадочную жидкость разводили в 10 раз дистилированной водой, определяли экстинцию образцов (Е) на спектрофотометре при длинах волн 254 и 280 нм против контрольной пробы - ТХУ, разведенная водой в 30 раз. Рассчитывали индекс распределения - это соотношение Е280/ Е254.

2.10 Определение АТФ-азной активности миозина

Экстракцию миозина и определение Ca2+-активируемой АТФ-азной активности миозина проводили по методу, описанному Magrossian S.S. [108]. Миозин получали путем многократного переосаждения в растворах хлорида кальция разной концентрации. После выделения и переосаждения полученный препарат миозина лиофильно высушивали.

Об активности АТФ-азы судили по количеству неорганического фосфата, который образовался придействии миозина на АТФ в присутствии кальция. Реакцию останавливают добавлением 1мл 7,5% ТХУ. В растворе по реакции с молибдатом аммония определяли неорганический фосфат. Образовавшийся в процессеферментативного расщкпления АТФ. Активность АТФ-азы миозина рассчитывали на мг белка в пробе.

2.11 Определение активности креатинфосфокиназы в гомогенатах сосудов

Активность фермента определяли с помощью наборов реагентов фирмы «Філісіт-Дівгностікум» (Днепропетровск).

Принцип метода. Креатинфосфокиназа (КФ 2.7.3.2) - катализирует превращение креатинфосфата в креатин. Ион фосфора, освобожденный при гидролизе креатинфосфата, определяют после депротеинизирования как желтый комплекс фосфорнованадиевомолибденовой кислоты.

Биохимические исследования выполнены с использованием следующих приборов: анализатор биохимический STAT FAX (США), анализатор иммуноферментный STAT FAX-303+ (США), спектрофлюориметр Hitachi-M (Япония).

Морфологические исследования

Для морфологического исследования участок дуги аорты, правую почку и среднюю часть правого полушария головного мозга после фиксации в 10% формалине заливали в парафин и изготавливали срезы ткани на предметных стеклах [33].

2.12 Гистологическое, гистохимическое и морфометрическое исследование

Обзорные микропрепараты окрашивали гематоксилином-эозином, пикрофуксином по Ван Гизон, галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону. Гистологические и гистохимические методики выполнялись по прописям, изложенным в руководствах по гистологической технике и гистохимии [31]. Для объективизации результатов исследования применялся морфометрический метод с помощью которого в аорте измеряли толщину комплекса интима-медиа, считали количество эластических мембран в медии и их общую толщину, определяли количество гладкомышечных клеток в отрезке стенки аорты длиной 175мкм и оптическую плотность цитоплазмы гладкомышечных клеток при окраске микропрепаратов по Эйнарсону [44]. Для оценки влияния табакокурения родителей на степень васкуляризации почечной ткани потомков также использовали два морфометрических показателя: количество клубочков в поле зрения при увеличении в 100 раз и площадь клубочков (мкм2).

2.13 Иммуногистохимическое исследование

На срезах ткани головного мозга поставлена иммуногистохимическая реакция на фактор Виллебранда , поскольку этот белок синтезируется только в эндотелиоцитах и хорошо обозначает контур капилляров Использованы первичные (кроличьи поликлональные) антитела к фактору Виллебранда, визуализация осуществлена с помощью DАВ-хромогена (фирма Cell Marque, USA) с докрашиванием ядер гематоксилином.

На микропрепаратах с постановкой данной иммуногистохимической реакции проведено ряд морфометрических исследований: определение длины стенок капилляров в пределах фотоснимка (при увеличении в 400 раз), определение абсолютной и относительной длины участков деэндотелизации капилляров, определение оптической плотности цитоплазмы эндотелиоцитов [44].

Гистологические исследования проводили на микроскопе Axiostar-plus (Zeiss) с использованием программного обеспечения «ВидеоТест» (С.-Птб, РФ) при морфометрии.

2.14 Анкетирование студентов

В анкетировании приняли участие 219 человек - студентов Харьковского национального технического университета сельского хозяйства им. П.Василенко. Среди них оказалось 113 юношей и 106 девушек в возрасте 17-29 лет. В анкете представлены вопросы возраста, пола, табакокурения анкетируемого и его родителей, наличие жалоб на состояние здоровья, наличие диагностированных сосудистых заболеваний и хронических заболеваний внутренних органов.

2.15 Статистическая обработка результатов

Полученные данные обрабатывали с помощью специальной программы SPSS for Windous, электронных таблиц Exel [38]. После подтверждения гауссовского распределения значений показателей применялся метод сравнения двух средних на основании t-критерия Стьюдента (вариационный анализ). Для обработки данных по анкетированию студентов использованы методы альтернативного анализа [38, 43А].

РАЗДЕЛ 3. ПОКАЗАТЕЛИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В КРОВИ И В СТЕНКЕ КРУПНЫХ СОСУДОВ НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ТАБАКОКУРЕНИЯ РОДИТЕЛЕЙ

3.1 Уровень интоксикации организма новорожденных крысят в эксперименте

Как известно [5], степень токсической нагрузки на организм характеризует уровень молекул средней массы (МСМ) в сыворотке крови. Определение их содержания в крови новорожденных крысят показало, что у крысят всех опытных групп (кроме гр. О) достоверно повышена концентрация МСМ, по сравнению с уровнем у крысят гр. К (табл. 3.1), что свидетельствует о высокой степени токсической нагрузки.

Известно, что все токсические соединения активируют в организме человека и животных продукцию реактивных форм кислорода и, вследствие этого, - процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [45]. В данной работе представлялось необходимым изучение продуктов ПОЛ (малонового диальдегида и диеновых конъюгатов) в сыворотке крови новорожденных крысят для оценки общего уровня табачной интоксикации. Результаты данных исследований приведены в таблице 3.1.

Как видно из полученных данных, у потомков крыс, подвергавшихся пассивному табакокурению, значительно повышено содержание продуктов ПОЛ, по сравнению с их уровнем у крысят контрольной группы. Отсутствуют достоверные изменения только у потомков гр. О, где «курили» только будущие отцы, что, по-видимому, связано с отсутствием токсических компонентов табачного дыма в организме матери и, соответственно, плода.

Однако обращает внимание факт, что все анализируемые показатели (содержание МСМ и продуктов ПОЛ) у потомков гр. О все-таки имеют тенденцию к повышению по сравнению с гр.К, причина чего, вероятно, имеет эпигеномный характер.

