Антибиотики. Фармацевтический анализ. Фармакологическая характеристика. Микробиологическая оценка

В отличие от 6- аминопенициллановой кислоты 7-аминоцефалоспорановая кислота не может быть получена ферментативным путем. Однако она является источником получения полусинтетических цефалоспоринов, например цефалотина:



Получить 7-АДЦК можно химической трансформацией пенициллинов:

Сведения о химической структуре некоторых антибиотиков группы цефалоспоринов приведены в табл. 11.

Табл.15. Химическая структура некоторых радикалов цефалоспоринов.

Химические свойства цефалоспоринов обусловлены наличием в молекулах различных атомов и радикалов, в том числе карбоксильной группы, поэтому они могут образовывать соли, в виде которых некоторые из них применяют в медицинской практике.

По физическим свойствам они представляют собой белые порошки, практически нерастворимые в хлороформе и эфире. Цефалотина натриевая соль легко растворима в воде, мало и медленно растворима в этаноле, цефалексин мало растворим в воде и практически нерастворим в этаноле. Оба они являются оптически активными веществами.

Наличие сопряженных двойных связен в молекулах цефалоспоринов обусловливает характерную полосу поглощения в УФ-спектра с максимумом поглощения в области 260 нм. У цефалексина кроме этого имеется еще один хромофор - фенильный радикал. Для испытания подлинности цефалотина натриевой соли устанавливают наличие в УФ-спектре водного раствора максимума поглощения при 237 нм., а также «плеча» при 265 нм. наличие которого связано с циклической Системой 7-аминоцефалоспорановой кислоты. Методом УФ-спектрофотометрии устанавливают наличие светопоглощающих примесей. Согласно требованиям ФС 0,002%-ный раствор цефалотина натриевой соли при длине волны 237 нм должен иметь оптическую плотность не менее 0,65 и не более 0,72,раствор сравнения вода, а водным 0,05%-ный раствор цефалексина при длине волны 330 нм - не более 0,05.

Объективное заключение о подлинности цефалоспорпновых антибиотиков позволяют сделать ИК-спектры в области 4000-400 см?¹ это испытание предусмотрено ФС. С помощью ИК-спектров можно установить наличие или отсутствие ацетоксигруппы в боковой цепи по C3 дигидротиазинового цикла и подтвердить отнесение испытуемого лекарственного вещества к числу производных 7-АДЦК цефалексин, цефалоридин, цефазолин, цефтриаксон или 7-АЦК цефалотин, цефапирин. цефотаксим, цефуроксим. Для всех цефалоспоринов общими являются полосы в области колебаний карбонильных групп (1800-1500 с?¹) и карбоксильной группы (1620-1600 см?¹). В другой области более высоких частот (3500-2500 см?¹), обусловленной валентными колебаниями амино- и амидогрупп. ИК-спектры имеют существенные различия. Наиболее специфические спектральные кривые цефалоспориновых антибиотиков расположены в области «отпечатков пальцев» (1500-650 см"¹).

Для подтверждения подлинности цефалексина и цефалотина натриевой соли используют также метод ВЭЖХ на приборе с ультрафиолетовым детектором. Идентификацию проводят по временам удерживания основных пиков стандартных образцов лекарственных веществ.

Подлинность цефалоспоринов можно установить реакциями, основанными на окислении смесью 80%-ного раствора серной кислоты и 1%-ного раствора азотной кислоты. Цефалексин приобретает желтое окрашивание, а цефалотина натриевая соль - оливково-зеленое, переходящее в красно-коричневое. Открывают также ион натрия в натриевой соли цефалотина.

Наличие в-лактамного цикла у цефалоспоринов, а у цефалотина еще и сложноэфирной группы обусловливает протекание гидроксамовой реакции. Методика выполнения такая же, как и в случае анализа пеницпллннов. Образуются окрашенные гидроксаматы меди (II) и железа (III).

Цефалексин характеризуется наличием в молекуле остатка алифатической аминокислоты, которую можно обнаружить с помощью нингидрина. Аминокислотный остаток дает возможность идентифицировать цефалексин по реакции комплексообразования с ионом меди (II) в среде уксусной кислоты. После добавления раствора гидроксида натрия в нейтральной среде появляется оливково-зеленое окрашивание.

Допустимое содержание специфических примесей (фенилглицин) устанавливают методом ВЭЖХ в цефалексине и тем же методом сумму этих примесей - в цефалотина натриевой соли. Наличие примеси диметиланилина в цефалексине и в цефалотина натриевой соли устанавливают методом ГЖХ по сумме площадей всех пиков на хроматограмме, кроме пика основного вещества. Этим же методом определяют содержание остаточных растворителей ацетон, этанол, метанол, этилацетат и др.. Цефалоспорины подвергают и другим испытаниям на чистоту, рассмотренным на примере пенициллинов.

Количественное определение цефалексина и цефалотина натриевой соли основано на предварительном щелочном гидролизе до образования производных цефалоспорановой кислоты (соответственно 7-АДЦК и 7-АЦК). Продукты гидролиза затем окисляют титрованным раствором йода.

По ФС количественное определение цефалексина выполняют спектрофотометрическим методом по собственному поглощению при длине волны 262 нм, используя в качестве растворителя и раствора сравнения воду. Расчет выполняют по стандартному образцу, светопоглощение которого измеряют в тех же условиях. Цефалотина натриевую соль по ФС определяют методом ВЭЖХ на приборе «Милихром» с колонкой, заполненной сорбентом «Силасорб C18», и ультрафиолетовым детектором при 254 нм. Расчет содержания выполняют, сравнивая площади основных пиков в испытуемом и стандартном образцах. Альтернативным методом определения активности является метод диффузии в агар с тест-микробом.

Цефалексин проявляет в растворах амфотерные свойства, обусловленные наличием в молекуле карбоксильной и алифатической аминогрупп. Поэтому количественное определение может быть выполнено методом неводного титрования с использованием в качестве растворителей муравьиной и ледяной уксусной кислот в смеси с ацетоном. Это приводит к усилению основных свойств цефалексина, и его оттитровывают диоксановым раствором хлорной кислоты:



Точку эквивалентности устанавливают потенциометрическим методом.

