РПГА

РНАт

РКА

ИРМА

ИФА

РАГА

Минимальное определяемое кол-во бактерий в чистой ультуре мкл/мл

1х10⁴-1х10⁶

7,5х10³-1,5х10⁴

9,7х10⁴-5,2х10⁵

7,5х10⁴

2,5х10⁵

1х10⁷-1х10⁸

1х10 - 1х10³

2х10⁴- 1х10⁵

не определяли

Минимальное определяемое кол-во бруцелл в смеси с другими бактериями мкл/мл

1х10⁵-1х10⁷

7,5х10³-1,5х10⁴

1х10⁵-1х10⁶

1х10⁵-1х10⁶

1х10⁸ неспецифическая агглютинация

1х10²-1х10⁴

2х10⁴-1х10⁵

не определяли

Минимальное определяемое кол-во антигена ЛПС

не определяли

0,1 нг/мл

10-20 нг/мл

1-5 нг/мл

100 нг/мл

0,01-0,1 пкг/мл

1-5 нг/мл

0,9-3,5 нг/мл

Время проведения анализа в час.

1,5-2

2-3

2-3

3-4

0,5-1

2-3

2-3

2-3

РИФ - реакция иммунофлуоресценции; ФИАВР - иммунофлуоресцентный анализ с временным разрешением; РПГА- реакция пассивной гемагглютинации; РНАт- реакция нейтрализации антителРКА- реакция Ко-агглютинации; ИРМА-иммунорадиометрический анализ; ИФА- иммуноферментный анализ; РАГА- реакция агрегат гемагглютинации;

- РИФ, является экспрессным, позволяющим визуально наблюдать цельную клетку, чувствительность которого составляет 1х10⁶м.кл/мл. РИФ может быть использован для установления чувствительности бруцелл к антибиотикам непосредственно в первичном посеве исследуемого материала. При этом концентрация бруцелл в исследуемой пробе должна быть не менее 1х10⁶ мкл/мл, а длительность термостатной инкубации посевов - 24 ч при 37°С.

- ФИАВР обладает более высокой чувствительностью для выявления растворимых и корпускулярных специфических антигенов. Анализ имеет высокую специфичность и позволяет выявлять бруцеллезные антигены в смеси с гетерологичными микроорганизмами без снижения чувствительности. ФИАВР может быть использован как в эпидемиологической, так и клинической практике. Однако ФИАВР имеет ряд недостатков, основными из которых являются - необходимость высокой чистоты проведения анализа и специального импортного оборудования для учета реакции.

- реакции, основанные на феномене гемагглютинации (РПГА, РНАт, РАГА)- обладают высокой чувствительностью, специфичностью, достоверностью, простотой исполнения, возможностью получения быстрого ответа (2-4 часа), однако, существенным недостатком является нестабильность и нестандартность эритроцитарных диагностических препаратов;

- реакция РКА показала низкую диагностическую эффективность, на 2-3 порядка уступающую результатам РНАт, РИФ и ИФА, что не позволяет рекомендовать её в целях ранней диагностики и индикации возбудителя и его растворимых антигенов;

- чувствительность ИРМА при выявлении бруцелл в присутствии посторонней микрофлоры, а также составляющих частиц почвы, материала кирпича, была на 2 порядка выше, чем РНАт и ИФА; у больных бруцеллезом - в 2 раза чаще, чем при использовании ИФА; выявление специфического антигена у биопробных животных удавалось в ранние сроки (1 сутки вместо 3 - при бактериологическом методе), в том числе с отрицательным результатом посева. Однако следует отметить, что ИРМА обладает рядом существенных недостатков, затрудняющих применение его в широкой практике, в первую очередь, из-за использования радиоактивной метки, специальных приборов для учета метода, специальной лаборатории, где возможно проведение этого анализа, необходимости большого числа повторов анализа (10-12) и сложной статистической обработки. Учитывая вышеизложенное, эффективное использование ИРМА возможно в крупных лабораториях, либо в условиях институтов. Особое место этот анализ занимает в проведении научно-исследовательских работ по изучению патогенеза инфекционных заболеваний, вызванных как бактериальными, так и вирусными агентами.

- преимущество ИФА перед традиционными иммунологическими тестами, главными из которых являются высокая чувствительность, специфичность, возможность получения количественных данных, воспроизводимость, стандартизация основных ингредиентов анализа, возможность исследования сильно загрязненных образцов, биологических жидкостей и экстрактов, возможность автоматизации всех этапов постановки и чета реакции. Результаты проведенных исследований позволили рекомендовать ИФА для определения чувствительности бруцелл к антибиотикам непосредственно в первичном посеве исследуемого материала и получить быстрый ответ (длительность термостатной инкубации посевов - 24 часа при 37°С).

Сравнительный анализ разработанных иммунологических тестов показал, что методом выбора для выявления бруцелл и их растворимых антигенов в объектах внешней среды и биологическом материале являются РИФ и ИФА.

Значение ПЦР в системе эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией.

В настоящее время для индикации, идентификации бруцелл и лабораторного подтверждения диагноза используют молекулярно-биологические методы исследования, в частности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий в короткие сроки (в течение рабочего дня) определить наличие специфической последовательности ДНК бруцелл в пробах как клинического, так и полевого материала.

Для постановки ПЦР сотрудниками лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН совместно с нашей лабораторией была разработана тест-система, в которой использовали праймеры, синтезированные на основе последовательности гена BCSP31, кодирующего синтез поверхностного белка наружной мембраны B.abortus размером 31 кД. Родоспецифические праймеры: прямой праймер Br1 5`- AGT CAG ACG TTG CCT ATT G-3` и обратный праймер Br2 5`- GTG TTC AGC CTT GAT ATC G-3` фланкировали фрагмент ДНК размером 260 п.н. и обеспечивали высокую специфичность ПЦР.

Чувствительность и специфичность тест-системы ПЦР при идентификации и индикации бруцелл

Первоначально была изучена эффективность тест-системы ПЦР в экспериментах на чистых культурах. При изучении специфичности было показано, что использование синтезированных праймеров обеспечивает синтез амплификационного фрагмента ДНК размером 260 н.п. с ДНК бруцелл всех видов. Использованные праймеры Br1 и Br2 оказались родоспецифическими. ДНК бактерий, перекрестно-реагирующих с бруцеллами в серологических реакциях (V. cholera, Y. enterocolitica, F. tularensis, E. coli, Y. pestis и др.), не служила матрицей для синтеза выбранного фрагмента ДНК и результат ПЦР был отрицательный.