Таблица 3.1 Содержание молекул средней массы и продуктов ПОЛ в сыворотке крови новорожденных крысят - потомков «курящих» родителей (M±m)

Группы крыс	МСМ (у.е.)	Малоновый диальдегид мкмоль/л	Диеновые конъюгаты мкмоль/л
	Самки	Самцы	Самки	Самцы	Самки	Самцы
Гр. К	0,087± 0,004	0,077± 0,003	1,68±0,09	2,11±0,11	44,27±1,12	49,68±1,77
Гр. М	0,321± 0,011 р<0,001	0,344± 0,016 р< 0,001	4,27±0,17 р<0,001	5,78±0,27 р<0,001	82,68±3,11 р<0,001	86,79± р<0,001
Гр. О	0,092± 0,004 р>0,05	0,082± 0,002 р>0,05	2,03±0,18 р >0,05	2,46±0,19 р>0,05	45,07±2,00 р>0,05	52,08±2,49 р>0,05
Гр. МО	0,389± 0,019 р<0,001	0,411 ±0,025 р<0,001	4,79±0,22 р<0,001	6,34±0,28 р<0,001	88,32±3,22 р<0,001	94.48±3,64 р<0,001

Из данных, приведенных в таблице 3.1, видно, что максимальное увеличение содержания продуктов ПОЛ отмечается у потомков обоего пола гр. МО: концентрация малонового диальдегида у самок увеличена в 2,9 раза, у самцов - в 3 раза, концентрация диеновых конъюгатов у потомков обоего пола повышена почти в 2 раза. Более низкая степень повышения промежуточных продуктов ПОЛ (по сравнению с конечным продутом МДА), по-видимому, связана с высокой скоростью окисления. Конечно, активация процессов ПОЛ может быть вызвана стрессом при рождении, и выявленная разница в изучаемых показателях может быть обусловлена разным уровнем стресс-стойкости. Однако степень повышения содержания продуктов ПОЛ соответствует степени изменений концентраций МСМ, т.е. величине токсической нагрузки на организм. В то же время и разная степень устойчивости к стрессу может формироваться под влиянием компонентов табачного дыма, действующих в процессе эмбриогенеза.

3.2 Биохимические показатели функции эндотелия у новорожденных крысят - потомков «курящих» родителей

В научной литературе имеются единичные сведения [89] о влиянии курения родителей на функциональное состояние эндотелия сосудов плода и новорожденного потомка. Известно, что показателем функции эндотелия является уровень продукции эндотелиальных вазоконстрикторных и вазодилататорных факторов. Аналогичный характер изменений отмечается и в содержании S- нитрозотиолов: максимальные изменения (снижение в 1,5 раза) выявлено у потомков от обоих «курящих» родителей (гр. МО), в случае «курения» только самцов (гр.О) содержание S-NO практически не отличается от уровня у потомков от животных контрольной группы (табл.3.2). Однако, соотношение эндотелин/S-NO увеличено у потомков всех «курящих» групп животных, по сравнению.с потомками крыс контрольной группы, что свидетельствует о наличии эндотелиальной дисфункции у новорожденных крысят при всех вариантах «табакокурения» родителей.

Таблица 3.2 Содержание эндотелина-1 и S-нитрозотилов ( S-NO) в сыворотке крови новорожденных крысят-потомков «курящих» крыс

Группы крыс	Эндотелин-1, пкг/мл	S-NO, мкмоль/л	Эндотелин-1/S-NO
Гр. К, n=15	2,31±0,14	0,45±0,02	5,13±0,28
Гр. М, n=15	4,56±0,21 р<0,01	0,27±0,02 р<0,01	16,88±1,13 р<0,001
Гр. О, n=15	3,74±0,14 р<0,02	0,39±0,03 Р>0,05	9,58±0,71 р<0,01
Гр. МО, n=15	5,84±0,32 р<0,001	0,16±0,01 р<0,001	36,5±2,64 р<0,001

Результаты изучения содержания эндотелина-1 в сосудах новорожденных крысят представлены в таблице 3.3.

Как видно из приведенных в таблице данных, в аорте максимальные изменения в содержании эндотелина у потомков обоих полов происходит в группе МО («курение» обоих родителей), у самок - увеличение в 1,6 раза, у самцов - в 1,2 раза. Минимальные изменения изучаемого показателя отмечаются у крысят-потомков «курящих» самцов: у потомков мужского пола концентрация такая же как в контрольной группе, а у потомков женского пола - увеличена достоверно, но минимально. Аналогичная направленность изменений установлена в бедренной артерии, однако, в этом сосуде у потомков обоих полов животных гр. О изменений в содержании эндотелина не выявлено. Анализ содержания S-нитрозотиолов в сосудах новорожденных крысят показал, что в аорте у потомков женского пола изменения разнонаправленны: у потомков гр. М достоверных изменений (по сравнению с контрольной группой) не выявлено; гр. О - достоверно увеличено, гр. МО - достоверно снижено).

Таблица 3.3 Содержание эндотелина-1 в сосудах новорожденных крысят (в нг/г ткани)

Группы крыс	Аорта	Бедренная артерия
	Самки	Самцы	Самки	Самцы
Гр. К, n=15	64,11±2,16	52,13±3,24	28,17±1,22	20,69±1,42
Гр. М, n=15	84,28±7,42 р<0,001	63,52±1,05 р<0,02	42,12±1,62 р<0,01	38,14±2,05 р<0,001
Гр. О, n=15	70,69±2,14 р<0,05	55,26±2,84 p>0,05	26,52±1,33 p>0,05	21,13±1,00 p>0,05
Гр. МО, n=15	104,28±3,00 р<0,001	68,39±3,11 р<0,01	49,21±1,78 р<0,001	41,16±2,68 р<0,001

Расчет соотношений эндотелин-1 /S-NO в аорте у потомков женского пола показал, что в контрольной группе оно равно 7,34±0,42; в группе М - 9,11±0,51; в группе О - 6,07±0,64; в группе МО - 14,28±1,02; достоверные отличия, по сравнению с контрольной группой, выявлены только у крысят групп М и МО. Следовательно, эндотелиальная дисфункция в аорте (с доминированием вазоконстрикторного эффекта) имеет место у потомков-самок группы М и группы МО, а в группе О просматривается тенденция обратной по качеству дисфункции, т.е с доминированием вазодилататорного эффекта. Максимальные нарушения функции эндотелия аорты у новорожденных крысят отмечаются в случае «курения» обоих родителей.