Описана методика фотометрического определения цефалексина и других цефалоспоринов, основанная на образовании окрашенных комплексов с ионом меди (II) и измерении светопоглошения при рН 6,55 в области 640-675 нм. Реактивом служит ацетат меди.

Цефалоспорины хранят по списку Б в сухом, защищенном от света месте, при комнатной температуре.

Цефалоспорины обладают более широким, чем пенициллины, спектром антибактериального действия в отношении грамположительных и грамотрицательных кокковых микроорганизмов, спирохет, сибиреязвенных палочек. Натриевые соли цефалоспоринов применяют внутримышечно, реже внутривенно н внутриплеврально при острых и хронических заболеваниях дыхательных органов, мочевых путей, половых органов, при послеоперационных и других инфекциях. Ряд цефалоспоринов цефалоглицин, цефалексин, в том числе третьего поколения цефиксим, цефтибутен, эффективны при пероральном применении. Цефалексин выпускают в капсулах по 0,25 г. Цефалотина натриевую соль выпускают в виде порошка в герметически укупоренных флаконах по 0,5; 1,0; 2,0 г, содержимое которых растворяют в 10 мл воды для инъекций.

11.3 Фармацевтический анализ группы макролидов и азолидов

Основу химической структуры антибиотиков макролидов и азалидов составляет макроциклическое лактонное кольцо с 12-17 атомами углерода в цикле. Из этой группы антибиотиков в медицинской практике наиболее широко применяют природный антибиотик эритромицин и его полусинтетический аналог азитромицин. Их можно отнести к группе родственных стрептомицину, так как макроциклическое лактонное кольцо в-гликозидной связью соединено с аминосахарами и нейтральными сахарами.

Эритронолиды по химическому строению представляют собой циклическую систему, состоящую из 13 углеродных атомов и включающую лактонные кольца полигидроксилактоны:

От эритронолида А эритронолид В отличается отсутствием гидроксила в положении 12,а эритронолид С только пространственным расположением некоторых функциональных групп.

В качестве аминосахара как азитромицин, так и эритромицины А, В и С содержат дезозамин. Нейтральный сахар в положении 3 у азитромицина, эритромицинов А и В - кладиноза. В молекуле эритромицина С содержится нейтральный сахар - микароза:



Аглюкон азитромицина отличается от эритронолида А тем, что кроме 13 углеродных атомов имеет в положении 10 метиламиногруппу в лактонном кольце.

Эритромицин продуцируют Streptomyces erythreus или другие родственные микроорганизмы.

Erythromycin - эритромицин

Azithromycin - азитромицин.

Эритромицин и азитромицин представляют собой белые или с желтоватым оттенком кристаллические вещества практически нерастворимые воде. Эритромицин легко растворим в этаноле, эфире, хлороформе и в растворе хлороводородной кислоты. Азитромицин трудно растворим в этаноле и легко - в хлороформе.

Для установления подлинности эритромицина и азитромицина снимают ИК-спектры, которые должны быть идентичны соответствующим ИК-спектрам ГСО. Методом ТСХ испытание на подлинность выполняют на хроматографических пластинках Сорбфил, наносят на них соответственно растворы эритромицина, азитромиипна и их ГСО. Полученные основные пятна на пластинке должны быть идентичны у испытуемых антибиотиков и ГСО. Установить наличие эритромицина А в присутствии эритромицинов В и С можно с помощью электрофореза на бумаге.

Эритромицин обнаруживают также цветными реакциями. При растворении в ацетоне и концентрированной хлороводородной кислоте раствор приобретает оранжевое окрашивание, переходящее в красное, а затем в фиолетово-красное. К окрашенному раствору приливают хлороформ и перемешивают. После отстаивания, хлороформный слой приобретает фиолетовый цвет. С концентрированной серной кислотой эритромицин образует красно-коричневое окрашивание, а при нагревании на водяной бане с ксантгидролом - красное.

Методом ГЖХ определяют содержание примесей остаточных растворителей - в эритромицине не должно быть бутилацетата,а в азитромицине допускается примесь ацетона (не более 0,5).

Методом ТСХ по значению Rf b эритромицине устанавливают содержание примеси ангидроэритромицина. В азитромицине этим же методом определяют наличие специфических примесей. Методом ВЭЖХ определяют сумму эритромицинов А, В. С, используя метод внутренней нормализации. Расчет ведут по отношению к содержанию в ГСО эритромицина А (сумма эритромицинов должна быть не менее 93, в т. ч. эритромицинов В и С -- не более 5%).

Биологическую активность эритромицина и азитромицина определяют методом диффузии в агар с тест-микробом Bacillus cereus.

Хранят эритромицин и азитромицин по списку Б. в защищенном от света месте, при комнатной температуре.

Эритромицин и азитромицин - антибиотики широкого спектра действия. Эритромицин и эритромицина фосфат применяют при различных инфекционных заболеваниях дыхательных путей, септических состояниях и гнойно-воспалительных процессах кожи и мягких тканей. Назначают внутрь по 0,25 г 4-6 раз вдень в виде таблеток или в капсулах, а эритромицина фосфат вводят в виде растворов внутривенно по 0,05, 0,1 или 0,2 г. Азитромицин эффективен также при урогенитальных инфекциях. Его назначают один раз в сутки по 0,5-1.0 г в виде таблеток или сиропа. Курсовая доза от 1,5 до 3,0 г.

11.4 Фармацевтический анализ группы тетрациклинов

Природные тетрациклины. К этой группе относятся полиоксиполикарбонильные соединения, основой химической структуры которых является частично гидрированный цикл тетрацена (нафтацена):

В медицине применяют тетрациклин и окситетрациклина дигидрат.

Тетрациклин был получен в 1953 г. путем каталитического гидрирования хлортетрациклина, впервые выделенного из почвы в 1948 г. М. Дуггаром.

Окситетрациклин отличается от тетрациклина наличием гидроксида в положении 5, поэтому их общая формула имеет вид

Для получения природных антибиотиков тетрациклинового ряда используют микроорганизмы Streptomyces aureofaciens и Streptomyces rimosus.

По физическим свойствам природные тетрациклины - кристаллические вещества желтого или светло-желтого цвета, без запаха. Растворы в хлороводородной кислоте вращают плоскость поляризованного света влево, поэтому удельное вращение является одной из физических констант, подтверждающих подлинность.

