U5

1 (1%)

0

0

мяРНК, сплайсинг

Ядрышко, ядро

U3

8 (10%)

2 (2%)

1 (1%)

мяРНК, процессинг рРНК

Ядрышко

5S рРНК

3 (4%)

3 (3%)

4 (6%)

Рибосомная РНК

Ядрышко, цитоплазма

7 SL

1 (1%)

0

0

SRP, сортинг белков

Ядрышко, цитоплазма

Alu

2 (2%)

0

0

Эгоистичная РНК

Ядрышко, ядро, цитоплазма

3' terminal parts

L1

65 (80%)

103 (88%)

54 (82%)

Эгоистичная мРНК

Цитоплазма, ядро

мРНК

9 (11%)

9 (8%)

5 (8%)

мРНК генов

Цитоплазма

Alu

7 (9%)

0

0

Эгоистичная РНК

Цитоплазма, ядро, ядрышко

B1_Mm

0

2 (2%)

0

Эгоистичная РНК

Цитоплазма, ядро

B2_Mm1

0

1 (1%)

0

Эгоистичная РНК

Цитоплазма, ядро

B2_Mm2

0

1 (1%)

1 (1%)

Эгоистичная РНК

Цитоплазма, ядро

ID_Rn

0

0

5 (8%)

Эгоистичная РНК

Цитоплазма, ядро

4,5S РНК

0

0

1 (1%)

Рибосомная РНК

Цитоплазма, ядро

aНазвания клеточных транскриптов, соответствующих данной части химеры. Компоненты химер из генома гриба M. grisea не указаны, поскольку функция и локализация РНК WEIRD остаются неизвестными.

bКоличество и доля последовательностей данного типа среди химер.

cФункция соответствующих РНК в клетке.

Для химер характерны следующие общие свойства: (1) их 5'-концевые части являются полноразмерными копиями клеточных РНК; (2) 3'-части химер - это 5'-укороченные копии соответствующих РНК (в основном LINE); (3) обе части объединены в одной и той же ориентации относительно направления транскрипции; (4) химеры несут поли (A) хвост или А-богатый микросателлит на 3' конце, (5) химеры фланкированы короткими прямыми повторами геномной ДНК пре-интеграционного сайта.

Последняя особенность подчёркивает, что эти элементы внедрялись в геном уже в виде двухчастных ДНК-копий. Все химеры млекопитающих несли выше 5' конца гексануклеотид T2A4 или его варианты (253, 282, 283), что соответствует уже упомянутой выше последовательности T2A4 , узнаваемой LINE-элементами для инициации обратной транскрипции (278). Одновременность интеграций обеих частей химер была затем подтверждена в ходе экспериментов, основанных на исследовании эволюционного инсерционного полиморфизма (ПЦР тест-система, аналогичная приведённой на Рис. 1.4.7) (253, 283).



Рисунок 1.4.8. Схема двухчастных химерных ретроэлементов, найденных в геномах эукариот. Вставки в геномах млекопитающих расположены ниже мотива TTAAAA. Вставки в геномах млекопитающих и гриба содержат поли (А) последовательность или А-богатый микросателлит и фланкированы прямыми повторами геномной ДНК длиной 10-25 пар нуклеотидов.

Количество химер в геномах мыши и крысы, по-видимому, недооценено, поскольку их 3'-концевые части иногда прерваны брешами в сборке геномных ДНК и отсутствуют в опубликованной геномной последовательности (23 и 33 случая, соответственно). Важно отметить, что создающий химеры механизм часто объединяет функциональные копии клеточных транскриптов, часто не имеющих ничего общего с мобильными элементами. Многие химеры можно рассматривать как новые гены, поскольку они транскрибируются, причём некоторые из них - тканеспецифически (253, 282, 284, 285).

По-видимому, все химерные ретроэлементы были созданы по механизму, аналогичному приведённому ранее на Рис.1.4.6. Хотя основной энзиматической активностью Обратной транскриптазы (ОТ) является синтез кДНК на неизменной матрице РНК, ОТ также способна к смене матриц в ходе обратной транскрипции. Например, известно, что «прыжки» ОТ ретровирусов с одного сайта матричной РНК на другой необходимы для образования LTR. Кроме того, поскольку ретровирусные частицы обычно содержат две молекулы матричной РНК (286), то высокая частота актов смены матрицы значительно увеличивает изменчивость ретровирусов путём рекомбинации между этими РНК (287). Именно эта рекомбинация, скорее всего, отвечает за мозаичные структуры большинства ретровирусов (288, 289).

Помимо образования химерных ретрогенов, смена матриц при обратной транскрипции LINE могла сформировать некоторые химерные SINE-элементы (290), а также мозаичные структуры L1 элементов грызунов, скорее всего, образовавшиеся при РНК рекомбинации между разными мРНК L1 (291). Эволюция некоторых семейств LINE могла включать РНК-РНК рекомбинацию, приводившую к объединению 3'-концевой части LINE с новой последовательностью на 5'-конце. Это подтверждается тем, что 5'-нетранслируемые участки семейств L1 человека, мыши и крысы, негомологичны друг другу (292). Интересно, что для ОТ, кодируемой другим членом суперсемейства LINE - R2 из геномов членистоногих, in vitro были описаны «прыжки» с одной матрицы на другую, при этом образовывались химеры R2-R2 (293).

Эта модель образования химер была позднее поддержана экспериментальными данными по ретротранспозиции L1 LINE элементов человека in vitro (294). Авторы охарактеризовали 100 событий ретротранспозиции de novo в клетках HeLa. Важно, что одна вставка (1%) представляла собой только что образованную химеру, состоящую из полноразмерной U6 мяРНК, объединённой с 5'-укороченным L1. Похожие результаты получили и in vivo на модели ретротранспозиции L1 в трансгенных мышах. 13% из 33 новых ретротранспозиций, по-видимому, являлись результатом смены матрицы в ходе обратной транскрипции (295). В этой связи интересно, что недавно была предложена гипотеза, согласно которой прыжки ОТ с РНК LINE на геномную ДНК могут повышать эффективность интеграции и, таким образом, могут быть востребованы в норме для успешного прохождения ретротранспозиции LINE (293, 295).

Вцелом, все эти данные анализа геномов, эволюционных исследований, а также экспериментальные доказательства, убедительно свидетельствуют, что смена РНК-матриц может проходить в ходе обратной транскрипции LINE. Нам удалось найти соответствующие химеры во всех геномах млекопитающих, но не в ДНК амфибий, рыб и беспозвоночных. Однако же, химерные элементы были найдены в геноме гриба-паразита риса Magnaporthe grisea (296), что говорит о консервативности этого механизма среди представителей царств животных и грибов.