Таблица 2. Индикация бруцелл в тест-пробах из объектов внешней среды и биологических объектов с помощью ПЦР

Инфицированные пробы	Число микробных клеток в 1 мл	Кол-во проб	Положительный результат % Тест- штаммы
			B.abortus 99	B.suis 1330
Кровь человека	1х105	30	100	100
	1х104	30	100	100
	1х103	30	90.0±5,6	90,0±5,6
	1х102	30	70,0±8,5	70,0±8,5
	1х101	30	20,0±7,4	20,0±7,4
Органы животных (селезенка)	1х105	30	100	100
	1х104	30	100	100
	1х103	30	90,0±5,6	90,0±5,6
	1х102	30	70,0±8,5	70,0±8,5
	1х101	30	23,0±7,8	23,0±7,8
Речная вода	1х105	45	100	100
	1х104	40	100	100
	1х103	30	100	100
	1х102	30	83,0±7,0	83,0±7,0
	1х101	30	60,0±9,1	60,0±9,1
Почва	1х105	30	100	100
	1х104	30	100	100
	1х103	30	50,0±9,3	50,0±9,3

После подтверждения специфичности реакции данные праймеры были использованы для определения чувствительности метода. С этой целью мы осуществили постановку ПЦР с лизатами клеток бруцелл убывающей концентрации от 10⁵ до 10¹ м.кл/мл. Количество вносимых клеток определяли титрованием суспензий на твердой питательной среде. Специфический фрагмент 260 п.н. определялся во всех образцах лизатов, в том числе и полученных из концентрации 10 м.кл/мл, что определяло порог чувствительности метода ПЦР.

Изучение чувствительности ПЦР при индикации бруцелл в объектах внешней среды и биологических объектах было проведено на тест-пробых, искусственно контаминированных B. abortus 99 и B. suis 1330 в различных концентрациях (табл 2).

При исследовании проб, контаминированных обоими видами бруцелл в концентрации 1х10⁴ м.кл/мл, ПЦР была положительной в 100% случаев. По мере уменьшения количества бруцелл в пробах снижался процент положительных результатов и оставался значительным при исследовании проб речной воды 60,0±9,1% и почвы 50,0±9,3%, содержащих десять клеток. При этой концентрации клеток в 2-3 раза был ниже процент положительных результатов в пробах крови (20,0±7,4%) и в органах животных (23,0±7,8%).

Диагностическая ценность ПЦР в клинической практике

Оценку эффективности ПЦР в лабораторной диагностике бруцеллеза в клинической практике осуществляли при исследовании 231 образца сывороток крови людей больных различными формами бруцеллеза. Все обследованные были разделены на 3 группы (табл. 3).

Образцы сывороток тестировали с помощью ПЦР, традиционных серологических реакций (РА, РК, РПГА, РХ) и ИФА.

При исследовании сывороток крови людей, больных острой (I группа), подострой (II группа) и хронической формой (III группа) бруцеллеза с помощью ПЦР были получены положительные результаты практически у всех обследованных больных (96,33,7±%, 100% и 95,9±1,6% соответственно). Следует отметить, что все больные находились на стационарном лечении и были обследованы в период активного течения инфекционного процесса с выраженными клиническими проявлениями. Частота положительных ответов в серологических реакциях при этих формах заболевания подтверждали активность инфекционного процесса. Наиболее эффективными серологическими тестами при диагностике всех форм заболевания явились РК и ИФА, с помощью которых бруцеллезные антитела были выявлены в 100% - 97,1±2,9 случаев при острой и подострой и в 79,3±3,1 - 82,2±2,9% при хронической формах бруцеллеза (соответственно).

Полученные результаты свидетельствуют о высокой диагностической эффективности ПЦР в клинической практике.

Значение ПЦР в эпидемиологической практике

Важным разделом нашей работы было определение возможности использования ПЦР для проведения эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией и оценка информативности различных методов лабораторной диагностики при обследовании лиц, относящихся к группам риска заражения бруцеллезом. Всего было обследовано 440 человек (табл.4) из них:1 группа - сотрудники специализированной лаборатории (9 человек), П группа - работники биокомбината (79 человек), Ш группа - мясокомбината (200 человек), 1V - молочно-товарной фермы (20 человек), а также V группа - контактные лица в очаге бруцеллеза мелкого рогатого скота (104 человека) и V1 - крупного рогатого скота (20 человек).

При обследовании сотрудников лаборатории , постоянно контактирующих с живыми культурами бруцелл (I группа), выявили наличие ДНК бруцелл во всех образцах. Все сотрудники лаборатории были ранее вакцинированы живой бруцеллезной вакциной из штамма B.abortus 19BA, а один сотрудник болен хронической формой бруцеллеза.

Группа II - сотрудники биокомбината, на котором изготавливают живые бруцеллезные вакцины из штаммов B. abortus 19 и 82, используемые в ветеринарной практике. Сотрудники биокомбината не были вакцинированы против бруцеллеза и в плановом порядке никогда ранее не обследовались на бруцеллез. Несмотря на непрерывный закрытый процесс выращивания бактериальной массы в ферментерах, не исключалась возможность прямого контакта персонала с живыми культурами бруцелл вакцинных штаммов, в том числе с штаммом B.abortus 82, имеющим высокую остаточную вирулентность. Этим можно объяснить столь частые находки ДНК бруцелл в ПЦР( 91,1±3,2%), а также положительные результаты серологических реакций (77,2±4,8% - РПГА, 74,7±4,9% - РК и 89,9±3,6%ИФА.

В системе эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией важное место занимает плановое серологическое обследование профессиональных групп, являющихся группами риска заболевания бруцеллезом. В этой связи нами были обследованы сотрудники мясокомбината, который является современным высоко технологичным предприятием, работающим на привозном, замороженном сырье и где забой скота не производится (группа III). Из таблицы 4 видно, что у четырех обследованных (2,0±1,0%) в сыворотке крови была выявлена ДНК бруцелл, а также специфические антитела. При последующем тщательном клиническом обследовании у этих сотрудников был диагностирован бруцеллез в хронической форме.

Обследование сотрудников молочно-товарной фермы (группа IV), на которой животные были вакцинированы живой бруцеллезной вакциной B.abortus 82 (Оренбургская область), позволило выявить ДНК бруцелл в образцах сывороток крови с помощью ПЦР в 89,3±5,9% случаев. Специфические антитела были выявлены в сыворотках крови только у 42,9±9,5% обследованных. При этом клинические проявления бруцеллеза у сотрудников фермы не были выявлены. По видимому присутствие ДНК бруцелл в крови обследованных сотрудников МТФ при отсутствии клинических проявлений бруцеллеза свидетельствуют о «проэпидемичивании» их в результате попадания во внешнюю среду вакцинного штамма 82. В этих случаях ПЦР не имеет диагностической ценности, а лишь демонстрирует наличие ДНК вакцинного штамма в организме персонала МТФ.