Tetracycline- тетрациклин.



Oxytetracycline - окситетрациклин.

Тетрациклин и окситетрациклина дигидрат являются основаниями, поэтому тетрациклин очень мало растворим, а окситетрациклин практически нерастворим в воде; оба умеренно растворимы в этаноле. В воде и этаноле тетрациклин растворяется медленно. В хлороформе и эфире они практически нерастворимы или мало растворимы. Тетрациклин и окситетрациклина дигидрат легко растворимы в разведенных кислотах и щелочах, т.к. являются амфотерными соединениями. Обладают основными свойствами, обусловленными наличием в молекуле диметиламиногруппы, и поэтому вступают во взаимодействие с органическими и неорганическими кислотами, образуя непрочные соли. Проявляют кислотные свойства за счет фенольных и енольных гидроксилов и дают соли с гидроксидами щелочных металлов. Образуют нерастворимые внутрикомплексные соединения с полизарядными катионами (кальция, магния, алюминия, железа, меди).

Указанные химические свойства лежат в основе испытаний доброкачественности тетрациклинов.

В качестве общих реактивов на тетрациклины используют соли меди, цинка, образующие окрашенные комплексы «разбавленную хлороводородную кислоту, в присутствии которой растворы тетрациклинов приобретают желтое окрашивание с зеленоватым, тетрациклин оттенком или оранжево-красную окраску окситетрациклин.

Подлинность тетрациклинов устанавливают с помощью цветных реакций. Реактивом, позволяющим отличать антибиотики друг от друга, является концентрированная серная кислота, под действием дегидратирующего воздействия которой образуются окрашенные ангидропроизводные:

В среде концентрированной серной кислоты ангидропроизводные тетрациклина окрашиваются в фиолетовый цвет, тетрациклина - в пурпурно-красный. При последующем добавлении к окрашенному раствору тетрациклина хлорида железа (III) фиолетовая окраска переходит в коричневую или красно-коричневую, окситетрациклина дигидрат по действием хлорида железа (III) в спиртовой среде приобретает коричневую окраску.

Окрашивание продуктов обусловлено наличием фенольных гидроксилов в молекулах.

Способность тетрациклинов окисляться с образованием окрашенных продуктов позволяет использовать для их идентификации такие окислители, как хлорамин Б, селенистая кислота, нингидрин в различных растворителях. Указанные реактивы позволяют идентифицировать тетрациклины и отличать их друг от друга.

Известны также цветные реакции на антибиотики этой группы с нитропруссидом натрия, диметиламинобензальдегидом, реактивом Несслера. Наличие в молекулах фенольных гидроксилов обусловливает образование имеющих красное окрашивание азокрасителей при взаимодействии с различными диазосоединениями, которые присоединяются в положен 9.



Для качественного анализа антибиотиков тетрациклинового ряда используют также их способность образовывать в определенных условиях флуоресцирующие продукты. Так, при действии раствором гидроксида натрия происходит изомеризация с образованием изотетрациклина, имеющего голубую флуоресценцию в УФ-свете после нагревания в кипящей водяной бане.

Тетрациклин и окситетрациклин имеют в молекулах по две системы сопряженных связей и поэтому характеризуются наличием двух полос электронного поглощения. Для аналитических целей представляет интерес длинноволновая полоса, обусловленная присутствием в молекулах карбонильных групп. Удельный показатель поглощения раствора тетрациклина при длине волны 380 нм должен быть равен 380-419,раствор сравнения - 0,1 М хлороводородная кислота. Подлинность окситетрациклина подтверждают по величине оптической плотности 0,002%-ного раствора в хлороводородной кислоте при длине волны 353 нм.

Подлинность тетрациклинов по ФС и МФ подтверждают, используя метод ТСХ. Тетрациклин растворяют в метаноле и хроматографируют относительно стандартных образцов на пластинках с закрепленным слоем силикагеля марки КСК 2,5 или пластинках «Сорбфил» в системе ацетон -- вода (10:1,4). Для окситетрациклина используют систему этилацетат - ацетон - вода (20:19:1). После высушивания пластинку выдерживают в парах аммиака и просматривают в УФ-свете 366 нм. Зоны испытуемых и стандартных образцов должны быть идентичными.

При выполнении испытаний начистоту по ФС в тетрациклине устанавливают спектрофотометрическим методом присутствие светопоглощающих примесей при длине волны 430 нм. Величина оптической плотности должна быть не более 0,5. При аналогичном испытании 0,2%-ного раствора окситетрациклина оптическая плотность при 430 нм должна быть не более 0,25, а при 490 нм - не более 0,2. Методом ТСХ подобно испытанию подлинности обнаруживают присутствие специфических примесей. Указанные примеси ФС рекомендует устанавливать также методом ВЭЖХ. Методом ГЖХ определяют содержание остаточных растворителей (метанола, изооктанола).

Тетрациклин количественно определяют методом неводного титрования 0,1 М раствором хлорной кислоты. Титруют в смеси муравьиной, ледяной уксусной кислоты и диоксана (5:10:10). Эквивалентную точку устанавливают потенциометрически.

Сравнительные исследования показали сопоставимые результаты при количественном определении окситетрациклина на биологическим и дифференциальным спектрофотометрическим методами. В качестве растворителя использован 0,01 М раствор хлороводородной кислоты, аналитическая длина волны 353 нм Разработана также методика дифференциального фотоколориметрического определения тетрациклина гидрохлорида с использованием в качестве реактива хлорамина Б в щелочной среде.

Биологическую активность тетрациклиновых антибиотиков определяют способом диффузии в агар с тест-культурой,Р Bacillus siibtilis (ГФ XI, вып. 2, с. 210). Один мнкрограмм химически чистого лекарственного вещества соответствуе цнфпческой активности, равной одной единице действия. Следовательно, 1,0 г соответствует 1 000 000 ЕД.

Оценку биологической активности природных тетрациклинов можно также осуществить методом обратной тур° метрии с тест-культурой Staphylococcus aureus 209 Р. Степень мутности измеряют на фотоэлектроколориметре со светофильтром №7 582 нм.