В бедренной артерии новорожденных крысят женского пола при всех вариантах «табакокурения» родителей достоверно снижено содержание S-нитрозотиолов, максимальное изменение показателя выражено в группе МО (снижение в 1,6 раза) (табл. 3.4).

Расчет коэффициента эндотелин-1/S-NO показал, что в бедренной артерии самок контрольной группы коэффициент равен 5,28±0,31; группы М - 10,48±1,00; группы О - 6,24±0,37; группы МО - 14,43±1,08; высоко достоверные отличия имеют место у крысят групп М и МО, что указывает на наличие эндотелиальной дисфункции с доминированием вазоконстрикторного эффекта, степень нарушений максимальна в случае «курения» обоих родителей. У потомков женского пола курящих отцов обнаружена минимально выраженная, но достоверная эндотелиальная дисфункция аналогичной направленности (доминирование вазоконстрикторного эффекта).

В аорте содержание эндотелина-1 у потомков мужского пола достоверно увеличено при «курении» только самок-матерей и обоих родителей (табл. 3.3). Максимальные изменения в содержании S-нитрозотиолов у них обнаружены в группе М («курение» только самки) - увеличение в 1,8 раза; у потомков группы МО достоверно снижено , а в группе О - не отличается от контрольной группы (табл. 3.4).

Таблица 3.4 Содержание S-нитрозотиолов (в мкмоль/г ткани) в сосудах новорожденных крысят

Группы крыс	Аорта	Бедренная артерия
	Самки	Самцы	Самки	Самцы
Гр. К, n=15	8,74±0,42	11,22±1,00	5,34±0,37	6,84±0,45
Гр. М, n=15	9,25±0,63 p>0,05	20,63±1,78 р<0,0001	4,02±0,77 р<0,01	7,11±0,51 p>0,05
Гр. О, n=15	11,65±1,0 Р<0,001	11,55±0,79 p>0,05	4,25±0,24 p<0,01	8,25±0,23 p<0,01
Гр. МО, n=15	7,34±0,32 р<0,05	9,35±0,44 р<0,05	3,41±0,22 р<0,02	5,00±0,27 р<0,01

Коэффициент эндотелин-1/S-NO в аорте потомков-самцов контрольной группы - 4,65±0,38; группы М - 3,08±0,24; группы О - 5,23±0,47; группы МО - 7,12, достоверные отличия в группах М и МО.

Очевидно, эндотелиальная дисфункция с преобладанием вазоконстрикторных эффектов имеет место только в аорте потомков группы МО. Следует отметить, что у потомков-самцов в группе М отмечается преобладание вазодилататорных соединений. А в гр. О - достоверных отличий нет. табакокурение морфологический аорта микроциркуляторный

Содержание эндотелина-1 в бедренной артерии новорожденных крысят-самцов достоверно увеличено в гр. М и в гр. МО (табл. 3.2). Выявлен разнонаправленный характер изменений в содержании S-NO: в гр. М - не отличается от контрольной группы; в гр.О -достоверно повышено; в гр. МО - достоверно снижено (табл. 3.3).

Анализ соотношений эндотелин-1/S-NO показал, что у потомков самцов контрольной группы в бедренной артерии оно равно 3,02±0,24; в группе М - 5,06±0,39; в группе О - 2,56±0,22; в группе МО - 11,41±1,00; достоверные отличия коэффициента от его величины в контрольной группе выявлены у потомков групп М и МО. Очевидно, что дисфункция эндотелия у потомков-самцов максимально выражена в случае «табакокурения» обоих родителей. Следует отметить преобладание вазодилататорных эффектов в бедренной артерии потомков-самцов группы О, т.е. «табакокурение» только животных-отцов.

Как видно из полученных результатов, как в бедренной артерии, так и в аорте потомков обоих полов максимальные изменения в функциональном состоянии эндотелия (дисфункции) выявлено в случае «курения» обоих родителей. Следует отметить, что при «курении» только самцов у потомков-самок отмечаются минимальные изменения в функциональном состоянии эндотелия, а у потомков-самцов нарушения практически отсутствуют.

Известно, что содержание NO, а следовательно и S-NO, определяется активностью NO-синтаз (индуцибельной и эндотелиальной). Поэтому для нас представляло интерес изучение активности этих ферментов в сосудах экспериментальных крыс. Проведенные исследования показали, что в аорте новорожденных крысят-самок активность эндотелиальной NO-синтазы снижена у потомков группы М и группы МО (табл. 3.5) и соответствует уровню контрольной группы у потомков группы О.

Таблица 3.5 Активность эндотелиальной NO-синтазы в сосудах новорожденных крысят (нмоль/г белка/мин.) (M±m)

Группы крыс	Аорта	Бедренная артерия
	Самки	Самцы	Самки	Самцы
Гр. К, n=15	105,64±6,11	120,45±9,83	83,16±6,24	92,87±6,13
Гр. М, n=15	90,25±3,14 p<0,01	166,34±7,45 р<0,001	69,44±2,03 р<0,01	105,48±5,49 p<0,05
Гр. О, n=15	100,34±5,42 p>0,05	115,23±4,48 p>0,05	79,05±3,24 p>0,05	115,38±3,11 p<0,02
Гр. МО, n=15	91,68±7,25 р<0,05	102,12±8,14 р<0,02	65,28±3,61 р<0,001	78,45±6,24 р<0,02

Иной характер изменений индуцибельной NO-синтазы у новорожденных крысят женского пола: в группе М и, особенно, в гр. МО - увеличивается, в группе О - соответствует контрольной группе потомков (табл. 3.6).

У потомков-самцов в аорте активность эндотелиальной NO-синтазы снижена при «табакокурении» обоих родителей, повышена - в случае «курения» только самок, соответствует контрольной группе при «курении» только самцов. Активность индуцибальной NO-синтазы в аорте у потомков-самцов всех опытных групп соответствует уровню в контрольной группе (табл.3.5). В бедренной артерии потомков-самок активность эндотелиальной NO-синтазы в случае «курения» только животных-матерей и обоих родителей достоверно снижена, при «табакокурении» только животных-отцов - соответствует уровню в контрольной группе (табл. 3.5).

Активность индуцибальной NO-синтазы в бедренной артерии потомков-самок достоверно повышена в случае «курения» только животных-отцов и обоих родителей, снижена - в случае «курения» только животных-матерей (табл. 3. 6).