Следует отметить, что в большинстве случаев обострение эпидемиологической ситуации по бруцеллезу на благополучных территориях связано с бесконтрольным завозом больных животных из регионов неблагополучных по бруцеллезу сельскохозяйственных животных. Так, в 2003 г были зарегистрированы случаи заболевания людей бруцеллезом в Зоопитомнике Московского зоопарка. При обследовании очага инфекции и изучении эпизоотологической обстановки было выявлено, что источником заражения людей бруцеллезом оказались овцы гиссарской породы (6 голов), привезенные в 2002 году из Таджикистана. Лабораторное обследование с помощью серологических тестов и ПЦР всех сотрудников Зоопитомника и подсобного хозяйства позволило выявить 36 лиц (34,6±4,7%), инфицированных возбудителем бруцеллеза, в 6 (16,7±6,3%) из них верифицирован диагноз бруцеллеза. ПЦР была положительной у 32,7±4,6% обследованных, в двух случаях при положительном результате РХ, ПЦР была отрицательной (группаV). Следовательно, в очаге бруцеллеза МРС, возникшем на ранее благополучной территории, наиболее информативным лабораторным методом была ПЦР.

В группе лиц (группа VI), обследованных в очаге бруцеллеза крупного рогатого скота (частный сектор), у всех контактировавших с больным животным ПЦР была положительной. Ни в одном случае не были выявлены специфические антитела и клинические проявления бруцеллезной инфекции, что можно объяснить слабой вирулентностью коровьего вида бруцелл. Следует отметить, что частный скот не был вакцинирован против бруцеллеза.

Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность ПЦР как в клинической, так и эпидемиологической практике. ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью, она давала положительный ответ у больных хроническим бруцеллезом с большой давностью инфекционного процесса. Изучение эффективности ПЦР в эпидемиологической практике позволило установить инфицирование людей не только полевыми штаммами бруцелл, но и вакцинными, применяемыми для иммунопрофилактики животных. Показано, что контакт людей с вакцинными препаратами с высокой остаточной вирулентностью не является безразличным для организма. У ряда работников биокомбината, где производится вакцина из штамма 82, развивались клинические проявления болезни. Сравнительный анализ диагностических возможностей общепринятых серологических реакций и ПЦР в этих случаях показал преимущество ПЦР, а также ИФА, которые способствовали уточнению диагноза бруцеллеза. Однако очень высокая чувствительность ПЦР требует иных подходов к клинической интерпретации результатов. Необходимо учитывать тот факт, что попадание возбудителя бруцеллеза в организм человека не всегда вызывает развитие инфекционного процесса , особенно при контакте с малыми дозами или слабо патогенными видами бруцелл. Кроме того, в России значительное число сельскохозяйственных животных ежегодно прививают против бруцеллеза. При этом используют живые бруцеллезные вакцины, которые создают не стерильный иммунитет и длительное время вакцинный штамм выделяется в окружающую среду. Лица, обслуживающие этих животных, также контактируют с вакцинными штаммами и могут иметь положительный результат в ПЦР. Аналогичная ситуация может создаваться на предприятиях, перерабатывающих продукты животноводства, где производится забой вакцинированных животных или употребление непастеризованных молочных продуктов. Все это необходимо учитывать при получении положительных результатов ПЦР у людей без клинических проявлений, как и положительных результатов серологических тестов при отсутствии клиники. В этих случаях важным является тщательно собранный эпидемиологический анамнез и комплексное клинико-лабораторное обследование пациента.

Высокая специфичность ПЦР может помочь при проведении дифференциальной диагностики бруцеллеза с другими инфекционными заболеваниями, возбудители которых имеют общие антигенные детерминанты с бруцеллами.

Лабораторные методы для оценки иммунного ответа при бруцеллезной инфекции

Для объективной оценки активности инфекционного процесса и характера иммунологической перестройки организма при бруцеллезной инфекции необходимо знание физико-химической природы синтезирующихся специфических антител, что имеет важное значение для диагностики бруцеллеза - инфекции с хроническим течением, частыми рецидивами и повторным инфицированием лиц, профессионально связанных с животноводством.

В последние годы большое внимание уделялось ИФА, возможности его использования для диагностики бруцеллеза у животных и людей, а также выявления с его помощью специфических иммуноглобулинов разных классов (G, A, M).

Нами были отработаны оптимальные условия проведения ИФА для выявления специфических антител при бруцеллезе у людей и изучена его специфичность и чувствительность.

В качестве твердофазного носителя применяли отечественные планшеты для иммунологических реакций. Для сенсибилизации полистирола использовали ЛПС из штамма B. abortus 99.Для получения пероксидазного конъюгата применяли кроличьи сыворотки против IgG (H + L) человека. Оптимальной концентрацией ЛПС бруцелл для сенсибилизации планшетов является 1мкг/мл, иммобилизацию планшетов проводили 2 ч при 37єС или 16 ч при 4єС. Реакцию взаимодействия антиген-антитело проводили 1 ч при 37єС. Рабочее разведение конъюгата 1:400.Результаты учитывали на фотометре фирмы «Flow Laboratories» при длине волны 492 нм, положительным считали результат, более чем в 2 раза превышающий ОП в лунках с отрицательными контролями. Последующую постановку реакции осуществляли с соблюдением этих условий.

Специфичность ИФА была изучена при исследовании 143 сывороток людей, из них 63 от доноров, 42 - лиц с различными заболеваниями (сальмонеллез, паратиф, гастроэнтероколит, полиартрит и ОРВИ). Учитывая возможность перекрестных серологических реакций между бруцеллами и другими микроорганизмами, в том числе и возбудителем туляремии, было исследовано 38 сывороток крови людей, вакцинированных живой туляремийной вакциной. Эти сыворотки давали положительные результаты в РА и РПГА с туляремийными антигенами (микро- и макрометоды) в титре от 1:20 до 1:160.

Таблица 3. Сравнительное изучение эффективности ПЦР в клинической практике бруцеллезной инфекции.

Форма заболевания	Результаты лабораторных методов исследования
	РА	РК	РПГА	ИФА	ПЦР
	% пол.	титр*	% пол.	титр*	% пол.	титр*	% пол.	титр*	Пол	%
Острая n=27	92,6± 5,3	1:1000	100	1:2000	88,9±6,2	1:640	100	1:25600	26	96,3± 3,7
Подострая n=35	88,6± 5,3	1:400	97,1± 2,9	1:5000	85,7±6,0	1:200	97,1± 2,9	1:10000	35	100
Хроническая n=169	44,4± 3,8	1:100	79,3± 3,1	1:800	32,0±3,6	1:200	82,2± 2,9	1:5120	162	95,9± 1,6

Примечание: *- средняя величина геометрического титра

Таблица 4 Сравнительное изучение эффективности ПЦР в эпидемиологической практике бруцеллезной инфекции.