Применяют так же способы фотоколориметрического определения, основанные на использовании цветных реакций с раствором хлорида железа (III), с диазосоединениями, хлорамином Б в щелочной среде и другими реактивами. Известны способы флуорометрического определения.

Лекарственные препараты тетрациклинов хранят по списку Б, в сухом, защищенном от света месте, при комнатной температуре. Упаковывают в стеклянные, хорошо укупоренные банки оранжевого стекла с навинчивающимися крышками залитыми парафином, или в другую подходящую тару. При хранении тетрациклина и окситетрациклина наблюдается изменение окраски. На свету они темнеют. Это является следствием образования примеси 4-эпитетрациклина, ангидротетрациклина, 4-эпиангидротетрациклина и продуктов дальнейшего превращения. Указанные вещества отличаются меньшей биологической активностью и более высокой токсичностью, чем исходные лекарственные вещества.

В растворах кислот и щелочей,особенно при нагревании, тетрациклин и окситетрациклин легко разрушаются. Инактивация щелочных растворов обусловлена образованием изотетрациклиновых производных. Например, тетрациклин превращается изотетрациклин.

Идентичные продукты образует окситетрациклин.

Тетрациклин и окситетрациклин -- антибактериальные средства. Их механизм действия основан на подавлении биосинтеза белка микробной клетки. Применяют при пневмонии, бактериальной и амебной дизентерии, коклюше, гонорее, бруцеллезе, туляремии, сыпном и возвратном тифе и других инфекционных заболеваниях внутрь в виде таблеток, капсул, суспензии по 0,1-0,2-0,3 г 3-5 раз вдень. Наружно назначают 1-3%-ные мази для лечения глазных заболеваний, ожогов, флегмон.

Полусинтетичесгсие тетрациклины.

Одним из недостатков природных тетрациклинов является сравнительно высокая токсичность. В результате исследований, проведенных в нашей стране и за рубежом, созданы полусинтетические аналоги природных тетрациклинов: доксициклин (вибрамицин), метациклин (рондомицин) и др.

Общая формула полусинтетических тетрациклинов:

Производные 6-дезокситетрациклина получают из окситетрациклина, изменяя структуру молекулы в положении 6. Дезоксилирование приводит к образованию доксициклина (6-дезокси-5-окситетрациклина), а последующее превращение метильной группы в метиленовую дает возможность получить метациклин (6-дезокси-6-деметил-6-метилен-5-окситетрациклин):



Способы испытаний на подлинность, чистоту и количественная оценка синтетических и природных тетрациклинов во многом сходны.

Doxycycline Hydrochloride - доксициклина гидрохлорид.

Methacycline Hydrochloride - метациклина гидрохлорид.

Доксициклина гидрохлорид легко, но медленно растворим в воде 1:3, легко растворим в метаноле 1:4 и мало -в этаноле. Метациклина гидрохлорид трудно и медленно в течение 40 мин растворим вводе 1:80 и в метаноле 1:40. В эфире и хлороформе оба практически нерастворимы.

Подлинность лекарственных веществ устанавливают по ИК-спектрам, сравнивая их со спектрами стандартных образцов. Методом УФ-спектрофотометрии подлинность подтверждают по удельному показателю поглощения, который у доксициклина гидрохлорида 280-310 устанавливают при длине волны 349 нм, растворитель - смесь 1 М раствора хлороводородной кислоты и метанола 1:99, а у метациклина гидрохлорида при 345 нм. УФ-спектр раствора метациклина гидрохлорида в области 220-400 нм в том же растворителе имеет максимумы поглощения при 253 и 345 нм и минимумы при 223 и 299 нм. При длине волны 345 нм со стандартным раствором устанавливают относительную оптическую плотность метациклина, которая должна быть равна от 96 до 104%.

Доксициклин и метациклин дают цветные реакции с серной кислотой желтое окрашивание и хлоридом железа (Ш), темное красно-коричневое окрашивание. Они дают также положительную реакцию на хлориды. Для установления подлинности и испытаний на наличие специфических примесей применяют метол ТСХ. аналогично испытаниям природных тетрациклинов.

Испытывают на наличие светопоглощающих примесей, измеряя оптическую плотность 1%-ных растворов полусинтетических тетрациклинов в смеси хлороводородной кислоты и метанола 1:99. Она должна быть не более 0,1. Методом ГЖХ в доксициклина гидрохлорида устанавливают наличие примеси этанола, методом К. Фишера - воды. В метациклине гидрохлориде меркуриметрическим методом количественно определяют содержание хлоридов не менее 7,0% и не более 7,8%; в качестве индикатора используют раствор дифенилкарбазона.

Биологическую активность препаратов определяют методом диффузии в агар с тест-культурой Bacillus subtilis.

Хранят лекарственные препараты полусинтетических тетрациклинов по списку Б, в сухом, защищенном от света месте, при комнатной температуре. Даже в темноте, особенно во влажной атмосфере и при повышении температуры, они постепенно разлагаются. Выпускают в капсулах- доксициклина гидрохлорида 0,05, 0,1 и 0,2 г, метациклина гидрохлорида по 0,15 и 0,3 г. Показания для применения у полусинтетических тетрациклинов те же, что и у природных, но вследствие лучшей растворимости они быстрее всасываются, дольше сохраняются до 24 ч в крови, а также отличаются меньшей токсичностью.

11.5 Фармацевтический анализ антибиотиков производных нитрофенилалкиламинов

Из большого числа антибиотиков, являющихся ароматическими соединениями, в медицинской практике применяют хлорамфеникол, или левомицетин, обнаруженный впервые в 1947 г. в культуральной жидкости актиномицета Streptomyces venezuelae. В 1949 г установлена его химическая структура и осуществлен синтез. Хлорамфеникол был первым антибиотиком, химический синтез которого внедрен в промышленном масштабе, в то время как большинство других антибиотиков получают биосинтезом. Этому в значительной степени способствовала сравнительно простая химическая структура хлорамфеникола он относится к числу производных n-нитробензола:

По химическому строению хлорамфеникол представляет собой n-нитрофенил-2-дихлорацетиламинопропандиол-1,3:

Молекула этого соединения включает два асимметрических атома углерода, поэтому возможно существование четырех пространственных изомеров: D-mpeo, L-mpeo, D-эритро, L-эритро. Трео- и эритро- изомеры отличаются пространственным расположением функциональных групп в молекуле:

Этот вид изомерии наблюдается также у эфедрина. Хлорамфеникол является трео-изомером, т.е. соответствует в отношении изомерии псевдоэфедрину.