Таблица 3.6 Активность индуцибельной NO-синтазы в сосудах новорожденных крысят (нмоль/г белка/мин.) (M±m)

Группы крыс	Аорта	Бедренная артерия
	Самки	Самцы	Самки	Самцы
Гр. К, n=15	28,44±1,22	16,28±1,34	10,65±1,00	6,32±0,31
Гр. М, n=15	33,81±1,59 p<0,02	15,83±1,02 p>0,05	8,44±0,67 р<0,02	6,12±0,57 p>0,05
Гр. МО, n=15	40,34±2,05 p<0,01	16,77±1,07 p>0,05	15,59±0,93 p<0,01	7,82±0,84 p<0,05
Гр. О, n=15	29,31±1,08 p>0,05	17,05±1,39 р>0,05	12,83±1,11 р<0,05	7,48±0,42 р<0,05

У потомков-самцов в бедренной артерии активность эндотелиальной NO-синтазы повышена в случае табакокурения только матерей и только отцов и снижена при табакокурении обоих родителей. Активность индуцибельной NO-синтазы в бедренной артерии потомков-самцов повышена в случае «курения» только отцов и обоих родителей, при «курении» только матерей активность фермента соответствует уровню в контрольной группе.

Данные проведенных нами экспериментальных исследований показали, что моделирование табакокурения родителей на животных приводит к изменению соотношений вазоконстрикторных и вазодилататорных факторов, т.е. к развитию эндотелиальной дисфункции как в аорте, так и в бедренной артерии потомков. В аорте у потомков обоего пола максимальные проявления дисфункции отмечаются при «табакокурении» обоих родителей, у потомков - самок также существенные нарушения функции эндотелия имеют место в группе М. Следует отметить, что повышение содержания эндотелина-1 в аорте обнаружено как у потомков-самцов, так и у потомков-самок всех групп, однако у потомков группы О коэффициент эндотелин/S-NO практически не отличается от уровня контрольной группы за счет адекватного увеличения концентрации нитрозотиолов, у потомков же группы М и группы МО степень изменений в содержании S-нитрозотилов ниже, чем эндотелина (хотя направленность изменений одинакова).

Следует отметить, что в аорте потомков-самок всех опытных групп уровень S-NO обеспечивается за счет активации индуцибельной NO-синтазы при заметном снижении активности эндотелиальной NO-синтазы. У потомков-самцов всех опытных групп активность индуцибельной NO-синтазы соответствует уровню в контрольной группе, концентрация NO поддерживается, в основном, за счет изменений эндотелиальной NO-синтазы, что свидетельствует о менее выраженном повреждении эндотелия аорты. В бедренной артерии потомков обоих полов всех опытных групп содержание S-NO обеспечивается за счет активации индуцибельной NO-синтазы, максимальные изменения в соотношении эндотелин-1/S-NO у потомков обоих полов отмечается при «табакокурении» обоих родителей (группа МО). Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, о том, что степень нарушения функции эндотелия в бедренной артерии выше у потомков-самцов, в аорте - у потомков-самок. Проведенные нами эксперименты выявили нарушение функции эндотелия у новорожденных крысят-потомков «курящих» родителей.

Таким образом, моделирование табакокурения крыс-родителей приводит к развитию эндотелиальной дисфункции у новорожденных потомков, наиболее выражены изменения в состоянии эндотелия у потомков обоих полов в случае «табакокурения» обоих родителей. Степень эндотелиальной дисфункции в аорте выше у потомков женского пола, а в бедренной артерии - у потомков мужского пола в случае «табакокурения» обоих родителей. Наименьшая степень нарушения функции эндотелия у потомков обоих полов имеет место при пассивном табакокурении только животных-отцов. Полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о том, что в сыворотке крови у всех потомков от «курящих» родителей значительно увеличивается содержание эндотелина-1 (табл. 3.2), максимальные изменения отмечаются - при «курении» обоих родителей (гр. МО), где содержание эндотелина в среднем увеличивается в 2,8 раза; минимальные изменения - в случае «курения» только самцов.

3.3 Показатели энергетического обмена и АТФ-азная активность миозина в крупных сосудах новорожденных крысят

АТФ-азная активность миозина - показатель, характеризующий сократительную способность гладкомышечных клеток сосудов. Как видно из полученных нами данных, в аорте животных контрольной группы активность Ca2+ -активируемой АТФ-азы миозина достоверно выше у крысят-самцов. При моделировании табакокурения крыс-родителей АТФ-азная активность миозина у потомков большинства групп значительно снижается, в наибольшей степени у крысят-потомков «курящих» матерей. Как видно из данных, приведенных в табл.3.7 степень снижения изучаемого показателя при «табакокурении» только матери выше у потомков-самцов (у крысят-самок снижение в 1,7 раза в , у крысят-самцов - в 2,7 раза). Следует отметить, что у потомков «курящих» отцов АТФ-азная активность миозина в аорте у самцов и самок не отличается от показателей у потомков контрольной группы. При «курении» обоих родителей в аорте у потомков-самок и самцов активность АТФ-азы актомиозина выше, чем в случае курения только матери, но достоверно ниже, чем у потомков контрольной группы, причем у самцов - более, чем в два раза выше, чем у самок (табл. 3.7).

В бедренной артерии у потомков контрольной группы, как и в аорте, АТФ-азная активность миозина выше у самцов. «Курение» родителей практически в одинаковой степени снижает активность Ca2+-активируемоей АТФ-азы миозина у самок и самцов (табл. 3.7).

Таблица 3.7 Ca2+-активируемая АТФ-азная активность миозина в сосудах новорожденных крысят (мкмоль/г белка/час.)

Группы крыс	Аорта	Бедренная артерия
	Самки	Самцы	Самки	Самцы
Гр. К, n=7	10,64±0,82	19,45±1,08	5,48±0,37	11,71±0,59
Гр. М, n=10	6,09±0,39 p<0,001	7,11±0,45 p<0,001	2,85±0,12 p<0,001	5,58±0,37 p<0,001
Гр. О, n=10	9,89±0,71 p>0,05	20,03±1,02 p>0,05	5,11±0,48 p>0,05	10,09±1,05 P>0,05
Гр. МО, n=10	7,85±0,44 p<0,001 Р2< 0,01	17,59±1,45 p<0,05 Р2<0,001	4,21±0,22 p<0,05 Р2<0,01	9,25±0,82 p>0,05 Р2<0,01

Р - достоверность отличия показателя с гр. К

P2 - достоверность отличий показателей с гр. М

При «курении» только матерей у потомков-самок показатель снижается в 1,9 раза, у самцов - в 2,1 раза; при «курении» только отцов у потомков-самок и самцов активность АТФ-азы практически такая же, как у потомков контрольной группы. При «табакокурении» обоих родителей у потомков-самок и самцов АТФ-азная активность снижается в одинаковой степени (у самок - в 1,3 раза, у самцов - в 1,2 раза), остается достоверно ниже, чем в контрольной группе, но выше, чем при «курении» только матерей.