№ группы обследованных

Результаты лабораторных методов исследования

РА

РК

РПГА

ИФА

РХ

ПЦР

% пол.

Ср. титр*

% пол.

ср. титр*

% пол.

Ср. титр*

% пол.

Ср. титр*

% сом.

% пол.

Пол

%

I n=9

-

-

100

1: 128

-

-

100

1: 1000

55,6± 17,6

11.1± 11,1

9

100

II n=79

32,2± 8,9

1:80

74,7± 4,9

1: 256

77,2±4,8

1:128

89,9±3,6

1: 4000

48,1± 5,7

20,3± 4,6

72

91,1± 3,2

III n=200

1,0± 0,7

1:50

1,0± 0,7

1:64

-

-

2,0± 1,0

1: 800

1,0± 0,7

0,5± 0,49

4

2,0± 1,0

IV n=28

3,6± 3,6

1:50

35,7± 9,2

1:80

-

-

42,9±9,5

1: 800

25,0± 8,3

7,1± 4,9

25

89,3± 5,9

V n=104

3,8± 1,9

1:200

2,8± 1,6

1: 320

2,8±1,6

1:320

4,8± 2,1

1: 1600

12,5 ±3,2

4,8± 2,1

34

32,7± 4,6

VI n=20

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

20

100

Примечания: *- средняя величина геометрического титра, « - » - результат отрицательный. I - сотрудники лаборатории, постоянно контактирующие с живыми культурами бруцелл; II- сотрудники биокомбината; III- сотрудники мясокомбината; IV- сотрудники молочно-товарной фермы; V - лица, обследованные по эпидпоказаниям в очаге бруцеллеза мелкого рогатого скота (профессиональная группа); VI - лица, обследованные по эпидпоказаниям в очаге бруцеллеза крупного рогатого скота (частный сектор)

При исследовании гетерологичных сывороток в ИФА ни в одном случае не были выявлены антитела с бруцеллезным антигеном, что свидетельствует о высокой специфичности этого теста.

Чувствительность ИФА изучена при исследовании сывороток крови больных с острой и хронической формой бруцеллеза (табл. 5). Следует отметить, что больные хронической формой бруцеллеза были обследованы в период обострения заболевания в условиях стационара. Параллельно эти сыворотки исследовали в РА, РПГА, и РК.

Таблица 5. Результаты сравнительного изучения эффективности серологических реакций при различных клинических формах бруцеллеза

Реакции	Клиническая форма бруцеллеза
	Острая (n = 23)	Хроническая (n=111)
	Число положительных результатов	Средний титр*	Число положительных результатов	Средний титр*
	абс	%		абс	%
РА	19	82,6±8,08	1:316	46	41,6±44,68	1:125
РПГА	19	82,6±8,08	1:200	37	33,3±4,47	1:200
РК	23	100	1:630	92	82,9±3,57	1:256
ИФА	23	100	1:3200	96	85,6±3,24	1:1600

*- средняя величина геометрического титра.

При острой форме бруцеллеза совпадение положительных результатов ИФА с РА и РПГА было установлено в 82,6%, а ИФА и РК-в 100%.

При обследовании больных хроническим бруцеллезом у 11 (9,9±2,8%) специфические антитела не были выявлены ни в одной серологической реакции. Совпадение положительных результатов в этой группе больных установлено для ИФА и РА в 45,0±4,7%, для ИФА и РПГА в 37,0±4,6%, а для ИФА и РК - 91,0±2,7% случаев.

Титр антител в ИФА колебался от 1:400 до 1:51200. В разведении сывороток 1:100 абсолютные значения оптической плотности отрицательных контролей не превышали 0,1, а положительных сывороток составляла 1,4±0,6. Проведенные исследования позволили рекомендовать титр 1:400 как диагностический, так как все сыворотки больных бруцеллезом имели титр выше 1:200, а сыворотки контрольной группы не давали положительных неспецифических реакций в разведении 1:100.

Проведенные исследования позволили отработать оптимальные условия постановки ИФА для выявления бруцеллезных антител в сыворотке крови людей, установить высокую специфичность и чувствительность ИФА для определения бруцеллезных антител, которая превышала в 5-16 раз чувствительность используемых в практике методов РК, РПГА, и РА. Нами, совместно с сотрудниками лаборатории люминесцирующщих сывороток НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи была разработана тест-система диагностическая для выяления специфических антител иммуноферментным методом при бруцеллезе у людей.

Аналогичные условия проведения ИФА применялись при выявлении специфических IgG, A, M, E - антител. В качестве конъюгатов были использованы анти IgG, A, M, E - человека и мыши(Sigma, США).

Динамика синтеза специфических иммуноглобулинов при экспериментальном бруцеллезе

Развитие методов иммунодиагностики, в частности, ИФА, имеющего ряд преимуществ перед рутинными методами, позволило провести исследования по изучению динамики синтеза специфических IgG, A, M-антител в эксперименте на мышах.

Нами была изучена динамика синтеза специфических иммуноглобулинов в различные фазы инфекционного процесса, вызванного инфицированием высоковирулентной культурой бруцелл (рис.9).



Рисунок.9. Синтез специфических IgM, IgG, IgA в динамике инфекционного процесса у мышей

Опыт проводили на 80 белых мышах, которых заражали вирулентной культурой бруцелл B. melitensis 575 в дозе 1х10³ микробных тел, подкожно в паховую область. Зараженных животных вскрывали в различные фазы инфекционного процесса и проводили бактериологические и серологические (РА, РК и РПГА) исследования. Уровень IgG, A и М определяли в ИФА с использованием коньюгатов анти-IgG,A,M мыши (Sigma).

Бруцеллезная инфекция у белых мышей последовательно проходит 3 фазы: адаптации, регионарной и генерализованной инфекции. Продолжительность этих фаз обусловлена вирулентностью и дозой вводимой культуры.

Проведенные исследования выявили определенные закономерности синтеза специфических иммуноглобулинов. Развитие инфекционного процесса у белых мышей, зараженных вирулентной культурой бруцелл, характеризуется поэтапным синтезом специфических иммуноглобулинов IgM (9 сутки), IgG (21сутки), IgA (30 сутки). Период выраженной диссеминации возбудителя в макроорганизме (генерализованная фаза) характеризуется наличием специфических IgM и IgG антител. Определение IgM после завершения генерализации инфекционного процесса свидетельствует о сохранении возбудителя в макроорганизме. Длительный синтез IgG-антител обеспечивается наличием в макроорганизме растворимого антигена.