Почему копии ядрышковых РНК так часто встречаются в составе химер?

5'- концевые части химер соответствуют ДНК-копиям ядрошковых РНК, тогда как 3'- концевые части являются копиями цитоплазматических РНК, включая транскрипты LINE. 3' концевые части - это в основном (> 80%) копии 5'-укороченных LINE (Табл. 1.4.3). Впрочем, в 12-20% химер 3' часть соответствует либо псевдогенам различных белок-кодирующих мРНК, либо ретропозонам SINE. В геномах млекопитающих, 5'-концевые части относятся в основном к псевдогенам, кодирующим малые ядерные РНК (мяРНК), включая U6 (82- 93%), U3 (1-10%) и U5 (0-1%). Другие псевдогены, встречающиеся с низкой частотой на 5'-конце - относящийся к SINE ретроэлемент Alu (0-2%), 7SL РНК (0-1%) и 5S рибосомная RNA (3- 6%). Все эти РНК характеризуются ядрышковой локализацией. U3 мяРНК вовлечена в процессинг рибосомной РНК в ядрышке (297). Хотя U5 и U6 как правило находятся вне ядрышка, в составе сплайсосом, но их созревание происходит именно в ядрышке (U6-2'-O-метилирование и псевдоуридилирование нуклеотидов) (298). РНК 7SL и Alu процессируются в ядрышке (299), так же как 5S рРНК (процессинг пре-рРНК). К сожалению, клеточная локализация РНК, соответствующей 5'-концу химер MINE из генома гриба M. grisea, пока так и не была установлена.

5'-конец MINE образован полноразмерной копией некодирующего транскрипта неизвестной функции длиной 1.1 т.п.н., названного WEIRD, который конститутивно экспрессируется на высоком уровне (296). Ген, кодирующий U6 мяРНК, был идентифицирован в геноме M. grisea, но он оказался не связан с какими-либо химерными элементами (неопубликованные данные). 3'-часть MINE соответствует 5'-укороченным копиям относящегося к LINE ретротранспозона MGL (296). Поскольку MINE элемент структурно чрезвычайно похож на химеры млекопитающих, можно предположить, что РНК-прообраз его 5' части (WEIRD), также локализуется в ядрышке, либо ассоциирована с рибонуклеопротеидами или РНК элемента MGL.

Преобладание копий именно ядрышковых РНК на 5' концах химер млекопитающих свидетельствует, что по крайней мере некоторые фазы жизненного цикла LINE связаны с ядрышком. В полном соответствии с этой гипотезой, Гудиер и соавторы (300) показали, что оба белка, кодируемых LINE человека (ORF1p и ORF2p) накапливаются в ядрышке. Авторы идентифицировали функциональный сигнал ядерной локализации в составе ORF2p (ОТ/интеграза) и установили, что ORF2p локализуется в ядрышках культивируемых клеток. ORF1p в основном находился в цитоплазме, но в некоторых клетках помимо цитоплазмы этот белок накапливался также и в ядрышках, колокализуясь с ORF2p. Таким образом, в ядрышке с высокой вероятностью можно ожидать и присутствия РНК LINE, связанной с белками ORF1p и ORF2p в рибонуклеопротеидный комплекс.

Впрочем, обратная транскрипция LINE точно не может быть ограничена ядрышком. В противном случае, большинство LINE были бы интегрированы в состав генов рибосомных РНК, которые и являются центрами формирования ядрышек. В реальности такой колокализации не наблюдается (273).

Вторая гипотеза постулирует, что некоторые ядрышковые РНК могут осуществлять защитную роль, препятствуя размножению LINE в геноме. Поскольку 3'- концевые LINE всегда соответствовали оборванным с 5'-конца копиям полноразмерных ретротранспозонов, то химеры могли бы быть образованы в результате неудачных актов ретротранспозиции. Согласно этой теории, укороченность с 5'-конца свежеинтегрированных LINE может быть следствием атак некоторых РНК на ретротранспозиционный комплекс. Гипотеза хорошо согласуется с тем фактом, что U6 мяРНК является ключевым атакующим компонентом сплайсосомы, который может воздействовать на другие РНК. Как показано для трёх геномов млекопитающих, характер распределения участков обрыва интегрированных копий укороченных одиночных LINE и LINE в составе химер практически полностью совпадал (Рис. 1.4.9). Примечательно, что ОТ L1 LINE характеризуется по крайней мере пятью участками в составе РНК L1, где этот фермент делает паузы (301). Эти участки совпадают с некоторыми «горячими точками» обрыва LINE и химеризации (Рис. 1.4.9).



Рисунок 1.4.9. Сопоставление частот 5'-обрыва и частот химеризации вдоль последовательностей L1 млекопитающих. Серые колонки показывают частоты 5'-обрывов L1 на 100 нуклеотидов, частоты химеризации показаны чёрным (масштабные отрезки даны слева). Для всех трёх исследованных геномов видна кокластеризация участков обрыва и химеризации в 3'-концевой части L1. Точки химеризации всех L1-содержащих химер млекопитающих сопоставляли с участками обрыва для случайно отобранных 250 человеческих, 350 мышиных и 210 крысиных L1. Стрелками показаны участки транскрипционных пауз, обнаруженные для ОТ L1 человека при обратной транскрипции матрицы L1 in vitro.

В экспериментах in vitro с ОТ LINE R2 было показано, что смена РНК-матрицы могла происходить лишь в случае, когда ОТ достигала 5' конца исходной РНК-матрицы (293). Если это верно и для ОТ L1, то смена матрицы и образование химерных ретроэлементов возможны только на 5' конце исходной РНК. Иными словами, РНК-матрица, соответствующая 3' концевой части химеры, в этом случае должна быть никирована или повреждена.

Ранее уже сообщалось, что 5' -укороченные РНК LINE человека и мыши могут образовываться in vivo в результате сплайсинга (302).