Как видно из приведенных данных (табл. 3.7), максимальные снижения АТФ-азной активности актомиозина в бедренной артерии потомков отмечается при курении только матери, минимальные - при курении только самцов. У потомков обоих курящих родителей исследуемый показатель функционирования гладкомышечных клеток стенки крупных артерий достоверно понижен, но существенно в меньшей степени, чем при исключительно материнском курении, при этом сохраняется более высокая АТФ-азная активность у потомков-самцов по сравнению с потомками-самками.

Еще в 1978 году Сакс В. А. экспериментально доказал, что в миофибриллах изофермент КФК функционально сопряжен с АТФ-азой миозина и, очевидно, обеспечивает эффективное использование креатинфосфата для рефосфорилирования АДФ, образующейся из АТФ в акте сокращения. Более того показано, что существует строгая корреляция между специфической КФК-активностью в миофибриллах и количеством в них актомиозина. Поэтому изучение активности КФК в гомогенатах сосудов необходимо для характеристики сократительной способности гладкомышечных волокон.

Проведенное изучение активности КФК в гомогенате аорты потомков контрольной группы показало, что активность ее выше у самцов (табл. 3.8). Табакокурение обоих родителей приводит к снижению активности КФК у потомков-самок в 1,3 раза, у потомков-самцов - в 1,6 раза. При «курении» только крысы-отца активность КФК у потомков обоего пола практически не отличается от уровня в контрольной группе (табл. 3.8). Максимальные изменения активности фермента отмечаются при «курении» только матери: у потомков-самок снижается в 1,5 раза, у потомков-самцов - в 2 раза.

Как видно из приведенных данных, степень изменения активности КФК по сравнению с гр. К в аорте потомков при «курении» родителей выше у самцов, но средние значения активности фермента при всех вариантах «курения» родителей у потомков обоего пола достоверно не отличаются.

В бедренной артерии потомков «курящих» родителей также снижена активность КФК, в большей степени - у потомков-самок при «табакокурении» только крыс-матерей (гр. М). При «курении» только отцов у потомков, как и в аорте, достоверных изменений в активности КФК не обнаружено (табл. 3.8).

Таблица 3.8 Активность КФК (в мкмоль /мг белка/ час) в гомогенатах аорты и бедренной артерии новорожденных крысят (M±m)

Группы крыс	Аорта	Бедренная артерия
	Cамки	Самцы	Самки	Самцы
Гр. К, n=7	5,24 ± 0,92	6,07 ± 0,38	4,11 ± 0,32	5,35 ± 0,48
Гр. М, n=10	3,49± 0,27 р<0,01	3,11 ± 0,19 р<0,001	2,75 ± 0,17 р<0,01	3,79 ± 0,27 р<0,01
Гр. О, n=10	5,00 ± 0,34 р>0,05	5,87 ± 0,47 р>0,05	3,97 ± 0,22 р>0,05	5,00 ± 0,42 р>0,05
Гр. МО, n=10	4,11 ± 0,32 р<0,02	3,88 ± 0,23 р<0,001	3,25 ± 0,22 р<0,05	4,27 ± 0,28 р<0,05

Р - достоверность отличий показателя с контрольной группой

Анализ содержания АТФ показал, что достоверных изменений показателя нет ни в аорте, ни в бедренной артерии крысят обоего пола всех опытных групп.

Следовательно, несмотря на сниженную активность КФК, ресинтез АТФ достаточный, что, по-видимому, связано с активацией гликолиза у потомков «курящих» матерей и обоих родителей.

Анализ содержания АДФ показал, что концентрация этого нуклеотида достоверно снижена у потомков обоего пола в двух группах - гр. М и гр. МО (табл. 3.9). Соотношение АДФ/АТФ у потомков «курящих» родителей (кроме гр.О) достоверно снижено. По-видимому, низкий уровень АДФ у потомков «курящих» родителей связан с изменением расхода АТФ в связи с измененными свойствами АТФ-азы миозина (снижением активности). Вследствие этого, вероятно, снижена и активность КФК у потомков «курящих» матерей и обоих родителей.

Таблица 3.9 Содержание АДФ и АТФ (мкмоль/г ткани) в сосудах новорожденных крысят

Группы крыс	Аорта	Бедренная артерия
	Cамки	Самцы	Самки	Самцы
Гр. К, n=7 АДФ	1,26 ± 0,12	1,74 ± 0,13	1,12 ± 0,09	1,69 ± 0,12
Гр. М, n=10 АДФ	0,89± 0,06 р < 0,01	0,98±0,06 р < 0,02	0,82 ± 0,06 р < 0,02	0,85 ± 0,02 р < 0,02
Гр. О, n=10 АДФ	1,18±0,09 р > 0,05	1,69 ± 0,15 р > 0,05	1,15 ± 0,11 р > 0,05	1,48 ± 0,13 р > 0,05
Гр. МО, n=10 АДФ	0,97 ± 0,07 р < 0,05	1,14 ± 0,06 р<0,05	0,91 ± 0,06 р<0,05	0,96 ± 0,02 р<0,02
Гр.К, n=7 АТФ	3,16 ± 0,27 р > 0,05	3,84 ± 0,29 р > 0,05	2,86 ± 0,2 р > 0,055	3,69 ± 0,22 р > 0,05
Гр.М, n=10 АТФ	2,97± 0,2 р > 0,05	3,42 ± 0,31 р > 0,05	2,59 ± 0,23 р > 0,05	3,45 ± 0,32 р > 0,05
Гр.О, n=10 АТФ	3,06±0,17 р > 0,05	3,65 ± 0,25 р > 0,05	3,05 ± 0,29 р > 0,05	3,72 ± 0,29 р > 0,05
Гр.МО, n=10 АТФ	3,11 ± 0,23 р > 0,05	1,14 ± 0,06 р > 0,05	2,66 ± 0,19 р > 0,05	3,56 ± 0,21 р > 0,05