Результаты наших исследований согласуются с данными других авторов полученными с различными бактериальными агентами и свидетельствуют о том, что этапность синтеза иммуноглобулинов разных классов при введении антигенов является общебиологической закономерностью.

Знание закономерности синтеза специфических иммуноглобулинов разных классов имеет практическое значение, так как эти данные позволяют оценить давность инфицирования организма животных и людей, что важно в эпидемиологической практике при обследовании очага инфекции и в клинической диагностике.

Оценка уровня специфических JgG, IgA, IgM антител при различных формах бруцеллеза у людей с помощью ИФА.

Нами обследовано 514 больных бруцеллезом, у которых клинический диагноз был подтвержден исследованием сывороток крови общепринятыми методами - РА, РК, РПГА.

Острая и подострая формы бруцеллеза характеризуются наличием в сыворотках крови специфических антител всех классов иммуноглобулинов в высоких титрах (табл.6 и 7).

У большинства больных хроническими формами заболевания остается высоким уровень IgG и IgA, специфические антитела класса IgM регистрируются у половины обследованных и в более низком титре низком титре.

Далее был проведен анализ результатов совместного выявления различных классов иммуноглобулинов (табл.7).

Таблица 6. Уровень специфических иммуноглобулинов разных классов у больных бруцеллезом

Форма бруцеллеза	Уровень иммуноглобулинов
	IgG	IgA	IgM
	% пол.	титр*	% пол.	титр*	% пол.	титр*
Острая n=96	96,9±1,8	1:25600	96,6±1,8	1:4000	96,6±1,8	1:1280
Подострая n=46	100	1:16000	100	1:2500	100	1:1000
Первично-хроническая n=60	91,7±3,6	1:5200	70,0±5,9	1:1000	53,4±6,5	1:256
Вторично-хроническая n=312	91,7±1,6	1:5000	75,6±2,4	1:1280	55,0±2,8	1:320

*-средняя величина геометрического титра

Таблица 7 Совместное выявление специфических иммуноглобулинов G,A,M при различных формах бруцеллеза

Форма бруеллеза	Частота выявления (в % )
	IgG+IgM+IgA	IgG+IgA	IgG+IgM	IgG	IgA	IgM
Острая N=96	97,8±2,8	1,04±1,04	1,04±1,04	-	-	-
Подострая n= 46	97,8±2,2	2,2±2,1	-	-	-	-
Первично-хроническая n= 60	35,0±6,2	35,0±6,2	16,7±4,8	5,0±2,8	-	1,7±1,7
Вторично-хроническая n=312	47,1±2,8	26,3±2,3	8,7±1,6	9,9±1,69	2,2±0,8	-

В хронической стадии бруцеллеза все 3 класса иммуноглобулинов - IgG, IgM, IgА чаще определялись при вторично-хронической форме (47,1±2,8%), что подтверждало более выраженный инфекционный процесс у данных лиц, перенесших острую форму заболевания. Одновременное выявление антител IgG и IgA, наоборот, чаще регистрировалось при первично-хроническом бруцеллезе. Отличительным для хронических форм являлась совместная циркуляция IgG и IgM антител, а также отдельно - IgG, IgA и IgM. Такое разнообразие сочетаний иммуноглобулинов различных классов у больных хроническим бруцеллезом связано с возможностью реинфицирования людей, находящихся в очагах инфекции. Важно отметить, что выявление IgM, отражающих свежее инфицирование, чаще регистрировалось в сочетании как с IgG, так и отдельно у больных первично-хроническим бруцеллезом, что наводит на мысль о большей вероятноти повторного заражения у этой категории лиц.

Ведущее место в клинике бруцеллеза занимает поражение опорно-двигательного аппарата. Сравнительное изучение содержания IgG, IgM, IgA у 119 больных хроническим бруцеллезом с поражениями костно-суставной системы, показало, что у больных с выраженными очаговыми поражениями островоспалительного характера (артриты, остеоартриты, спондилиты), уровень специфических иммуноглобулинов всех трех классов был значительно выше по сравнению с другими группами больных (с артралгиями или дегенеративными изменениями).

Проведенные исследования показали, что определение специфических иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM c использованием ИФА позволяет судить об активности инфекционного процесса, вероятности повторного заражения, характере местных воспалительных изменений со стороны костно-суставной системы, что, в конечном итоге, способствует улучшению диагностики и качества лечения.

Особенности персистенции бруцелл при инфекционном и вакцинальном процессах.

Развитие инфекционного процесса при бруцеллезе характеризуется диссеминацией бруцелл и их размножением в макрофагах хозяина. Хроническое течение инфекционного процесса у людей и животных связано со способностью бруцелл противостоять защитным антимикробным механизмам хозяина.

При персистенции возбудителя бруцеллеза в макроорганизме непрерывно происходят процессы адаптации, размножения, гибели, разрушения с последующей циркуляцией освободившихся растворимых антигенов. В этой связи особое значение имеет выбор методов, позволяющих следить за течением инфекционного процесса путем регистрации маркеров возбудителя (растворимый антиген, ДНК) бруцеллеза в крови больных людей и животных.

Нами была оценена возможность изучения персистенции бруцелл в организме экспериментально зараженных животных и людей с помощью бактериологического метода, а также ИФА и ПЦР.

Изучение антигенемии в динамике инфекционного и вакцинального процессов при бруцеллезе.

В работе использованы 83 морские свинки массой 300-350 г. Животных заражали подкожно вирулентным штаммом B.melitensis 565 в дозе 1х10² м.кл/мл и вакцинным B.abortus 19-BA -1х10⁹ м.кл/мл. Количество колоний бруцелл, выделенных из внутренних органов животных (лимфатические узлы, печень, селезенка, легкие) выражали в процентах индекса инфицированности (ИИ). Сыворотки крови исследовали до заражения и в динамике инфекционного (в течение 23 месяцев) и вакцинного (18 месяцев) процессов. Бруцеллезный антиген выявляли с помощью прямого ИФА. Полистироловые планшеты сенсибилизировали IgG-фракцией бруцеллезной кроличьей сыворотеи в концентрации 10 мкг/мл. В качестве коньюгата использовали ту же иммуноглобулиновую фракцию меенную пероксидазой хрена в разведении 1:400. Оптимальные концентрации IgG-фракции и коньюгата подбирали путем «шахматного» титрования. Количественное содержание антигена выражали в нг/мл, определяя его по калибровочной кривой, построенной по растворимому антигену (ЛПС), выделенному из B. abortus 99.