Третья гипотеза, по-видимому, наиболее реалистичная, объясняет присутствие рибонуклеопротеидов LINE в ядрышке необходимостью модификации их РНК, что может требоваться для активации ретротранспозиции (300). Эта гипотеза во многом базируется на том факте, что многочисленные модификации РНК осуществляются именно в ядрышке, причём многие такие модификации пока остаются неохарактеризованными. Кроме того, ядрышко может быть тем клеточным компартментом, где осуществляется окончательная сборка рибонуклеопротеидного комплекса LINE, аналогично тому, что было показано для некоторых ретровирусов (303). Обнаружение функционального консервативного сигнала ядрышковой локализации в составе ОТ LINE млекопитающих подкрепляет эту гипотезу (276). Ранее предполагалось, что рибонуклеопротеидный комплекс LINE пре-формируется в цитоплазме, а затем проходит в ядро. Согласно обсуждаемой гипотезе, этот комплекс далее переносится в ядрышко, где происходит его окончательная сборка и созревание. При созревании, некоторые распространённые ядрышковые РНК могут быть случайно захвачены рибонуклеопротеидом LINE, особенно его РНК-связывающим белком ORF1p. Затем созревший ретротранспозиционный комплекс выходит из ядрышка и ассоциирует с геномной ДНК, где и происходит сопряжённая обратная транскрипция. На этой стадии, с небольшой частотой могут происходить обратно-транскрипционные паузы (301). Паузы могут сопровождаться диссоциацией ОТ с исходной РНК-матрицы, в результате чего появляется новая 5'-укороченная копия LINE, или же может происходить «перескок» ОТ на новую РНК-матрицу, захваченную рибонуклеопротеидом LINE в ядрышке, при этом образуется химерный ретроэлемент. Гипотеза объясняет высокую частоту химеризации с последовательностями U6 как следствие высокой аффинности к ней РНК-связывающего белка LINE. Действительно, для U6 ранее была показана высокая аффинность к белкам Gag различных ретровирусов и LTR ретротранспозонов. Помимо прочего, эти белки являются шаперонами нуклеиновых кислот, функционально близкими белку LINE ORF1p (304), и молекулы U6 даже часто захватываются ретровирусными частицами (305, 306).

Некоторые особенности химерных ретроэлементов грибов

Семейство химерных ретроэлементов MINE из генома гриба Magnaporthe grisea уже упоминалось выше (296). 5'-концевые части MINE соответствуют полноразмерной копии некодирующего транскрипта неизвестной функции длиной 1.1 тпн, называемого WEIRD. 3' -концевая часть MINE соответствует 5'-укороченым копиям MGL LINE грибов (296). Инсерция одной копии MINE произошла буквально на глазах у исследователей, так что механизм образования химер у грибов активен и в настоящее время (296, 307). Систематический анализ геномных баз данных выявил для M. grisea 31 такой химерный ретроэлемент.

Как уже указывалось выше, функция РНК WEIRD пока остаётся неизвестной. В серии экспериментов по гибридизации in situ с зондами, специфичными для WEIRD, внутриклеточную локализацию WEIRD установить нам не удалось из-за чрезвычайно низкой проницаемости клеточной стенки M. grisea. При этом при помощи количественной ОТ-ПЦР был показан высокий уровень экспрессии WEIRD относительно двух генов домашнего хозяйства на всех стадиях жизненного цикла гриба. Содержание WEIRD в клетках сравнимо с РНК гена домашнего хозяйства Ilv5 (35, 20 и 61% от уровня транскрипции Ilv5 на различных стадиях). WEIRD экспрессируется дифференциально, причём повышенный уровень её содержания показан при инфекции гриба в растение (2-кратное превышение относительно содержания WEIRD в мицелии, Табл. 1.4.4). В то же время, ретротранспозон MGL транскрипционно более активен в спорах гриба.

Таблица 1.4.4. Транскрипционная активность WEIRD и MGL относительно уровней экспрессии генов Ilv5 и Ef1

	Ген домашнего хозяйства	Мицелий	Споры	Инфекция 0 часов	Инфекция 8 часов	Инфекция 24 часа
WEIRDa	Ef1	1.6±0.5	1.7±0.8	-	1.0±0.4	2.5±0.8
	Ilv5	35. 2±7.8	20.6±5.2	-	35.0±6.5	61.2±12.2
MGLa	Ef1	2.8±0.9	8.9±2.0	-	1.3±0.7	2.4±0.4
	Ilv5	60.2±14.5	108.2±14.3	-	44.0±6.6	58.2±10.9

aОтносительная транскрипция, % относительно уровня транскрипции соответствующего гена домашнего хозяйства.

Биоинформатический анализ показал, что WEIRD не является мобильным элементом, поскольку все геномные копии этой РНК были объединены с MGL LINE в составе химерных ретроэлементов. Одиночных копий WEIRD найдено не было. Отсутствие исходного гена WEIRD в базах данных, по-видимому, связано с незавершённостью проекта по секвенированию генома M. grisea (308). В других геномах также не было найдено последовательностей, гомологичных WEIRD.

Таким образом, WEIRD (1) не является мобильным элементом, (2) экспрессируется на всех стадиях жизненного цикла и (3) не кодирует белок. Это позволяет предположить, что WEIRD может являться функциональной конститутивной некодирующей РНК.

Помимо 31 MINE, в геноме M. grisea был найден также новый двухчастный химерный элемент, состоящий из копии WEIRD, объединённой с 5'-укороченным ретротранспозоном Mg-SINE. Химера WEIRD-MgSINE фланкирована прямыми повторами длиной 12 пар нуклеотидов. Mg-SINE - это неавтономный ретроэлемент, относящийся к группе SINE (309). Для размножения в геноме он использует стратегию “молекулярной мимикрии” относительно последовательности MGL. 3' конец Mg-SINE гомологичен 3' концевому фрагменту MGL, который используется для праймирования обратной транскрипции (310, 311). По-видимому, это свойство Mg-SINE обуславливает его узнавание ретропозиционным аппаратом MGL.

Кроме того, нам удалось обнаружить химерный элемент, состоящий из трёх частей (Рис. 1.4.11). На 5' конце располагалась полноразмерная копия WEIRD, объединённая с 5'-укороченным Mg-SINE, который, в свою очередь, был объединён с 5'-укороченным MGL. Химера фланкирована прямыми повторами длиной 14 пар нуклеотидов, что доказывает одновременную интеграцию в геном всех её компонентов.

В серии ОТ-ПЦР экспериментов мы показали, что многие химерные элементы грибов транскрибируются. Для этого проводилась амплификация с праймерами, специфичными для MINE: один на 5'-концевую часть WEIRD (в прямой ориентации), а другой - на 3' концевой участок MGL (в обратной ориентации; Рис. 1.4.10). Некоторые MINE экспрессировались в мицелии, спорах и при инфекции. Секвенирование ОТ-ПЦР продуктов позволило идентифицировать три транскрипционно активные копии MINE: MINE-A (полосы 1 и 5), MINE-B (полосы 2 и 4) а также MINE-C (полоса 3) (коды доступа в GenBank EF585235-EF585237).



Рисунок 1.4.10. Транскрибируемые химеры MINE, найденные на разных стадиях жизненного цикла M. grisea. Продукты nested ОТ-ПЦР разделяли в агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. Стрелки внизу обозначают сайты посадки праймеров Продукты ОТ-ПЦР выделяли из геля и секвенировали (полосы 1-5, в середине). Для дальнейшей специфической амплификации каждого индивидуального химерного элемента в ходе количественной ОТ-ПЦР, использовалась комбинация праймеров q1+q2. Каждый праймер q1 специфичен участку стыка WEIRD-MGL для исследуемого элемента MINE.