р - достоверность отличий показателя с контрольной группой

У потомков «курящих» самцов не отмечается снижение АТФ-азной активности миозина, КФК, АДФ, что, по-видимому, связано с отсутствием прямого токсического влияния компонентов табачного дыма на плод.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что «табакокурение» самок до спаривания и во время беременности приводит к снижению Са2+-активируемой АТФ-азной активности миозина и, в связи с этим, к снижению использования АТФ, понижению коэффициента АДФ/АТФ и уменьшению активности креатинфосфокиназы как в аорте так и в бедренной артерии крыс-потомков обоего пола. Изменения такой направленности свидетельствуют об уменьшении сократительной способности гладкомышечных волокон сосудов потомков «курящих» матерей, как в аорте, так и в бедренной артерии, изменения более выражены у потомков мужского пола. При «курении» обоих родителей в аорте и бедренной артерии крысят - потомков обоего пола АТФ-азная активность миозина, активность креатинфосфокиназы и содержание АДФ достоверно ниже, чем у потомков контрольной группы, но выше, чем при табакокурении только матерей.

«Табакокурение» только самцов-будущих отцов не приводит к достоверным изменениям изучаемых показателей, характеризующих сократительную способность сосудов у потомков обоего пола. Вероятно, это связано с тем, что крысята-потомки этой группы не подвергаются действию токсических компонентов табачного дыма во внутриутробном периоде.

3.4 Содержание коллагена и эластина в ткани стенки крупных сосудов новорожденных крысят

Проведенные исследования показали, что в аорте и бедренной артерии крысят обоего пола при всех вариантах «табакокурения» их родителей достоверно снижено содержание эластина, по сравнению с его уровнем у крысят контрольной группы, за исключением потомков мужского пола гр. МО (табл. 3.10)

Как видно из приведенных данных, у новорожденных крысят обоего пола всех опытных групп содержание коллагена соответствует его уровню в контрольной группе.

Однако обнаружено изменение величины соотношения коллаген/эластин. У крысят обоего пола всех опытных групп (кроме самцов гр. МО) соотношение коллаген/эластин увеличено (за счет снижения эластина), что свидетельствует об увеличении жесткости сосудов у потомков при табакокурении родителей. В гр. МО соотношение коллаген/эластин у самок - 2,44±0.11 против 2,10±0,09 в контрольной группе, у самцов - 2,65±0,11 против 2,11±0,12. В гр. М - у самок - 2,41±0,11, у самцов - 2,54±0,12. В гр. О - у самок 2,50±0,12, у самцов - 1,89±0,10.

Таблица 3.10 Содержание коллагена (в мг оксипролина на г массы) и эластина (в мг/г массы) в аорте новорожденных крысят в норме и при разных вариантах «табакокурения» родителей (M±m)

Группы крыс	Коллаген	Эластин
	Самки	Cамцы	Самки	Самцы
Гр. К	250,68 ± 11,24	278,32±13,25	119,37± 9,65	132,51±10,62
Гр. М	241,34±16,21 Р >0,05	266,45 ±18,02 Р >0,05	100,22± 6,33 Р < 0,05	105,05± 8,44 Р < 0,05
Гр. О	255,37± 13,07 Р > 0.05	260,41± 10,71 Р > 0,05	102,22± 10,07 Р> 0,05	137,66± 8,31 Р > 0,05
Гр. MО	239,77±14,52 Р > 0,05	265,34±11,55 Р > 0,05	98,22± 4,38 Р < 0,05	100,02± 6,21 Р < 0,05

р - достоверность отличия показателя с контрольной группой

Такая же направленность изменений выявлена при изучении содержания коллагена и эластина в бедренной артерии новорожденных крысят (табл. 3.11). Как видно из приведенных в таблице 3.11 данных, у новорожденных крысят - потомков «курящих» родителей достоверно снижено содержание эластина (кроме самцов гр. МО), по сравнению с контрольной группой, при содержании коллагена, соответствующем уровню в контрольной группе.

Степень снижения уровня эластина выше, чем в аорте, соответственно, больше выражено изменение соотношения коллаген/эластин. Так в контрольной группе крысят это соотношение равно у самок 1.40±0,11, у самцов - 1.45±0,08; у самок гр. М - 1,51±0,05, у самцов гр. М - 1.62±0,06; в гр. О у самок - 1,58±0,12, у самцов -1,44; в гр. МО у самок - 1,75±0,12, у самцов - 1,60±0,09.

Таблица 3.11 Содержание коллагена(в мг оксипролина на г массы) и эластина (в мг/г ткани) в бедренной артерии новорожденных крысят в норме и при «табакокурении» родителей (M±m)

Группы крыс	Коллаген	Эластин
	Самки	Самцы	Самки	Самцы
Гр. К	117,48±11,22	130.45±14,45	83,92±7,21	89,96±6,77
Гр. М	106,71±10,12 р>0,05	115,56±16.28 р>0,05	70,43±6,02 р < 0,02	71,33±6,42 р < 0,02
Гр. О	119,34 ± 15,08 р > 0,05	138,22 ± 17,11 р > 0,05	75,47± 5,52 р < 0,05	95,94 ± 5,07 р > 0,05
Гр. МО	109.43 ± 14,66 р > 0,05	117,58 ± 11,35 р > 0,05	62,38 ± 5,54 р < 0,02	73,41 ± 4,71 р < 0,02

Как видно из приведенных данных, наибольшая степень изменения эластичности сосудов отмечается у потомков женского пола при «курении» обоих родителей, наименьшая - при «курении» только самца (выявлены только у потомков женского пола).

3.5 Содержание коллагена и эластина в ткани стенки крупных сосудов двухмесячных крысят

Полученные при изучение содержания коллагена и эластина в ткани стенки аорты и бедренной артерии двухмесячных крысят результаты свидетельствуют, что в контрольной и во всех основных группах значения этих показателей выше, чем у новорожденных крысят соответствующих групп (табл. 3.12, 3.13). Однако расчет коэффициента коллаген/эластин показал, что изменений этого показателя практически нет в сравнении с соответствующими группами новорожденных крысят.