Использование ИФА позволило проследить динамику антигенемии у зараженных животных (рис.10). В фазе «адаптации» (начальные 15 суток), когда бактериологическим методом возбудитель бруцеллеза удается выделить в единичных случаях из внутренних органов (ИИ=10,2±5,4), тогда как специфический антиген выявлялся в сыворотке крови в количестве 4,57 нг/мл. В период от 15 до 60 суток возбудитель выделялся из внутренних органов животных ИИ= 86,7±10,0%. В тот же период («регионарная и генерализованная» фазы) специфический антиген выявлялся у 60,0±15,0 - 70,0±15,3% зараженных животных соответственно, а количество антигена колебалось от 4,5± 1,8 до 5,9± 1,98 нг/мл. Спустя 3 месяца после заражения ИИ постепенно уменьшался и к 12 месяцу возбудитель не выделялся. По мере снижения ИИ с 3-го месяца начинал возрастать уровень специфического антигена, достигая максимума к 12-14 месяцам в концентрации 18,3±3,2 и 18,5±3,8 нг/мл у 71,4±15,6 и 80,0±15,1 % инфицированных животных соответственно. В более отдаленные сроки (23 месяц предельный срок наблюдения) уровень антигена снизился в 3-4 раза и составил 4,7±3,5 нг/мл у всех обследованных животных.

Рисунок 10. Уровень антигенемии в динамике инфекционного процесса.

По оси абсцисс - сроки исследования, фазы инфекционного процесса. По оси ординат - количество антигена (нг/мл); индекс инфицированности (%). Штриховка-развитие инфекционного процесса по индексу инфицированности.

Таким образом, периоду повышения уровня антигена в крови предшествует интенсивное внутриклеточное размножение бруцелл, сопровождающееся выраженной пролиферацией клеток ретикулоэндотелия. Первичный очаг воспаления в ответ на введение бруцелл характеризуется выраженной макрофагальной реакцией и частичной деструкцией бруцелл в макро- и микрофагах (П.А.Вершилова,1974). Возможно, этот первичный воспалительный очаг и является ранним источником поступления специфического антигена в кровяное русло.

Параллельно нами был изучен антительный ответ в РА, РПГА, РК как при наличии возбудителя в организме животных, так и в период, когда выявлялся только растворимый антиген (рис. 11).

Рисунок11. Результаты сравнительного изучения антигенемии и антителообразования в динамике инфекционного процесса. По оси абсцисс - сроки исследования, по оси ординат - столбики - количество антигена (нг/мл); - lg титра специфических антител ( 1- реакция агглютинации, 2- реакция Кумбса, 3- РПГА).

В начальной фазе инфекционного процесса выявляются агглютинины, гемаглютинины и неполные антитела, синтез которых мог быть обусловлен как наличием возбудителя, так и растворимого бруцеллезного антигена. В период выраженной антигенемии (7-16 месяцев после заражения) титры антител в РА и РПГА были такими же, как и в ранние сроки, в то время как уровень неполных антител (РК) повышался и сохранялся высоким в течение всего периода наблюдения. Эти данные позволяют предположить, что синтез неполных антител обусловлен наличием в организме животных растворимого бруцеллезного антигена.

При изучении вакцинального процесса, созданного с использованием живой вакцины B.abortus 19BA, выявлены те же закономерности, что и при инфекционном., а именно - увеличению количества циркулирующего антигена предшествует диссеминация вакцинного штамма бруцелл в организме животных. Так, в нестерильной фазе количество антигена в сыворотках крови колебалось от 8,5±2,8 до 4,3±1,6 нг/мл. В стерильной фазе, когда вакцинный штамм не выделяется, уровень специфического антигена возрастал до 11,7±7,6 - 10,1±3,0 нг/мл у 87,6% животных с последующим снижением к 18 месяцам (предельный срок наблюдения) до 6,3±4,9 нг/мл у 56.2% вакцинированных животных.

Учитывая тот факт, что длительная антигенемия, по-видимому, обусловлена персистенцией вакцинного штамма в организме животных, можно сделать заключение об отсутствии стерильной фазы иммунитета при вакцинальном процессе. Однако для окончательного решения этого вопроса необходимо проведение дополнительных исследований.

С помощью прямого ИФА уровень циркулирующего антигена был изучен у 21 больного острой и подострой и 43 больных хронической формами бруцеллеза (табл. 8). Специфический антиген выявлялся у большинства больных острой, подострой и хронической формами заболевания, при этом концентрация антигена у больных острой, подострой формами бруцеллеза составила 2,3±0,7, а при хронической 2,98±0,5 нг/мл .

Таблица 8 Выявление специфического антигена в сыворотках крови людей больных бруцеллезом с помощью ИФА

Форма бруцеллеза	Число больных	Выявлен бруцеллезный антиген
		% положительных	M±m (нг/мл)
Острая, подострая	21	87,5±7,8	2,3±0,7
Хроническая	43	65,1±9,2	2,98±0,5

Таким образом, проведенные исследования показали длительную циркуляцию бруцеллезного антигена у инфицированных и вакцинированных животных и людей больных бруцеллезом, что может свидетельствовать о персистенции живого возбудителя в макроорганизме.

Использование ПЦР для оценки персистенции возбудителя бруцеллеза у людей

Высокая специфичность, чувствительность и диагностическая эффективности ПЦР имеет большие преимущества перед существующими методами выявления бруцелл. ПЦР применяется с целью видовой и родовой идентификации штаммов бруцелл и для анализа клинических образцов в диагностике бруцеллеза людей и животных

Нами с помощью ПЦР были исследованы сыворотки крови людей больных хронической формой бруцеллеза. Параллельно с ПЦР в сыворотках крови определяли специфические антитела с использованием серологических реакций (РА, РК, РПГА и ИФА), а также проводили посевы крови на питательные среды для выделения культуры бруцелл.

Хроническая форма заболевания у обследованных больных характеризовалась выраженным клиническим течением инфекционного процесса. В 14,8±4,6 % случаях была выделена культура бруцелл (6 культур B.melitensis биовара 3, 2 культуры B.abortus биовара 1 и 1 культура B.suis биовара 4), а ПЦР была положительной у 93,4±3,2% больных. Выраженные серологические реакции у этих больных также подтверждали активность инфекционного процесса.

Нами были проанализированы результаты лабораторных исследований у больных хронической формой бруцеллеза в зависимости от давности заболевания (табл.9). Таблица демонстрирует, что с увеличением давности заболевания происходило снижение титров специфических антител в серологических реакциях, включая ИФА, уменьшение случаев выделения культур бруцелл. При этом ДНК бруцелл выявляли с помощью ПЦР во все сроки от начала заболевания (от 6 до 60 месяцев и более) практически у всех больных, независимо от проводимой терапии. ПЦР фиксирует минимальные количества ДНК возбудителя, что дает возможность косвенно судить о персистенции инфекционного агента в макроорганизме.