На самом деле, транскрибируемых химер, по-видимому, больше, чем три, поскольку многие такие элементы обладают длинными частями, сформированными MGL (до 5 т.п.н.), которые не могут быть эффективно амплифицированы в ходе ОТ-ПЦР. Для определения уровня транскрипции обнаруженных экспрессирующихся MINE, провели ряд количественных ОТ-ПЦР экспериментов с праймерами, специфичными для стыков WEIRD-MGL (праймеры q1 и q2 на рисунке 1.4.10). Результаты приведены в таблице 1.4.5. MINE-A, MINE-B и MINE-C на разном уровне транскрибируются на всех исследованных стадиях жизненного цикла гриба.

MINE-B экспрессируется конститутивно на всех стадиях, тогда как MINE-A и MINE-C более активны при инфекционном проросте, что совпадает с данными, полученными ранее для WEIRD, а в спорах транскрипция MINE-A понижена (x 0.5 относительно мицелия). Дифференциальная транскрипционная активность химер может отражать выполнение ими какой-либо функциональной нагрузки в клетках гриба.

Таблица 1.4.5. Экспрессия MINE-A, -B и -C относительно генов домашнего хозяйства Ilv5 и Ef1

Стадия	MINE-A	MINE-B	MINE-C
	О.т.a (Ef1)	О.т.a (Ilv5)	О.т.a (Ef1)	О.т.a (Ilv5)	О.т.a (Ef1)	О.т.a (Ilv5)
мицелий	4.4±1.6	70.1±14.5	4.4±0.2	71.2±5.1	1.4±0.1	24.1±8.5
спора	2.1±0.4	20.0±0.7	4.7±0.5	44.6±1.7	2.8±0.3	26.4±1.0
инфекция 24 часа	10.4±1.0	154.3±17.8	4.3±1.24	64.4±10.2	3.1±0.6	42.7±7.4

aОтносительная транскрипционная активность, % от уровня транскрипции соответствующего гена домашнего хозяйства.

Пожалуй, наиболее интересным результатом анализа химер грибов оказалось то, что смена матрицы проходит только по специфическим нуклеотидным позициям в составе исходной РНК. 3' концевые части химер, как правило, сформированы фрагментами MGL LINE. Длина этих фрагментов варьирует от 230 до 5461 3'-концевых нуклеотидов MGL. Анализ последовательностей 33 химер позволил картировать 28 различных точек химеризации в составе последовательности MGL. В шести случаях, одна и та же точка использовалась при образовании двух различных элементов. То есть, смена матриц осуществлялась по одной и той же нуклеотидной позиции РНК-матрицы в ходе формирования шести пар химер. Анализ 28 точек химеризации показал, что они расположены не случайным образом в составе РНК MGL (таблица 1.4.6).

Точки смены матрицы соответствовали особому мотиву нуклеотидной последовательности, который присутствовал также и в точках химеризации в составе Mg-SINE. Всем им соответствовала консенсусная последовательность GCC*A/U, где * обозначает участок возможной смены матрицы. Обратная транскриптаза MGL копирует матрицу до нуклеотида A/U в составе мотива, где она может «перепрыгнуть» на другую РНК перед триплетом GCC.

Таблица 1.4.6. Репрезентативные точки химеризации, найденные в геноме M. grisea

№ химерыa	РНК-матрицаb	Вышележащая посл-тьc	Нижележащая посл-тьd
34	MGL	CGCAGC	ATTCG
24	MGL	TATGCT	ATATT
23	MGL	AGCGCC	TCCGG
4	MGL	GGGGTC	TTAGA
15	MGL	GGGGTC	TTAGA
14	MGL	TGGGCC	TTTCT
13	MGL	GGAGCC	CGAGG
12	MGL	GGAGCC	CGAGG
9	MGL	TTGGCC	ATGAG
8	MGL	TTGGCC	ATGAG
6	MGL	ATAGCC	ACCAA
5	MGL	ATAGCC	ACCAA
2	MGL	ACTGCC	TTTTC
1	MGL	GCCGTC	AGACG
7	MGL	CAAGCT	TCGGG
16	MGL	TGGGCC	GCTTT
32	MgSINE	GCCGTC	AGACG
33	MgSINE	CCCGCC	TGTGC
Консенсус. посл-ть	Все типы	---GCC	A/T----

aДетальное описание химер дано в работе (285).

bТип РНК-матрицы.

cВышележащая нуклеотидная последовательность относительно участка смены матрицы.

dНижележащая нуклеотидная последовательность относительно участка смены матрицы.

Надо заметить, что РНК полноразмерного MGL имеет 87 мотивов GCC(A/U) и гораздо больше - участков с однонуклеотидными заменами, тогда как только лишь небольшая их часть используется при химеризации in vivo. Учитывая, что шесть таких сайтов являются “горячими точками” РНК рекомбинации, очевидно, что наличие мотива необходимо, но не достаточно для смены матрицы. Мы постулировали, что точки химеризации расположены в структурированных участках РНК-матрицы. Такие участки могут быть труднопроходимы для ОТ. Похожая ситуация наблюдается для химер млекопитающих, где многие точки химеризации примерно соответствуют наблюдаемым участкам паузы ОТ (301, 312). В согласии с выдвинутой гипотезой, In silico вокруг точек химеризации в геноме гриба были предсказаны участки выраженной вторичной структуры РНК (Предсказанные структуры размещены в Интернет по адресу:

http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-2164-8-360-s2.doc.

Остаётся неясным, почему ОТ диссоциирует непосредственно перед триплетом GCC. Для многих ОТ известно, что их процессивность зависит от нуклеотидного состава РНК-матрицы. Можно предположить, что мотив GCC, в особенности находящийся в составе шпильки, является труднопроходимым местом для ОТ MGL, что может приводить к временной остановке фермента в этом месте или же к диссоциации и смене матрицы.

В заключение следует упомянуть, что вышеуказанный механизм химеризации не включает какого-либо специфического спаривания нуклеотидов между новосинтезированной кДНК и второй РНК-матрицей, поскольку никаких участков микро- или протяжённых гомологий между ними обнаружено не было.