По характеру конфигурации асимметрического атома углерода в положении 1 оптически активные соединения относят к D- и L-ряду. D-ряд составляют соединения, имеющие конфигурацию, подобную d-глицериновому альдегиду, а L-ряд - соответственно l-глицериновому альдегиду.

Оптическая активность зависит от конфигурации всех асимметрических атомов углерода, поэтому как в D-ряду так и в L-ряду могут быть и левовращающие и правовращающие изомеры. Знак вращения плоскости поляризованного света (+) или (-) указывается в скобках после обозначения конфигурации.

Необходимо отметить, что удельное вращение раствора хлорамфеникола в этилацетате равно -25,5°. Однако его растворы в этаноле вращают плоскость поляризованного света вправо. Это свойство ФС рекомендует для подтверждения его подлинности.

Получают хлорамфеникол синтетическим путем, выделяя на определенных этапах синтеза необходимые изомеры. Из многочисленных исходных продуктов синтеза наиболее экономичен и доступен n-нитроацетофенон.

Вначале синтезируют так называемое основание хлорамфеникола (D, L-трео-1-n-нитрофенил-2-аминопропандиол-1,3).

Полученное «основание» разделяют на оптические антиподы последовательной кристаллизацией из водного раствора или с применением D-винной кислоты. Затем на D-(-)-трео-изомер действуют метиловым эфиром дихлоруксусной кислоты и получают хлорамфеникол:



В медицинской практике применяют хлорамфеникол, хлорамфеникола стеарат, хлорамфеникола сукцинат натрия растворимый. Они представляют собой белые или с желтоватым оттенком кристаллические вещества без запаха. Различить их можно по удельному вращению растворов. Хлорамфеникола стеарат отличается от хлорамфеникола отсутствием горького вкуса. Он практически нерастворим в воде.

Хлорамфеникол - Chloramphenicol.

Хлорамфеникола стеарат - Chloramphenicol Stearate.

Хлорамфеникола натрия сукцинат - Chloramphenicol Sodium Succinate.

Хлорамфеникол мало растворим в воде, эфире, хлороформе, растворим в этилацетате. В отличие от хлорамфеникола и его эфира стеарата, хлорамфеникола натрия сукцинат очень легко растворим в воде. В этаноле хлорамфеникол легко растворим, стеарат трудно растворим, натрия сукцинат - растворим. Хлорамфеникола натрия сукцинат практически нерастворим в эфире и хлороформе, хлорамфеникола стеарат легко растворим в хлороформе. Во всех указанных растворителях хлорамфеникола стеарат образует мутные растворы. Хлорамфеникола натрия сукцинат, являясь натриевой солью, Дает положительную реакцию на ион натрия.

Подлинность хлорамфеникола подтверждают по УФ-спектру 0,002%-ного водного раствора, который в области 220-400нм имеет максимум поглощения при 278 нм и минимум при 237 нм. ФС рекомендует устанавливать величину удельного показателя поглощения при длине волны 278 нм Водный 0,04%-ный раствор хлорамфеникола натрия сукцината в области 230-350 нм имеет один максимум поглощения при длине волны 276 нм. Для идентификации хлорамфеникола и хлорамфеникола натрия сукцината использованы вторые производные УФ-спектров поглощения, а также значения отношений оптических плотностей в максимумах и минимумах поглощения растворители вода, этанол.

Реакция гидролиза в щелочной среде лежит в основе испытания подлинности хлорамфеникола и его производных. При нагревании в течение 1-2 мин с 15%-ным раствором гидроксида натрия хлорамфеникол и хлорамфеникола стеарат приобретают желтое окрашивание, переходящее в красно-оранжевое. В отличие от хлорамфеникола стеарата хлорамфеникол при дальнейшем нагревании в щелочной среде образует кирпично-красный осадок аци-формы n-нитрофенилпропандиола-1,3. Одновременно ощущается запах аммиака. Фильтрат после подкисления азотной кислотой дает характерную реакцию на хлориды. Это позволяет подтвердить наличие в молекуле хлорамфеникола нитрофенильного радикала, аминогруппы и ковалентно связанного атома хлора, поскольку при щелочном гидролизе образуется «основание» хлорамфеникола, переходящее в аци-форму, выделяются аммиак и натриевая соль глиоксиловой кислоты:

Хлорамфеникол, за счет наличия в молекуле спиртового гидроксила и вторичной алифатической аминогруппы может образовывать окрашенные комплексные соединения с солями тяжелых металлов. С раствором сульфата меди образуется синий осадок, который растворяется в н-бутаноле, окрашивая его слой в фиолетовый цвет.

Хлорамфеникола натрия сукцинат идентифицируют также по остатку янтарной кислоты, в частности при нагревании с резорцином и концентрированной серной кислотой. Образуется желтый раствор, имеющий в УФ-свете желтовато-зеленую флуоресценцию. Если вместо резорцина взять гидрохинон, после охлаждения разбавить водой и смешать с бензолом, то его слой приобретает красную окраску.

Хлорамфеникола стеарат, являясь сложным эфиром, гидролизуется в присутствии концентрированной хлороводородной кислоты при нагревании с образованием стеариновой кислоты, которая всплывает на поверхности в виде масляных капель, затвердевающих при охлаждении:



Известны многочисленные способы идентификации и количественного определения, основанные на предварительном гидрировании цинковой пылью в кислой среде нитрогруппы в молекуле хлорамфеникола до аминогруппы. Одновременно отщепляются атомы хлора:

Образовавщийся 1-n-аминофенил-2-ацетиламинопропандиол-1,3 диазотируют и превращают в азокраситель, сочетая с в-нафтолом, б-нафтиламином или другим амином или фенолом. Например, в результате азосочетания с в-нафтолом образуется азокраситель красного цвета.



Для идентификации лекарственных веществ, содержащих в молекуле нитрогруппу, используют также испытание, основанное на последовательном гидрировании цинком в хлороводородной кислоте до ароматического амина с последующей его конденсацией с n-диметиламинобензальдегидом до образования окрашенной соли основания Шиффа. Хлорамфеникол в этих условиях приобретает ярко-оранжевое окрашивание.