Таблица 3.12 Содержание коллагена (в мг оксипролина на г массы) и эластина (в мг/г массы) в аорте 2-х месячных крысят-потомков в контроле и при разных вариантах «табакокурения» родителей

Группы крыс	Коллаген	Эластин
	Самки	Самцы	Самки	Самцы
К, n=8	302,22±14,34	311,24±25,11	504,70±31,80	527,25±31,80
М, n=10	298,34±17,0 р> 0,05	307,22±16,0 р> 0,05	432,38±12,17 р< 0,02	404,24±25,62 р< 0,02
О, n=10	305,32±18,11 р> 0,05	303,15±20,0 р> 0,05	508,76±37,05 р>0,05	496,92±34,15 р> 0,05
МО, n=10	309,22±15,74 р >0,05	309,56±19,11 р >0,05	426,69±23,17 р< 0,02	402,03±23,25 р< 0,02

Как и в случае с новорожденными крысятами, у 2-х месячных потомков «курильщиков» повышение коффициента коллаген/эластин в аорте и бедренной артерии наиболее выражено у самцов группы МО. У потомков группы О (самок и самцов) наблюдается лишь тенденция к повышению данного коэффициента.

Таблица 3.13 Содержание коллагена (в мг оксипролина на г массы) и эластина (в мг/г массы) в бедренной артерии 2-х месячных крысят-потомков в контроле и при разных вариантах «табакокурения» родителей

Группы крыс	Коллаген	Эластин
	Самки	Самцы	Самки	Самцы
К, n=8	125,37±10,00	149,64±15,27	305,78±16,28	340,09±19,00
М, n=10	118,45±11,02 р> 0,05	154,12±10,68 р> 0,05	236,90±18,14 р< 0,02	290,78±16,33 р< 0,02
О, n=10	128,63±11,07 р> 0,05	139,22±13,14 р> 0,05	299,13±21,16 р>0,05	323,26±31,12 р> 0,05
МО,n=10	135,24±8,47 р >0,05	157,32±13,17 р >0,05	241,50±16,32 р< 0,02	257,90±14,51 р< 0,02

Как видно из приведенных данных, в аорте 2-х месячных крысят обоих полов всех основных групп содержание коллагена соответствует его уровню в контрольной группе. Однако соотношение коллаген/эластин увеличено (за счет снижения содержания эластина) у крысят обоих полов гр. М и гр. МО. что свидетельствует об увеличении степени жесткости стенок этих крупных артерий у потомков при табакокурении родителей. Наиболее существенные изменения отмечены при «курении» обоих родителей (группа МО): соотношение коллаген/эластин у самок 0,73±0.04 против 0,60±0,03 в контрольной группе, у самцов - 0,77±0,04 против 0,59±0,02.

Такая ж направленность изменений выявлена при изучении содержания и соотношения коллагена и эластина в бедренной артерии 2-х месячных крысят: у самок гр. К - 0,41±0.03 по сравнению со значением соотношения у самок гр. МО - 0,56±0.04, у самцов гр. К - 0,44±0.02 по сравнению со значением соотношения у самцов гр. МО - 0,60±0.04.

Значения отношения коллаген/эластин у двухмесячных потомков гр. М обоих полов выше, чем в гр.К, но ниже, чем в гр. МО: в ткани аорты у самцов - 0,75±0,05, у самок - 0,69±0,04, в ткани бедренной артерии у самцов - 0,53±0,03, у самок - 0.50±0,03.

Т.е. действие компонентов табачного дыма на плод приводит к стойким изменениям эластичности-жесткости стенок крупных артерий потомков, сберегающихся в дальнейшем онтогенезе.

Резюме

Изучая ряд метаболических показателей крови и гомогената ткани стенки аорты и бедренных артерий, удалось установить, что у новорожденных крысят-потомков гр. М и гр. МО уровень интоксикации организма повышен, более значительно в гр. МО. Обнаружены дисфункция эндотелия артерий с доминированием вазоконстрикторного потенциала в большинстве случаев. Снижена АТФ-азная активность миозина в ткани стенки аорты и бедренной артерии, уменьшена также скорость ресинтеза АТФ, о чем свидетельствует снижение величины коэффициента АТФ/АДФ и уменьшение креатинфосфокиназной активности. Отношение коллаген/эластин увеличено в ткани стенки артерий у всех крысят основных групп, что указывает на повышенную жесткость стенок этих сосудов. У двухмесячных крысят основных групп в гомогенате ткани стенок аорты и бедренных артерий содержание коллагена в основных группах не отличается от содержания коллагена в гр. К, а содержание эластина - понижено в гр. М и в гр. МО; соотношение коллаген/эластин остается повышенным, за исключением потомков гр. О.

По результатам исследований, изложенных в разделе 3, опубликованы следующие статьи:

1. Горбач Т. В. Показатели функции эндотелия у новорожденных крысят - потомков «курящих» родителей / Т. В. Горбач, Г. И. Губина-Вакулик, В. Ю. Юнусов // Научные ведомости Белгородского государственного университета. -- Медицина. Фармация. -- 2014. -- №11 (182). -- С. -- 150--154.

2. Горбач Т. В. Уровень интоксикации организма и эластичность сосудов новорожденных крысят - потомков крыс, подвергавшихся действию табачного дыма / Т. В. Горбач, В. Ю. Юнусов, С. Н. Мартынова // Буковинський медичний вісник. -- 2014. -- № 4 (72). -- С. -- 20 -- 24.

3. Юнусов В. Ю. Показатели энергетического обмена и АТФ-азная активность миозина в сосудах новорожденных крысят - потомков «курящих» родителей / В. Ю. Юнусов, С. Н. Мартынова // Світ медицини та біології. -- 2015. -- № 1 (48). -- С. -- 190--194.

РАЗДЕЛ 4. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ АОРТЫ И СОСУДОВ МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОГО РУСЛА У НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ - ПОТОМКОВ РОДИТЕЛЕЙ-«КУРИЛЬЩИКОВ»

Гистологически на поперечном срезе стенка аорты новорожденного крысенка представлена несколькими эластическими мембранами, отделенными друг от друга слоями фуксинофильного вещества с лежащими в его толще овальными пиронинофильными клетками с продолговатым ядром (гладкомышечными клетками) и коллагеном.

Изучение строения стенки аорты контрольных животных показало ее морфофункциональную незрелость, а именно: эластические мембраны в некоторых участках по периметру, предположительно по внутреннему диаметру дуги аорты, отсутствуют вовсе, и стенка аорты представлена только соединительной тканью. Стенка аорты измерена и посчитано количество эластических мембран на участках внешнего диаметра дуги аорты (рис. 4.1, табл. 4.1).

Рис. 4.1. Стенка аорты контрольного животного.

Окраска пикрофуксином по Ван Гизон.Ув. 400.