Тройные химеры и уточнение схемы образования химерных элементов

Обнаруженный в нашей работе тройной элемент грибов (Рис. 1.4.11) доказывает, что в ходе LINE-опосредованной РНК рекомбинации in vivo может происходить более чем один акт смены матрицы. Наиболее вероятным механизмом образования тройных химер является двойная смена матрицы при ретротранспозиции LINE (Рис. 1.4.12). Скопировав 3'-концевые 4369 нуклеотидов MGL LINE (полная длина MGL составляет ~6 т.п.н.), ретропозиционный комплекс переключается на другую РНК и добавляет к кДНК ~350-нуклеотидный 3'-концевой фрагмент элемента Mg-SINE.

Затем, не закончив синтез комплементарной цепи Mg-SINE, ОТ меняет матрицу во второй раз и прибавляет к двухчастной кДНК ещё и полноразмерную копию WEIRD (1113 нуклеотидов). После лигирования химеры и репарации геномной ДНК, элемент оказывается фланкирован 14-нуклеотидными прямыми повторами - дупликациями преинтеграционного сайта.



Рисунок 1.4.11. Схема обнаруженных тройных элементов из геномов M.grisea (A), человека (Б) и мыши (В). Только элементы гриба и мыши фланкированы прямыми повторами и, соответственно, могут, рассматриваться как тройные химеры.

Ранее в геноме человека были найдены два тройных элемента (282, 284) (Рис. 1.4.11). Один из них интегрирован в протяжённый микросателлитный локус, другой - в АТ-богатую последовательность. Поэтому идентифицировать прямые повторы для них не удалось.

Однако же, в геноме мыши были обнаружены два новых тройных химерных ретроэлемента, фланкированных 15- и 16-нуклеотидными прямыми повторами (Рис. 1.4.11). Химеры состояли из блоков B2 SINE, U6 мяРНК и L1 LINE. Тройные химеры в геномах таких эволюционно отдалённых организмов, как млекопитающие и нитчатые грибы свидетельствуют, что двойные акты смены матрицы в ходе обратной транскрипции LINE, возможно, являются не исключением, а консервативным механизмом перестройки эукариотической ДНК.



Рисунок 1.4.12. Механизм образования химер при помощи энзиматического аппарата LINE. (1) преинтеграционный комплекс LINE связывает РНК LINE, SINE или другую РНК в цитоплазме. (2) Рибонуклеопротеид транспортируется в ядро. (3) Обратная транскрипция связанной РНК, праймированная одноцепочечным разрывом в геномной ДНК (target site primed reverse transcription). (4A) Успешная интеграция кДНК в геномную ДНК. (4B) Смена матрицы на другую РНК в ходе обратной транскрипции. (5A) Интеграция двойной химеры в геномную ДНК. (5B) Вторая смена матрицы на другую РНК с последующей репарацией ДНК приводит к образованию интеграции тройного химерного ретроэлемента, фланкированной прямыми повторами. Нормальная последовательность событий при ретротранспозиции LINE: (1)- (2)- (3)- (4A).

2. Анализ транскрипционной активности геномных повторов

Работа по этому проекту выполнялась группой исследователей, включающей Е.В.Гогвадзе, Е.А.Ковальскую-Александрову, Т.В.Чалую, Е.Д.Свердлова, а также А.А.Буздина. Основной объём экспериментальной работы был выполнен Е.А.Ковальской-Александровой и Е.В.Гогвадзе, общее руководство работой осуществлял Е.Д. Свердлов, идея метода GREM, его разработка и выбор объекта - заслуга диссертанта.

2.1 Введение

Повторяющиеся элементы образуют значительную часть большинства эукариотических геномов, и крупномасштабные исследования их транскрипционной активности привлекают всё больший интерес. Многие геномные повторы появляются при встройках мобильных элементов. Ретроэлементы, представители мобильных элементов, которые размножаются посредством своих РНК-копий, это единственная транспозиционно активная группа мобильных элементов у млекопитающих. В ДНК позвоночных, ретроэлементы занимают 30-40% всего генома (50, 313-315). Являясь мобильными переносчиками модулей транскрипционной регуляции, ретроэлементы могут изменять регуляцию активности генов хозяина, в частности, генов, вовлечённых в эмбриональное развитие, что делает их вероятными кандидатами на роль участников процесса видообразования (316).

Недавно было показано, что ретроэлементы могут направлять транскрипцию соседних уникальных последовательностей генома хозяина (317, 318). Многие типы геномных повторов транскрибируются in vivo (319, 320). Однако же, значительная доля таких экспрессирующихся повторов является частью транскриптов большего размера, считываемых с вышележащих геномных промоторов. Обычные и популярные методы анализа транскриптома, такие, как ОТ-ПЦР, дифференциальный дисплей (102, 321), вычитающая гибридизация (11, 12, 77), серийный анализ генной экспрессии (SAGE) (322) и микрочиповая гибридизация, не позволяют проводить различия между транскриптами, насквозь прочитанными с вышележащих промоторов, и теми, которые обязаны собственной транскрипционной активности геномных повторов. Различные модификации метода 5' RACE (англ. rapid amplification of cDNA ends - быстрая амплификация концов кДНК) позволяют точно находить участки старта транскрипции (257), но не могут быть использованы для количественного и крупномасштабного скрининга транскрипционной активности. Нашей целью являлась разработка полно-транскриптомной стратегии, которая позволяла бы проводить исчерпывающие исследования собственной промоторной активности повторяющихся элементов. Для этого мы постарались комбинировать преимущества, предоставляемые техникой 5'-RACE и методами гибридизации нуклеиновых кислот.

В нашей группе был разработан метод, названный GREM (Genomic Repeat Expression Monitor), основанный на гибридизации тотальных пулов 5'-концевых частей кДНК с полногеномными пулами ДНК, фланкирующей повторяющиеся элементы, с последующей селективной ПЦР амплификацией получающихся гибридных дуплексов геномной ДНК и кДНК. Библиотека гибридных молекул кДНК\геномной ДНК, полученная таким образом, может использоваться как набор маркеров для индивидуальных транскрипционно активных повторов. Метод является как качественным, так и количественным, поскольку частота встречаемости тех или иных маркёров пропорциональна промоторным активностям соответствующих им повторяющихся элементов.