Наличие исходных и промежуточных продуктов синтеза в хлорамфениколе устанавливают методом ТСХ на пластинках Силуфол УФ-254 в системе хлороформ-метанол-вода (90:10:1). На хроматограмме допускается наличие на более трех посторонних пятен, каждое из которых не должно превышать пятно свидетеля по величине и интенсивности не более 0,5% каждой примеси.

В хлорамфеникола натрия сукцинате определяют содержание примеси свободного хлорамфеникола не более 5% методом диффузии в агар, устанавливая антимикробную активность. В хлорамфеникола стеарате количественно определяют примесь свободной стеариновой кислоты не более 3% методом нейтрализации по фенолфталеину.

Количественное определение хлорамфеникола по ФС выполняют нитритометрическим методом после предварительного гидрирования в кислой среде цинковой пылью:



Содержание хлорамфеникола определяют и обратным бромид-броматометрическим методом. Однако этому, как и вслучае нитритометрии, должна предшествовать стадия гидрирования нитрогруппы в аминогруппу с помошью цинковом пыли и хлороводородной кислоты при нагревании на кипящей водяной бане. Остаток цинка удаляют фильтрованием и к фильтрату добавляют избыток 0,1 М раствора броматакалия в присутствии бромидов. Количество непрореагировавшего титранта устанавливают с помощью йодида калия. Выделившийся йод оттитровывают 0,1 М раствором тиосульфата натрия.

Количественное определение хлорамфеникола стеарата выполняют спектрофотометрическим методом в спиртовых растворах при длине волны 272 нм: он должен содержать 51-55% хлорамфеникола. Хлорамфеникола натрия сукцинат также определяют спектрофотометрическим методом, измеряя оптическую плотность 0,002%-ного водного раствора при длине волны 276 нм. Расчет количественного содержания выполняют относительно 0,002%-ного стандартного раствора, приготовленного из отвечающего требованиям ФС хлорамфеникола, оптическую плотность которого измеряют при той же длине волны. Содержание в нем хлорамфеникола должно быть 65,0-76,5%.

Реакция образования комплексного соединения хлорамфеникола с ионом меди (II) использована для прямого титрования хлорамфеникола 0,01 М раствором сульфата меди индикатор мурексид. Известны также аргентометрическое и меркуриметрическое определение хлорамфеникола по хлорид-иону, образующемуся после его окисления пероксидом водорода в щелочной среде. В результате этой реакции образуются две молекулы хлорида натрия. Хлорид-ион можно получить и при озолении хлорамфеникола в присутствии карбонатов натрия и калия.

Хлорамфеникол и его сложные эфиры хранят по списку Б, в хорошо укупоренной таре хлорамфеникол в склянках оранжевого стекла, а хлорамфеникола натрия сукцинат в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре.

Хлорамфеникол - антибиотик широкого спектра действия. Его применяют для лечения брюшного тифа, паратифов, дизентерии, бруцеллеза, коклюша, пневмонии, различных инфекционных заболеваний. Он легко всасывается из желудочно-кишечного тракта, сохраняя при этом свою активность. Это позволяет использовать хлорамфеникол для назначения внутрь обычно в дозах 0,5 г 3-4 раза в сутки. В детской практике применяют менее горький хлорамфеникола стеарат, который в желудочно-кишечном тракте постепенно гидролизуется с образованием хлорамфеникола. Показания для применения хлорамфеникола стеарата те же, но, поскольку он всасывается медленнее и содержит 51-55% хлорамфеникола, то дозы соответственно увеличивают в 2 раза. Хлорамфеникола натрия сукцинат применяют аналогично, но внутривенно, внутримышечно и подкожно 2-3 раза в сутки по 0,5-1,0 г в виде растворов для инъекций.

11.6 Фармацевтический анализ группы стрептомицины

Стрептомицин - один из основных представителей антибиотиков-гликозидов. Большинство из них являются гликозидами с агликонами производными аминоциклонолов и сахарными компонентами - аминосахарами.

Стрептомицин впервые описан в 1944 г. американским ученым 3. Ваксманом, который, однако, отметил, что значительную роль в этом открытии сыграли исследования Н.А. Красильникова и других ученых в области изучения антагонизма актиномицетов и бактерий.

По химической структуре стрептомицин может быть рассмотрен как гликозид - N-метил-б-L-глюкозамидо-в-L-стрептозидо-стрептидин.

Стрептомицина сульфат - Streptomycin Sulfate.

Агликон стрептомицина - стрептидин представляет собой 1,3-дигуанидино-2,4,5,6-тетраоксициклогексан или спирт - инозит, в котором две оксигруппы замещены остатками гуанидина:

Сахарная часть стрептомицина представляет дисахарид стрептобиозамин, построенный из связанных между собой остатков N-метил-L-глюкозамина и L-стрептозы:

Промышленными продуцентами стрептомицина служат штаммы актиномицетов Actinomyces streptomycini, Streptomyces griseus и др. Процессы ферментации осуществляют из наиболее активных штаммов, благоприятных сред и других условий обеспечивающих максимальный выход антибиотика. Затем из культуральной жидкости сорбируют стрептомицин, многократно пропуская через катиониты и оксид алюминия.

Стрептомицин проявляет основные свойства ввиду наличия в молекуле азотсодержащих двух гуанидиновых и одной N - метильной групп. Поэтому он легко образует соли сульфат, гидрохлорид и комплексы с ионами некоторых двухзарядных металлов. Применяют в медицине стрептомицина сульфат. Это вещество белого цвета, легко растворимое в воде, практически нерастворимое в органических растворителях этаноле, метаноле, эфире, хлороформе.