У потомков гр. М наблюдается очень заметное утолщение стенки аорты (рис. 4.2) и ускорение созревания эластического каркаса аорты, т.к. практически нет участков по периметру аорты, где эластические мембраны не были представлены. Кроме того, количество эластических мембран по толщине стенки увеличено по сравнению с гр. К (табл. 4.1).

Рис. 4.2. Стенка аорты животного гр.М. Утолщение стенки, увеличение количества эластических мембран. Окраска гематоксилином-эозином. Ув. 400.

Новорожденные потомки гр. О имеют аорту также с утолщенной стенкой, хотя и в меньшей степени, чем в гр. М (рис. 4.3). При этом, оказывается, эластический каркас стенки аорты развит в меньшей степени, чем в гр. К.

В гр. МО гистологической разницы с гр. М в строении стенки аорты не обнаружено, т.е. имеет место утолщение стенки и большая зрелость эластического каркаса по сравнению с гр. К (рис. 4.4).

Измерение толщины двух слоев стенки аорты комплекса интима-медиа отдельно у новорожденных потомков мужского и женского пола показало, что у самок стенка аорты более толстая, чем у самцов (табл. 4.1), и эта особенность сохраняется во всех основных группах. Хотя курение матери (гр. М и гр. МО) уменьшает половую разницу, т.е. разницу между самками и самцами в каждой из этих групп.



Рис. 4.3. Стенка аорты животного гр.О. Утолщение стенки и небольшое количество эластических мембран.

Окраска пикрофуксином по Ван Гизон. Ув. 400.

Подсчет количества эластических мембран на срезе стенки аорты в местах наибольшей их представленности позволил выявить, что потомки «курящей» матери имеют наибольшее количество эластических мембран (7,8±0,3, тогда как в Кгр. - 5,0±0,2, Рк-м <0,001). В гр. О максимальное количество слоев эластических мембран в стенке аорты составляет 5,3±0,3, Рo-к >0,05. В гр. МО значение этого показателя занимает среднее положение между значениями в гр. М и в гр. О: 6,6±0,4, Рк-о <0,001.

Кроме того, использовали еще один показатель для оценки эластичности стенки аорты новорожденных крысят, а именно общую толщину эластических мембран по поперечному сечению стенки аорты. Общая толщина эластических мембран увеличена у крысят всех основных групп, причем максимально - в гр. М, минимально, но с достоверным отличием от гр. К - в гр. О (табл. 4.2)

Таблица 4.1 Толщина стенки аорты (интима-медиа) у новорожденных крысят (мкм) (M±m)

Групы крыс	Самцы	Самки
Гр. К	32,2±0,7	39,2±0,8, р>-+<0,01
Гр. М	51,9±2,2 Рк-м <0,001	53,0±1,5, р>-+>0,05 Рк-м <0,001
Гр. О	43,3±0,9 Рк-о <0,001 рм-о<0,01	48,2±1,9, р>-+<0,05 Рк-о <0,01 Рм-о <0,05
Гр. МО	48,3±1,5 Рк-мо <0,001 Рм-мо >0,05 Рo-мо <0,05	52,0±1,9, р>-+>0,05, Рк-мо <0,001 Рм-мо >0,05 Рo-мо >0,05

При этом оптическая плотность цитоплазмы гладкомышечных клеток в стенке аорты, определенная на микропрепаратах, окрашенных галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону, у крысят всех основных групп также больше, чем в гр.К, что свидетельствует о повышенном содержании рибосом в цитоплазме гладкомышечных клеток (табл. 3.2). Максимальное увеличение оптической плотности наблюдается в гр. О и в гр. МО, а в гр. М - значение этого показателя существенно меньше, хотя достоверно больше, чем в гр. К. При подсчете количества ядер гладкомышечных клеток в сегменте стенки аорты (175мкм) оказалось, что у крысят гр. О это показатель наивысший (31,2±1,1экз., гр.К - 25±0,9экз., р<0,05), а в гр. М и гр. МО - пониженный (соответственно 22± 0,8экз., р<0,05 и 19±0,6экз., р<0,05).

Можно сделать вывод о том, что «курение» самки до и во время беременности приводит к внутриутробному ускорению созревания ткани стенки.

Таблица 4.2 Общая толщина эластических мембран и оптическая плотность цитоплазмы гладкомышечных клеток (окраска галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону) в стенке аорты (M±m)

Группы крыс	Оптическая плотность цитоплазмы гладкомышечных клеток (усл.ед.опт.пл.)	Общая толщина эластических мембран (мкм)
Гр. К	0,022±0,002	68,47±6,79
Гр. М	0,034±0,003 р<0,001	166,77±11,05 р<0,001
Гр. О	0,065±0,006 р<0,001	101,09±11,09 р<0,001
Гр. МО	0,058±0,005 р<0,001	145,34±5,6 р<0,001

аорты у потомков, утолщению ее и увеличению количества и общей толщины эластических мембран в каркасе; гладкомышечные клетки стенки аорты содержат увеличенное количество РНК, что указывает на активацию белоксинтетической функции этих клеток, а ведь максимальную часть синтезируемых белков в гладкомышечных клетках представляют сократительные белки.

«Курение» самца - будущего отца в течение 1 месяца перед спариванием приводит к минимальной среди основных групп гипертрофии эластических мембран без их гиперплазии, при этом стенка аорты более толстая, чем у контрольных животных, а цитоплазма гладкомышечных клеток имеет максимальную оптическую плотность при окраске на нуклеиновые кислоты.

В гр. МО наблюдается усреднение всех выявленных морфометрических показателей по сравнению с гр. М и гр. О.

Для изучения особенностей развития сосудов микроциркуляторного русла у потомков при табакокурении родителей использованы почка и головной мозг. В ткани коркового вещества почки изучались капиллярные клубочки. Почечные клубочки новорожденных крысят выглядят комочком плотной ткани в полости капсулы Шумлянского-Боумена. Капилляры клубочков находятся в спавшемся состоянии, т.к. имеют мягкую стенку, а кровь, очевидно, после умерщвления животных вышла в венозные сосуды. Поэтому, изучая размеры клубочков, можно судить о степени развития капилляров в них.

У контрольных животных в коре почки имеется большое количество клубочков, которые равномерно распределены в коре (рис. 5). Среднее количество клубочков в поле зрения при 100х составляет 5,4±0,3экз.



Рис. 4.5. Кора почки новорожденного крысенка гр. К.

Окраска гематоксилином-эозином. Ув.100.