Мы применили GREM для полногеномной идентификации промоторно-активных эндогенных ретровирусов, специфичных для ДНК человека (чсЭРВ). Как было указано выше, HERV-K (HML-2) - это единственное семейство эндогенных ретровирусов, содержащее членов, уникальных для генома человека (251, 261). Эта группа, члены которой не только сохранили свою транскрипционную активность (323) , но, возможно, по-прежнему обладают некоторым инфекционным потенциалом (263, 324), является одной из наиболее биологически активных ретровирусных семейств генома человека (325-327). Основная часть ЭРВ претерпела гомологичную рекомбинацию по последовательностям своих LTR, так что в настоящее время это семейство представлено, в основном, одиночными LTR (254, 328). Как указывалось выше, чс LTR обладают значительным сходством первичной последовательности и образуют отдельное семейство (названное HS) (251, 261). HS семейство характеризуется диагностическими нуклеотидными заменами по ряду позиций своей консенсусной последовательности (251). Семейство HS на 86% состоит из последовательностей, уникальных для генома человека, и содержит 156 последовательностей. HS-семейство представлено фрагментами полноразмерных провирусов HERV-K (HML-2) (11.5% представителей), делетированных провирусов (5.2%), или одиночных LTRs (83.3%). Ниже будет детально описан метод GREM и результаты, полученные при помощи этого экспериментального подхода для характеристики транскрипционной активности чсЭРВ in vivo.

гибридизация нуклеиновый кислота последовательность

2.2 Метод GREM: полногеномный поиск промоторно-активных повторов

Особенности метода GREM. Насколько мне известно, GREM (Genomic Repeat Expression Monitor) является единственным на сегодняшний день полно-транскриптомным подходом, позволяющим детально исследовать собственную промоторную активность повторяющихся элементов и отбросить фон «сквозной» транскрипции через последовательность повтора. Получаемая при помощи GREM клонотека может использоваться как набор маркёров индивидуальных транскрипционно активных повторяющихся элементов. GREM объединяет преимущества метода 5' RACE и гибридизации нуклеиновых кислот. Метод основан на том, что промоторно-активные геномные повторы инициируют транскрипцию со своих собственных внутренних последовательностей, так что соответствующие транскрипты содержат фрагмент последовательности повтора на своих 5'-концах. Это выполняется для всех основных классов ретроэлементов: LTR-содержащих, LINE и SINE (269, 329, 330). Поэтому мы старались специфично выделить фракцию транскриптов, содержащих последовательность повтора на 5' конце. Было показано, что количество индивидуальных маркёров в библиотеке пропорционально содержанию мРНК, считываемой с соответствующего промоторно активного повтора. В наших модельных экспериментах, GREM использовался для полногеномного исследования особенностей транскрипционной активности LTR семейства HS в клетках зародышевого пути человека (паренхима яичка) и в соответствующем злокачественном новообразовании (семинома).

Транскрипция LTR полноразмерного провируса может приводить к образованию двух видов продуктов: РНК вирусных генов (если инициируется на 5' LTR, см. Рис.2.2.1), либо, в случае промоторной активности 3' LTR, РНК уникальных не-вирусных последовательностей, которые фланкируют провирус с 3' конца.

Рис. 2.2.1. Схема транскрипционной активности одиночных (слева) и провирусных (справа) LTR. Транскрипция с провирусного 5' LTR даёт РНК вирусных генов, тогда как экспрессия одиночных или 3' провирусных LTR приводит к транскрипции геномных последовательностей хозяина, фланкирующих 3' конец ретроэлемента.

Метод GREM, схематично представленный на Рис. 2.2.2, состоит из трёх основных стадий: (1) синтез полноразмерной библиотеки кДНК, молекулы которой несут специфическую маркёную последовательность, введённую на 5' конец кДНК, (2) селективная ПЦР-амплификация геномных последовательностей, фланкирующих повтор, и (3) гибридизация кДНК и фрагментов, фланкирующих повторы, с последующей ПЦР-амплификацией гетеродуплексов геномной ДНК\кДНК.



Рис. 2.2.2. Схема метода GREM (детальное описание дано в тексте). Протокол включает три основные стадии: (1) полногеномная амплификация 3'-концевых геномных фланков исследуемой группы повторяющихся элементов (на данном примере, HS LTR). Обработка получившегося ампликона экзонуклеазой ExoIII образует 5'-выступающие концы, которые пригодятся на третьей стадии. (2) Синтезируется олиго (Т)-затравленная библиотека кДНК из интересующей ткани (тканей). На этой стадии, в кДНК вводится последовательность линкерного олигонуклеотида (CS) непосредственно по позиции транскрипционного старта РНК, при помощи эффекта “cap-switch”. кДНК фрагментируется рестриктазой AluI, которая не имеет сайтов узнавания в составе последовательности HS LTR. Эта манипуляция предотвращает последующую амплификацию последовательностей LTR, транскрибируемых «насквозь» с вышележащих промоторов. (3) Наконец, ампликон геномной ДНК (стадия 1) гибридизуют с 5' -маркированной кДНК (стадия 2). Выступающие концы ДНК заполняются ДНК полимеразой, а получившиеся гибриды геномной ДНК\кДНК (ELT) амплифицируются в ходе nested ПЦР с праймерами, специфичными для адаптора, фланкирующего геномную ДНК, и для маркёрной последовательности, введённой на 5' конец кДНК.

Первая стадия GREM нацелена на амплификацию полноразмерных молекул кДНК, маркированных с 5' конца введённой последовательностью адапторного олигонуклеотида (CS в нашем случае). Такое мечение достигается благодаря применению эффекта “cap-switch” в ходе синтеза кДНК. Достигнув 5' конца мРНК-матрицы, олиго(dT)-праймированная ревертаза нематрично добавляет несколько добавочных дезоксицитидиновых нуклеотидов на 3' конец кДНК. При этом олигонуклеотид, содержащий олиго-рибо(G) последовательность на 3' конце, гибридизуется на дезоксицитидиновый трэк, что образует праймер, позволяющий ревертазе сменить матрицу и дополнительно досинтезировать на 3' конец первой цепи кДНК последовательность адаптора. Этот подход позволяет достаточно точно помечать 5' концы кДНК, соответствующие точкам старта транскрипции (Рис. 2.2.2). Затем на матрице первых цепей получают вторые цепи кДНК. Перед стадией гибридизации (3), кДНК обрабатывают рестриктазой AluI для предотвращения фоновой амплификации транскриптов, читаемых «насквозь» с вышележащих промоторов относительно направления транскрипции со стандартного промотора LTR (Рис. 2.2.2, стадия 1, шаг “обработка AluI”). Фермент AluI был выбран, поскольку в консенсусной последовательности HS LTR не содержится рестриктных сайтов для этой частощепящей Эндонуклеазы. Обработка кДНК ферментом AluI (Рис. 2.2.2) снижает выход фоновых продуктов на следующей стадии.

На второй стадии проводилась селективная ПЦР-амплификация геномных локусов, фланкирующих 3' концы HS LTR. Гибридизация кДНК с получаемым ампликоном используется для селекции именно тех молекул кДНК, которые содержат последовательность HS LTRs на 5' конце. Амплификация геномных фланков - это критически важный шаг, обеспечивающий специфичность всей процедуры в целом. Nested ПЦР позволяет проводить селективную амплификацию всех последовательностей, фланкирующих интересующие семейства геномных повторов, тогда как амплификация кДНК не могла бы предоставить такую же высокую селективность, поскольку точные позиции точек старта транскрипции в составе последовательности повтора могут варьировать для различных индивидуальных повторов (318, 331, 332) и, поэтому, дизайнирование подходящих праймеров для ПЦР было бы проблематично.