В слабокислой среде растворы стрептомицина устойчивы. Подобно другим гликозидам, он легко гидролизуется под действием сильных кислот с образованием стрептидина и стрептобиозамина. Стрептобиозамин затем распадается на N - метил - L - глюкозамин и L-стрептозу. Еще быстрее инактивируется стрептомицин в щелочной среде на 50% в течение 3 ч под действием 0,1 М раствора гидроксида натрия. Однако при этом потеря активности обусловлена дегидратацией и изомеризацией L-стрептозы, которая превращается в мальтол (б-метил-в-окси-г-пирон):

Мальтол образуется значительно быстрее в течение 4 мин, если стрептомицин нагревать с 0,5 М раствором гидроксида натрия на кипящей водяной бане. При взаимодействии с ионами железа (III) в кислой среде мальтол превращается в соединение, имеющее фиолетовую окраску. Эту цветную реакцию используют для испытания подлинности стрептомицина. Она может быть применена и для его фотометрического определения. Мальтольная проба обусловлена наличием альдегидной группы в молекуле стрептомицина.

Альдегидная группа, проявляя восстановительные свойства, обусловливает положительные реакции стрептомицина с реактивом Несслера бурое окрашивание вследствие восстановления металлической ртути и с реактивом Фелинга, который образует красный осадок восстановленного оксида меди. При конденсации альдегидной группы с фенолами резорцином после нагревания стрептомицина в присутствии концентрированной серной кислоты на кипящей водяной бане появляется вишнево-красное окрашивание.

Остатки гуанидина в молекуле стрептомицина можно открыть по образованию фиолетово-красного окрашивания, которое возникает в щелочной среде под действием б-нафтола и гипобромида натрия. Происходит процесс окисления и бромирования б-нафтола с образованием имеющего хиноидный цикл нафтохинонимина:

Гуанидиновую часть молекулы можно идентифицировать в щелочной среде с помощью раствора нитропруссида натрия, подвергнутого воздействию ультрафиолетовых лучей, или смеси растворов нитропруссида натрия и гексацианофер-рата (III) калия. Появляется оранжево-вишневое окрашивание.

Гуанидин можно также обнаружить по выделению аммиака при нагревании со щелочью. При нагревании стрептомицина с диацетилом и оксидом кальция возникает оранжево-красное окрашивание.

Стрептомицина сульфат можно идентифицировать также по наличию сульфат-иона и по образованию пикрата стрептидина т. пл. 283-284. Вначале к раствору стрептомицина в метаноле добавляют концентрированной серной кислоты.

Получают кристаллический сульфат стрептидина. который затем, действуя раствором пикриновой кислоты в горячей воде превращают в пикрат.

ФС рекомендует для подтверждения подлинности стрептомицина сульфата использовать метод ТСХ. На пластинке со слоем силикагеля Н испытуемое вещество сравнивают с ГСО стрептомицина сульфата, неомицина сульфата и канамицина сульфата. В качестве проявителя используют нафталин-1,3-диол. Этим же методом определяют содержание примеси стрептомицина В менее 3%.

Для установления подлинности стрептомицина сульфата, применяемого в качестве стандарта при биологическом контроле, используют ПМР-спектроскопию. Спектр ПМР должен соответствовать рисунку спектра, предлагаемому к ФС. Регистрируют спектр ПМР на ЯМР-спектрометре, устанавливая характерные сигналы при 1,26; 2,89; 3,31; 5,32; 5,57 и 5,07 м. д.

Методом ГЖХ устанавливают отсутствие примеси формальдегида.

Количественно стрептомицина сульфат определяют фотоколориметрическим методом, используя реакцию образования мальтола не менее 90%. Светопоглощение измеряют в максимуме при 525 нм относительно смеси реактивов. Эта же химическая реакция лежит в основе цериметрического определения стрептомицина сульфата. Навеску растворяют в воде, добавляют 1 М раствора гидроксида натрия и кипятят на водяной бане 5 мин. После охлаждения и подкисления 1 M раствором серной кислоты добавляют 2%-ный раствор хлорида железа (III) и титруют 0,01 М раствором сульфата церия до исчезновения характерной красноватой окраски.

Биологическую активность стрептомицина сульфата устанавливают методом диффузии в агар с тест-микробом. Он должен содержать не менее 730 мкг/мл ЕД/мл в пересчете на сухое вещество 1 мкг химически чистого стрептомицина соответствует активности, равной 1 ЕД. Проводят также испытания на пирогенность, стерильность, токсичность, прозрачность, цветность и др.

Трилонометрическим методом определяют содержание сульфатов 18-21,5% по связанному объему 0,1 М раствора бария хлорида индикатор металлофталеин.

Стрептомицина сульфат хранят по списку Б, в сухом помещении учитывая гигроскопичность, при температуре не выше 25°С. Упаковывают во флаконы, герметически закрытые резиновыми пробками, обжатыми алюминиевыми колпачками. В одном флаконе по 0,25, 0,5 и 1,0 г активного вещества в пересчете на стрептомицин основание, что соответствует 250 000, 500 000 и 1 000 000 ЕД.

Назначают главным образом для лечения различных форм туберкулеза, а также при заболеваниях, вызванных чувствительными к стрептомицинам бактериями пневмонии, перитоните, гонорее, бруцеллезе и т. д.. Вводят внутримышечно по 0,5-1,0 г в сутки.

11.7 Фармацевтический анализ группы аминогликозидов

Группа антибиотиков - канамицинов, продуцируемых лучистым грибом Streptomyces kanamiceticus, включает канамицин А, канамицин В и канамицин С. Наименьшую токсичность проявляет канамицин А, поэтому он составляет основную массу 94% канамицина сульфата. В структуру канамицина А входит аглюкон 2-дезоксистрептамин мезо-1,3-диамино-4,5,6-триоксициклогексан и два остатка сахаров: 6-амино-6-дезокси-D-глюкоза (I) и 3-амино-3-дезокси-D-глюкоза (II).

Полусинтетическим аналогом, получаемым из канамицина А, является сходный с ним по химической структуре амикацин, который в виде сульфата применяется в медицинской практике. Основное его структурное отличие от канамицина заключается в наличии 4-амино-L-2-оксибутирильного радикала. Кроме того, вместо аглюкона 2-дезокси-D-стрептамина у амикацина в молекуле 2-дезокси-L-стрептамин:

С канамицином сходен антибиотик гентамицин - продукт жизнедеятельности Micromonospora purpurеа. Он включает смесь трех антибиотиков - гентамицинов С1, C2 и C1а:

В медицинской практике применяют смесь сульфатов гентамициновС1, С2, С1а под названием гентамицина сульфат.