Таким образом, использование комплексного подхода, включающего бактериологический и серологические методы, включая ИФА, а также ПЦР, позволяет оценивать персистенцию возбудителя, судьбу его антигенов в организме и их влияние на динамику и исход инфекционного процесса.

Циркулирующий антиген в сыворотках зараженных животных выявлялся в фазе «адаптации», а периоду повышения количества антигена в крови предшествует интенсивное внутриклеточное размножение бруцелл с повышением индекса инфицированности, сопровождающееся выраженной пролиферацией клеток ретикулоэндотелия. Первичный очаг воспаления на введение бруцелл характеризуется выраженной макрофагальной реакцией и в дальнейшем частичной деструкцией бруцелл в макрофагах (Вершилова П.А. с соавт., 1974). Интенсивное антигенное раздражение вызывало выраженный синтез специфических антител, выявляемых в положительных серологических тестах. С 3-х месяцев наблюдения на фоне снижения индекса инфицированности начинал возрастать уровень специфического антигена, достигая максимума в поздние сроки после заражения, и общая динамика инфекционного процесса приобретала вид характерных "ножниц".

Следовательно, использование ИФА позволило установить длительный характер антигенемии при инфекционном и вакцинном процессах. Полученные результаты позволяют высказать предположение о том, что длительный синтез неполных антител (РК) при хроническом течении инфекции (глава 4) обусловлен наличием растворимого бруцеллезного антигена в макроорганизме.

Метод ПЦР открывает новые возможности в изучении патогенеза бруцеллеза, прежде всего, с учетом внутриклеточного паразитизма бруцелл. В случаях, когда низкая чувствительность методов не позволяет им выявлять антигены бруцелл, ПЦР анализ фиксирует минимальные количества ДНК возбудителя, что дает возможность косвенно судить о персистенции инфекционного агента в макроорганизме и вносит свои особенности в интерпретацию положительных результатов этого анализа.

Проведенные исследования позволили получить дополнительные сведения о патогенезе и иммуногенезе заболевания, что имеет важное значение для клинической практики и лабораторной диагностики бруцеллеза.

Таблица 9 . Результаты обследования больных хронической формой бруцеллеза с различной давностью заболевания

Давность заболевания (месяцы	Серологические методы	Бактер.	ПЦР
	РА	РК	РПГА	ИФА
	% пол.	титр*	% пол.	титр*	% пол.	титр*	% пол.	титр*	% пол.	% пол.
6-12 (n=25)	96,0± 4,0±	1:256	96,0± 4,0	1:640	88,0± 6,6	1:200	100	1:6400	24±	92,0± 5,5
12-24 (n=18)	94,4± 5,6	1:200	100	1:320	77,8± 10,1	1:200	100	1:4000	16,7±	100
24-36 (n=6)	100	1:80	100	1:160	33,3± 21,0	1:100	83,3± 16,7	1:2000	-	100
36-60 (n=5)	100	1:64	100	1:256	20,0± 20,0	1:100	100	1:500	-	100
Более 60 (n=7)	42,9± 20,2	1:50	71,4± 18,4	1:128	14,3± 14,3	1:200	100	1:1000	-	85,7± 14,3

*- средняя величина геометрического титра

Выводы

1. Впервые проведен анализ эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по бруцеллезу в РФ за период 1997-2006 годы, который позволил выявить и научно обосновать влияние социально-экономических факторов на эпидемические проявления бруцеллеза на конкретных территориях.

2. Установлен рост числа территорий субъектов РФ с регистрацией бруцеллеза животных и людей с 39(43,8%) в 1991-1996 гг. до 58(65,9%) в анализируемый период. Основное эпизоотолого-эпидемиологическое неблагополучие по бруцеллезу за период 1997-2006 гг. определяли Южный (Республики Дагестан, Калмыкия, Северная Осетия, Карачаево-Черкесская, Кабардино-Балкарская и Ставропольский край) и Сибирский (Р.Тыва) Федеральные Округа, на которые приходится 72,7±0,7% больных людей бруцеллезом (впервые установленным), и большая часть пунктов, неблагополучных по бруцеллезу животных: 96,7±0,9% по бруцеллезу крупного и 98,4±1,6% мелкого рогатого скота.

3. Показано, что причинами непрогнозируемого осложнения эпидемиологической обстановки по бруцеллезу на благополучных территориях в современный период могут быть трансграничные перемещения животных при отсутствии надлежащего ветеринарного и таможенного контроля.

4. Выявлено расширение спектра эпидемически значимых резервуаров и источников бруцеллезной инфекции, вызываемой B.melitensis (козье-овечий тип), за счет интенсификации миграции возбудителя на неспецифических хозяев (крупный рогатый скот).

5. Впервые на территории РФ выявлена циркуляция бруцелл вида canis (два биовара) среди собак. Получены данные, позволяющие предположить о завозе B.canis из-за рубежа с собаками-компаньонами.

6. Современные особенности эпидемического проявления бруцеллезной инфекции состоят в:

- преобладании острых клинических форм бруцеллеза у людей, в том числе детей до 14 лет с выделением гемокультур B.melitensis на территориях Южного и Сибирского ФО, неблагополучных по бруцеллезу КРС и МРС, и первично-хронических форм - на территориях Сибирского, Уральского, Приволжского, Дальневосточного ФО, неблагополучных или условно «благополучных» по бруцеллезу КРС;

- частой регистрации больных с неустановленным источником инфекции - 25 территорий (28,4±0,9%) субъектов РФ. Последнее указывает на то, что больной бруцеллезом человек, по-прежнему, является «индикатором» эпизоотического неблагополучия территории;

- изменении профессиональной структуры заболеваемости в сторону значительного увеличения доли больных, не связанных с общественным животноводством -70,7±0,7% (50,8±1,6% - владельцы животных индивидуального сектора, 19,9±1,2% - не работающие лица, пенсионеры, домохозяйки и др.);

- значительной доле алиментарного пути заражения инфекцией (23,9±1,1%);

- удлинении сроков сезонности заболеваемости до 7-8 мес. в очагах смешанного типа;

- сохранении высокого уровня заболеваемости городских жителей (до 24,9±0,6%), в том числе детей до 14 лет (до 27,1±1,3%);

- росте числа больных с неблагоприятным трудовым прогнозом с 2003 по 2006гг в 1,5 раза, что составило 25,9±0,5% от общего числа больных хроническим бруцеллезом

7. Сравнительный анализ разработанных иммунологических тестов для обнаружения бруцелл и их растворимых антигенов (РИФ, ФИАВР, РПГА, РНАт, РАГА, РК, ИРМА), а также ПЦР выявил различные диагностические возможности их использования в эпидемиологической и клинической практике. Показано, что методом выбора для выявления бруцелл и их растворимых антигенов в объектах внешней среды и биологическом материале являются РИФ, ИФА и ПЦР.