Для амплификации геномных участков, фланкирующих LTR, геномная ДНК человека была фрагментирована рестриктазой AluI, к полученным фрагментам был лигирован синтетический GC-богатый адапторный олигонуклеотид длиной 45 нуклеотидов (A1A2), а затем была проведена nested ПЦР амплификация с использованием HS LTR- и адаптор-специфических праймеров. Последовательность HS LTR не содержит рестриктных сайтов AluI, при этом эта рестриктаза образует сравнительно короткие фрагменты ДНК, на которые не действует эффект ПЦР-селекции по размеру фрагмента (68). Как было ранее показано, использование GC-богатых адапторов минимизирует фоновую амплификацию по механизму супрессии ПЦР (19, 80, 97), что приводит к практически 100%-селективной амплификации целевой фракции генома.

Ампликоны LTR-фланкирующих последовательностей обрабатывали экзонуклеазой ExoIII для создания 5' выступающих концов, которые требуются на стадии (3) для предотвращения фоновой кросс-гибридизации между LTR-содержащими последовательностями. Ранее мы показали, что ExoIII может быть использована для удаления адапторных последовательностей из состава молекул гибридизационной смеси (18, 19). При используемых условиях, ExoIII удаляет нуклеотиды со скоростью порядка ~5 нуклеотидов в минуту, что позволяет более-менее точно удалить ~30 3'-концевых нуклеотидов из состава ампликонов HS LTR. На последней стадии, рестрицированная кДНК гибридизуется с 3'-геномными фланками LTR. Для того, чтобы селективно амплифицировать гетеродуплексы, содержащие как геномные фланки LTR, так и 5' концевые фрагменты кДНК, образованных благодаря промоторной активности LTR, мы проводили ПЦР с праймером на 5'маркёрную последовательность в составе кДНК и праймер A2, специфичный для адаптора, лигированного к геномной ДНК. Для повышения специфичности, далее проводился дополнительный раунд ПЦР с праймерами A4 и LTRfor3 (Рис. 2.2.2).

В результате амплифицировались только целевые гетеродуплексы, но не дуплексы с кДНК, не связанной с экспрессией LTR, либо же содержащей насквозь прочитанные LTR. Фон, который потенциально может быть создан LTR, протранскрибированными насквозь в прямом направлении, пренебрежимо мал. Исследование баз данных транскрибируемых последовательностей человека выявило 38 транскриптов, содержащих «сквозные» (англ. read-through) HS LTR, среди них - только 4 LTR в прямой ориентации; рестрикция AluI “in silico” демонстрирует полное удаление всех подобных транскриптов из итоговых библиотек.

Полученные в ходе последней амплификации гетеродуплексы, названные Expressed LTR Tags (ELT), далее клонировали и секвенировали. Каждый ELT содержал 3'-концевой фрагмент HS LTR, участок 3' -фланкирующей геномной ДНК, а также адапторную последовательность (A4).

Детекция промоторной активности HS LTR при помощи GREM. Анализ последовательностей ELT позволял однозначно картировать соответствующие им одиночные и 3' провирусные LTR. Однако же, картирование невозможно в случае провирусных 5' LTR, поскольку транскрибируемые с них провирусные последовательности многократно повторены в геноме и обладают высокой степенью идентичности (Рис. 2.2.1). Результаты анализа библиотек ELT, полученные для паренхимы яичка и семиномы, а также созданная на их основе первая в мире карта промоторно активных геномных повторов семейства HS LTR, будут представлены в следующем разделе. Для пяти случайно отобранных одиночных LTR, обладающих промоторной активностью согласно данным GREM, нам удалось при помощи метода 5'RACE с точностью до нуклеотида картировать точку начала транскрипции (Рис. 2.2.3 (318). Во всех случаях, транскрипция инициировалась с одного и того же неканонического промотора, расположенного на границе участков R и U5 последовательности HS LTR.



Рисунок 2.2.3. Картирование точки начала транскрипции в составе последовательнсти LTR. A), картирование 5'-концевых частей кДНК, полученных в ходе ПЦР с праймером CS на 5' конец кДНК и с уникальными геномными праймерами G, на консенсусной последовательности семейства HS группы LTR HERV-K (HML-2). Последовательности потенциальных регуляторных участков даны курсивом. Б), схема ОТ-ПЦР-подхода к определению провирусной точки инициации транскрипции в составе LTR transcription. LTRfor3 и LTRfor4 -это LTR-специфичные праймеры на участки ниже и выше картированной точки начала транскрипции у одиночных LTR, соответственно. Gag - праймер, специфичный для вирусного гена gag. В), выравнивание фрагмента LTR длиной ~300 пн, который обладал промоторной активностью в экспериментах с экспрессией репортёрного гена (266), и консенсусной последовательности HS HERV-K LTR.

Транскрипционный уровень LTR линейно коррелирует с представленностью соответствующих ELT. Для исследования зависимости между представленностью ELT в библиотеках и транскрипционной активностью LTR, проводили ОТ-ПЦР с парами праймеров, один из которых, направленный наружу от LTR, был специфичным к 3' концевому участку LTR, а второй - к уникальному геномному локусу, лежащему на расстоянии от 70 до 300 пн от 3' конца LTR. Уровень транскрипции измеряли относительно гена бета-актина. Для выборки из 20 протестированных HS LTR, частоты встречаемости ELT в библиотеках линейно коррелировали с уровнем соответствующих им транскриптов, измеренным при помощи ОТ-ПЦР для обеих тканей, со значениями коэффициента корреляции 0.91 и 0.89 для паренхимы яичка и семиномы, соответственно (табл. 2.2.1). Это свидетельствует об адекватности метода GREM задаче одновременного качественного и количественного анализа промоторной активности исследуемой группы повторов.

Таблица 2.2.1. Соотношение уровней транскриптов LTR и частот встречаемости соответствующих ELT в библиотеках семиномы и паренхимы яичка.