По физическим свойствам антибиотики-гликозиды представляют собой порошки белого с желтоватым или кремоватым оттенком цвета, без запаха, гигроскопичные. Характерная их физическая константа - удельное вращение растворов.

Антибиотики - аминогликозиды легко или очень легко растворимы в воде, практически нерастворимы в этаноле, эфире, хлороформе.

Для испытания подлинности канамицина сульфата используют цветную реакцию со спиртовым раствором орцина и концентрированной хлороводородной кислотой в присутствии хлорида железа (III). При нагревании реакционной смеси в кипящей водяной бане образуется окрашенное в зеленый цвет вещество. Аналогичные результаты получаются, если вместо орцина использовать в качестве реактива 20%-ный спиртовой раствора б-нафтола. Эти реакции обусловлены образованием фурфурола из сахаров. Амикацина сульфат можно обнаружить с помощью цветных реакций, в частности с антроном, по голубовато-фиолетовому окрашиванию. Если к водному раствору амикацина сульфата добавить раствор гидроксида натрия, а затем нитрата кобальта, то появляется фиолетовое окрашивание.

Присутствие аминосахаров в молекулах антибиотиков - аминогликозидов устанавливают цветной реакцией с 0,2%-ным раствором нингидрина в смеси бутанола и пиридина. При нагревании в течение 5 мин на водяной бане появляется фиолетовое окрашивание. После гидролиза в кислой среде канамицина сульфата дает положительные реакции на углеводы с аммиачным раствором нитрата серебра, реактивами Несслера и Фелинга.

Поскольку канамицина и гентамицина сульфаты являются смесями нескольких веществ, для испытания их подлинности используют метод ТСХ с закрепленным слоем сорбента. Хроматограмму канамицина проявляют нингидрином, а гентамицина - парами йода и сравнивают с хроматограммами стандартных образцов. Метод ТСХ на закрепленном слое силикагеля КСК N°2 используют для установления подлинности амикацина сульфата проявитель раствор нингидрина, а также для обнаружения в нем примеси канамицина.

ПМР-спектроскопию применяют для идентификации антибиотиков -аминогликозидов: неомицина В, мономицина А, канамицина А, тобрамицина, гентамицина и сизомицина. Наличие в слабых полях ПМР-спектров дублетных сигналов аномерных протонов углеводных фрагментов и сигналов, характерных для циклитолов, является общим для всей этой группы. Каждый из указанных антибиотиков имеет характерные сигналы поглощения, соответствующие определенным структурным фрагментам молекул. Однозначная связь спектральных параметров ПМР с химической и структурной природой молекул позволяет устанавливать подлинность каждого из антибиотиков в отсутствии образцов - свидетелей. Спектроскопию ЯМР ¹³С используют для идентификации стрептомицина, неомицина, мономицина, тобрамицина, канамицина А и его полусинтетического аналога - амикацина.

Компонентный состав гентамицина сульфата определяют методом ВЭЖХ по площадям пиков каждого компонента. Содержание гентамицина С1 должно быть 25-50%, С1а - от 10 до 35%, суммы С1 и С 1а - от 25 до 55%.

При испытании на чистоту в 33%-ных растворах антибиотиков в серной кислоте определяют на спектрофотометре светопоглощающие примеси при длине волны 400 нм оптическая плотность не должна превышать 0,3. Методом ГЖХ определяют содержание остаточных растворителей в амикацина сульфате этилового и пропилового спирта. Проводят также иные испытания, подтверждающие степень чистоты антибиотиков.

Биологическую активност устанавливают методом диффузии в агар с тест-микробами; 1/ мкг каждого химически чистого антибиотика соответствует специфической активности, равной 1 ЕД. В канамицина сульфате определяют также содержание канамицина В не более 5% - биологическим методом и не более 4% - методом ВЭЖХ.

Поскольку лекарственные препараты антибиотиков - гликозидов содержат связанную серную кислоту, они дают положительную реакцию на сульфат-ион. После осаждения хлоридом бария количественно определяют содержание сульфатов гравиметрическим или обратным трилонометрическим методом индикатор металлфталеин. Для канамицина сульфата ФС рекомендует оба указанных метода.

Для количественного определения гентамицина сульфата применяют также нингидриновый и поляриметрический методы. Сопоставимые результаты с поляриметрическим анализом дает фотоколориметрический метод, основанный на образовании окрашенного комплекса гентамицина с солями меди в щелочной среде. Для фотометрического определения гентамицина используют цветную реакцию с салициловым альдегидом при рН 7,0. Образующееся при нагревании окрашенное салицилиденовое производное поглощает в области 405 нм.

Для количественной оценки антибиотиков - аминогликозидов используют и другие физико - химические методы, в частности спектрофотометрию, основанную на измерении поглощения продуктов превращения этих антибиотиков в дигидролутидиновые и другие производные. Разработана унифицированная методика спектрофотометрического количественного определения антибиотиков - аминогликозидов, основанная на образовании продуктов взаимодействия с азокрасителем кислотным хром сине-черным R кальконом. Методика селективна и сопоставима с результатами микробиологического определения А. В. Кукурека. Особенно широко для количественного экстракционно-фотометрического определения канамицина и гентамицина в лекарственных формах и биологических жидкостях применяют такие красители, как бромтимоловый синий, кислотный черный.

Лекарственные препараты антибиотиков - аминогликозидов хранят по списку Б, в сухом, защищенном от света месте, в плотно укупоренной таре, при комнатной температуре.

Антибиотики - аминогликозиды обладают более широким спектром антибактериального действия, чем лекарственные препараты пенициллинов, тетрациклинов, левомицетинов. Назначают их внутрь и парентерально для лечения инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта. Канамицина сульфат оказывает также бактерицидное действие в отношении микобактерий туберкулеза. Его назначают по 0,5-1,0 г для инъекций. Гентамицина сульфат назначают внутримышечно виде 4%-ного водного раствора при лечении инфекционных заболеваний, кожи, костей, суставов, легких, мочевых путей. Одним из наиболее активных в этой группе является амикацина сульфат. Его назначают внутримышечно или внутривенно при сепсисе и других тяжелых инфекциях мочевых и дыхательных путей. Выпускают в виде ампулированных растворов по 2 мл, содержащих 0,1 или 0,5 г амикацина сульфата.

Размещено на Allbest.ru