8. Обоснована универсальность использования ИФА для лабораторной диагностики бруцеллеза в эпидемиологической и клинической практике, позволяющего выявлять бруцеллезный антиген и специфические антитела разных классов иммуноглобулинов. Определение уровня специфических IgG, A, M позволяет судить об активности инфекционного процесса, вероятности повторного заражения, характере местных воспалительных изменений со стороны костно-суставной системы, что, в конечном итоге, способствует улучшению диагностики и качества лечения.

9. Установлена высокая диагностическая эффективность ПЦР при бруцеллезной инфекции:

- высокая чувствительность и специфичность ПЦР обеспечивала возможность верификации диагноза на всем протяжении инфекционного процесса (в острой, подострой и хронической стадиях болезни) и выявления активности инфекционного процесса у больных хроническим бруцеллезом при больших сроках давности (до 60 мес и более);

- использование ПЦР в эпидемиологической практике позволило устанавливать инфицирование людей в различных очагах инфекции гораздо чаще, чем традиционные методы серологической диагностики. При этом положительный результат в ПЦР имеет практическое значение только при наличии клинических признаков болезни из-за возможности определения ДНК бруцелл у лиц, имеющих контакт с живыми вакцинными штаммами, которые выделяются привитыми животными во внешнюю среду. Последнее необходимо учитывать при интерпретации положительных результатов данной реакции;

- применение ПЦР для регистрации ДНК бруцелл во внешней среде, искусственно контаминированной возбудителями бруцеллеза (B.abortus 99 и B.suis 1330), показало высокую чувствительность теста даже при минимальном содержании микробных клеток (10 - 10²), что указывает на перспективность использования этого теста в целях контроля пищевых продуктов.

10. Подтверждена длительная персистенция возбудителя бруцеллеза в макроорганизме с помощью современных методов детекции специфических антигенов и антител в эксперименте и клинике. Установлено, что в так называемую «стерильную» фазу инфекционного процесса, когда возбудитель бруцеллеза уже не выделяется (12 мес. от начала заражения вирулентной культурой бруцелл), наступает пик циркуляции специфического антигена и антител продолжительностью до 23 мес. (срок наблюдения), тестируемый ИФА. Специфический антиген и ДНК бруцелл выявлялись также в течение длительного срока (более 5 лет) заболевания у людей.

бруцеллез антиген иммунный инфекция

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Желудков М.М., Павлова И.П., Шаханина К.Л., и др. Определение специфических антител иммуноферментным методом при бруцеллезе у людей./ В.сб. Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций. Иркутск.-1984.- ч.2.- С.102-103.

2. Чернышева М.И.,Желудков М.М., Перекопский И.С. Сравнительная оценка метов определения IgG антител при бруцеллезе у людей.// ЖМЭИ. -1986.- №2.- С.114-116.

3. Чернышева М.И., Желудков М.М., Перекопский И.С. Определение специфических гемолизинов у больных бруцеллезом в непрямой реакции гемолиза. // ЖМЭИ.- 1986.-№4.- С.75-78.

4. Желудков М.М., Павлова И.П. Умнова Н.С.Эффективность иммуноферментного анализа при диагностики бруцеллеза у людей. /В сб.Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций. Тез.докл., всесоюз.н.-практ. конф. Ставрополь.- 1986.-Ч. I.- С. 96-98.

5. Желудков М.М.,Павлова И.П., Умнова Н.С., Перекопский И.С.Иммуноферментный метод в диагностике бруцеллеза у людей.// ЖМЭИ.- 1986.- №8.- С.59-63.

6. Умнова Н.С., Желудков М.М., Павлова И.П., Шаханина К.Л.Выявление антигенов возбудителя бруцеллеза иммуноферментным методом. // ЖМЭИ.- 1986, №9., С.103-107.

7. Желудков М.М., Чернышева М.И. Использование дитиотреитола для выявления специфических IgG антител при бруцеллезе.// Лаб. дело.- 1987.- № 11.- С.870-871.

8. Губина Е.А., Желудков М.М.,Дъяков С.И., Лебедева И.К. Иммунофлуоресцентный экспресс метод определения антибиотикочувствительности бруцелл.// Антибиотики.- 1989.-Т.XXXXIY.- №2.- С.109-112.

9. Zheludkov M.M., Pavlova I.P. Immunoenzymatic assey in diagnosis of Brucellosis. /Zoonoses Congress with Innternational Paticipation Brno,Czechoslovakia.-1988.-8.-11B.-P.11.

10. Токарева Л.Е. Горелов В.Н.,Желудков М.М. Подбор тестов для выявления клонированных в клетках E.coli антигенов B.abortus 99./ В сб. Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным. Тезисы докл.Всесоюз. конференция.- Москва.- 1989.-С.82-84.

11. Чернышева М.И., Желудков М.М.,Власова И.В.Лабораторная диагностика бруцеллеза (Учебное пособие). Москва.-1988.-С.42.

12. Желудков М.М. Перспективы совершенствования лабораторной диагностики бруцеллеза./ В сб. Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным. Тезисы докл. Всесоюз. конференция. Москва.- 1989.- С.91-92.

13. Желудков М.М., Павлова И.П., Умнова Н.С., и др. Использование иммуноферментного анализа для выявления бруцеллезных антител разных классов./ В сб. Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным. Тезисы докл. Всесоюз. конференция. Москва.- 1989.- С.107-108.

14. Пономарева И.В., Шаханина К.Л., Желудков М.М. Использование лантанидного флуоресцентного иммуноанализа для выяления специфических антител при бруцеллезе у людей. / В сб. Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным. Тезисы докл. Всесоюз. конференция. Москва.- 1989.- С.111-112.

15. Желудков М.М., Павлова И.П. Иммуноферментный метод - универсальный метод диагностики бруцеллеза./ В сб.Применение иммуноферментного анализа в медицине (тезисы докл.).-Харьков.-1989.- С.87-88.

16. Польщикова Н.Н., Желудков М.М., Никифоров В.Н., и др. Трудности оценки активности хронического бруцеллеза и выборов методов терапии. // Сов.медицина.- 1989.- №11.- С 109-110.

17. Пономарева И.В. Шаханина К.Л. Желудков М.М. Использование флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением для диагностки бактериальных и вирусных инфекций./ В сб.Новые методы диагностики СПИД, других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы.Тезисы докл.- Алушта.-1990.- С.98-99.