LTR №	Паренхима яичка	Семинома
	Транскрипционный уровеньa (% от уровня гена бета-актина)	Частота ELT, %	Транскрипционный уровеньa (% от уровня гена бета-актина)	Частота ELT, %
62	0.004 ± 0.001	0	0.014 ± 0.003	0.24
80	0.16 ± 0.04	0.25	0.17 ± 0.03	0.24
81	1.4 ± 0.4	15.19	0.15 ± 0.03	1.44
99	2.9 ± 0.2	32.66	0.45 ± 0.10	5.05
100	0	0	0.016 ± 0.007	0.24
108	0.26 ± 0.09	0.50	0.013 ± 0.005	0
109	0	0	0	0
113	0.17 ± 0.03	0.25	0.23 ± 0.05	0.24
115	0.02 ± 0.005	0.25	0.019 ± 0.006	0.24
129	0.24 ± 0.03	3.61	0.054 ± 0.007	0
131	0.013 ± 0.004	0	0.014 ± 0.002	0.24
138	0.032 ± 0.013	0.25	0	0
139	0.16 ± 0.05	1.77	0.12 ± 0.02	0.72
140	0.13 ± 0.04	0.25	0.085 ± 0.017	0
141	0.01 ± 0.003	0	0.014 ± 0.003	0.24
145	0.35 ± 0.06	2.79	0.23 ± 0.04	1.68
149	0.24 ± 0.03	1.52	0.054 ± 0.016	0.48
152	0.12 ± 0.02	0.76	0.92 ± 0.17	11.30
155	0.059 ± 0.014	0.76	0.44 ± 0.07	4.57
5' пров. LTR	1.08 ± 0.09	14.94	5.58 ± 0.88	44.47

a Относительный уровень транскрипции, измеренный методом ОТ-ПЦР.

2.3 Приложение GREM для поиска промоторно-активных эндогенных ретровирусов, специфичных для ДНК человека

Метод GREM использовали для создания библиотек ELT нормальной паренхимы яичка и соответствующей опухоли, семиномы. Биологические образцы брались от одного и того же пациента, так что распределение ELT между библиотеками отражает ткане- и опухоль-специфичность экспрессии чсЭРВ.

Для каждой ткани было отсеквенировано 500 клонов ELT. За вычетом плазмидных перестроек и плохо отсеквенированных последовательностей, осталось 395 и 419 ELT для паренхимы и семиномы, соответственно. Анализ ELT позволил нам однозначно картировать промоторно активные одиночные и 3'-провирусные LTR.

В общей сложности 78 представителей семейства HS (50%) оказались промоторно активными хотя бы в одной из тканей. Для многих индивидуальных LTR, содержание ELT значительно различалась в нормальной и опухолевой тканях. Многие LTR слабо транскрибировались и поэтому были представлены малым числом ELT. И наоборот, остальные НS элементы были представлены повышенным числом ELT (>10 ELTs). Например, для семи индивидуальных HS LTR и для фракции 5' провирусных LTR, частота встречаемости ELT, соответствующих этим элементам, различалась в пять раз между двумя сравниваемыми тканями.

Эти данные затем были подтверждены методом ОТ-ПЦР. Интересно, что фракция 5' провирусных LTR (с которых считываются вирусные гены), была в шесть раз более активна в семиноме, чем в паренхиме яичка, что хорошо сочетается с полученными ранее результатами по экспрессии чсЭРВ в линиях рака клеток зародышевого пути (98, 333, 334).

Качественный анализ: содержание промоторно-активных HS LTRs выше в ген-богатых областях. В ходе работы было установлено, что по крайней мере 50% всех представителей HS семейства являлись функциональными промоторами in vivo. Картирование членов семейства HS с помощью сервера UCSC human genome web browser позволило разделить их на четыре группы в зависимости от положения относительно известных генов человека (схема дана на Рис. 2.3.1 А): группа C1, расстояние от генов (D)>35 тпн, 80 HS элементов; (C2), 5D35 тпн, 24 элемента; (C3), HS элементы входят в состав интронов генов или D5 тпн, 40 представителей; (C4), HS элементы в составе экзонов мРНК, 12 представителей. Детальная информация относительно локализации соответствующих LTR, соседних генов и картированных мРНК в формате MS Excel размещена в Таблице 1 дополнительного материала по адресу в Интернет:

http://www.thescientificworld.com/supplements/2007.270/Buzdin_031307_SuppTable1.xls

Поскольку число представителей для этих четырёх групп сильно различалось, для дальнейшей характеристики промоторной активности нами использовались не абсолютные величины, а относительные, нормированные на количество элементов в группе. На рис. 3.2.1 B приведены значения отношения суммарной промоторной активности LTR данной категории к количеству составляющих её элементов. Видно, что значение сравнительно мало для группы C1 (34%), тогда как для LTR, расположенных ближе к генам (группа C2) оно возрастает ~ в 1.8 раза (63%). Для LTR из интронов генов или расположенных в близком соседстве с ними (группа C3) значение ещё несколько выше (68%). Наконец, для LTR из экзонов генов (группа C4), было отмечено наивысшее значение промоторно активных элементов (75%).



Рисунок 2.3.1. Доля промоторно активных LTR в четырёх группах (C1-C4). (A) Относительное содержание промоторно активных LTR рассчитывали как отношение числа LTR каждой группы, для которых были обнаружены ELT, к общему числу LTR в группе. (B) Распредение промоторно активных LTR по группам. (C) LTR, обладающие промоторной активностью как в паренхиме яичка, так и в семиноме.

Также на Рис. 2.3.1 показано распределение по группам тех LTR, которые промоторно активны как в семиноме, так и в паренхиме яичка (в обеих тканях). На фоне невысоких долей для групп C1, C2 и C3 (10, 29, 20%), значительно выделяется группа С4 со значением 67%.

Можно сделать выводы, что (1) относительное содержание промоторно активных LTR в ген-богатых областях генома значительно выше, чем в локусах, обеднённых генами; (2) это содержание достигает максимальных значений для тех участков, где HS элементы “перекрываются” с клеточными транскрибируемыми последовательностями (группа C4); (3) LTR из группы C4, как правило, промоторно активны в обеих тканях. Очевидно более выраженная промоторная активность представителей группы C4 может объясняться, возможно, лучшей доступностью экзонных участков для транскрипционных факторов.

Количественный анализ: промоторная активность зависит от геномного окружения и от природы LTR (одиночный либо провирусный).

Анализ распределения ELT выявил различный уровень промоторной активности для одиночных и провирусных LTR, при этом различия зависели также и от геномного окружения. Экспрессия 5' провирусных LTR не может быть детально исследована по причинам, указанным в начале раздела, поэтому на количественном уровне анализировали распределение промоторно активных одиночных и 3' провирусных LTR среди групп C1-C4. Относительная промоторная сила для каждой группы HS элементов рассчитывалась как частное отношения числа всех ELT группы к суммарному числу ELT и относительного содержания HS элементов данной группы среди HS элементов всех групп (при всех рассчетах не учитывались 5' провирусные LTR).