Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита
Особенности эволюции переносимых клещами флавивирусов. Патогенез и формирование иммунного ответа при инфекции. Изменение свойств вируса клещевого энцефалита при адаптации к клещам и млекопитающим и выявление хозяин-специфических генетических детерминант.
Рубрика | Биология и естествознание |
Вид | автореферат |
Язык | русский |
Дата добавления | 24.12.2017 |
Размер файла | 699,9 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
штамм Абсеттаров |
||||||||
Цитокины |
Срок после заражения животных |
|||||||
1 сут |
2 сут |
3 сут |
4 сут |
5 сут |
6 сут |
7 сут |
||
ФНО- |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
31543 |
|
ИЛ-10 |
10134 |
К |
К |
К |
К |
К |
4514 1 |
|
-ИФН |
К |
К |
К |
275 |
39 |
К |
28436 |
|
ИЛ-12 |
К |
32817 |
К |
К |
н/и |
н/и |
н/и |
|
ИЛ-6 |
К |
К |
К |
699 |
К |
К |
64085 |
|
ИЛ-2 |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
штамм ЭК-328
Цитокины |
Срок после заражения животных |
|||||||
1 сут |
2 сут |
3 сут |
4 сут |
5 сут |
6 сут |
7 сут |
||
ФНО- |
К |
К |
К |
К |
1074 |
К |
н/и |
|
ИЛ-10 |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
331 1 |
|
-ИФН |
К |
К |
302 |
494 |
К |
К |
н/и |
|
ИЛ-12 |
К |
К |
К |
29298 |
н/и |
н/и |
н/и |
|
ИЛ-6 |
К |
К |
746 |
К |
К |
К |
1139 |
|
ИЛ-2 |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
н/и |
вариант М
Цитокины |
Срок после заражения животных |
|||||||
1 сут |
2 сут |
3 сут |
4 сут |
5 сут |
6 сут |
7 сут |
||
ФНО- |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
|
ИЛ-10 |
78 |
К |
К |
121 |
315 |
К |
К |
|
-ИФН |
К |
К |
965 |
428 |
11667 |
10114 |
16770 |
|
ИЛ-12 |
К |
41442 |
К |
К |
н/и |
н/и |
н/и |
|
ИЛ-6 |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
576 |
|
ИЛ-2 |
К |
К |
253 |
К |
416 |
К |
396 |
Примечание: концентрация ИЛ в контрольных сыворотках крови (К), полученных от животных после введения среды 199 на растворе Эрла (пкг/мл): ФНО- - 233; ИЛ-10 - 84; -ИФН - 25±2; ИЛ-12 - 131±56; ИЛ-6 - 16±1; ИЛ-2 - 103. 1 - указаны данные для заболевших животных; у мышей без клинических проявлений болезни содержание ИЛ в указанный срок было К.
При инаппарантной инфекции, вызванной вариантом М, на 7 сутки после заражения мы наблюдали присутствие в крови в небольших концентрациях ИЛ-2, ИЛ-6 и -ИФН. При этом все животные были клинически здоровы, вирус из головного мозга не выделялся, и патоморфологическое исследование ЦНС не выявило каких-либо изменений. Наличие в крови ИЛ-2, ИЛ-6 и -ИФН свидетельствует о развитии к 7-м суткам после заражения сбалансированного (Th1 и Th2) иммунного ответа при данном типе инфекции.
Таким образом, инаппарантная форма КЭ, вызванная вариантом М, характеризуется развитием более раннего неспецифического иммунного ответа и развитием сбалансированного специфического иммунного ответа. Острая форма КЭ, вызванная штаммами Абсеттаров и ЭК-328, характеризуется более поздней активацией неспецифического иммунитета и преобладанием выраженного гуморального ответа, которого оказывается недостаточно для предотвращения развития заболевания.
Поведение популяции ВКЭ при смене хозяина.
Как было показано в табл. 1, адаптированный к клещам вариант М образовывал мелкие (<1 мм) бляшки в культуре клеток СПЭВ, при чем на 100 мелких бляшек практически всегда можно было обнаружить 1-2 крупные бляшки. Из популяции варианта М были клонированы крупная и мелкие бляшки (табл. 8) в культуру клеток СПЭВ. После первого же пассажа клоны, которые были взяты при клонировании как мелкая бляшка, приобретали крупнобляшечный или смешанный фенотип. При следующем пассаже в культуре клеток вирус, образующий крупные бляшки, вытеснял мелкобляшечный вариант. Для устранения примеси мелкобляшечного вируса были сделаны дополнительные клонирования. При клонировании отбирали крупные бляшки. Только после 3 клонирований точечные бляшки при титровании перестали появляться. Новые клоны 160/57, 118/58, и 103/84 образовывали в культуре клеток СПЭВ бляшки, похожие на бляшки родительского штамма ЭК-328, которые к 8 дню достигали размера 6-8 мм и продолжали расти в течение всeго периода наблюдения. Клон 116/59 образовывал бляшки диаметром 4-5 мм. В параллельных экспериментах было предпринято клонирование для получения мелкобляшечного вируса. Только в результате четырех клонирований мелких бляшек были получены клоны 424 и 298, которые практически не содержали в популяции крупнобляшечных вариантов.
Оценка свойств вирионов клонов, полученных из популяции варианта М клонированием методом бляшек, показала, что крупнобляшечные клоны восстановили свойства родительского штамма ЭК-328, а мелкобляшечные клоны сохранили характеристики варианта М.
Таблица 8. Характеристика клонов, выделенных из популяции варианта М в культуре клеток СПЭВ
вирус |
Диаметр бляшки до выделения |
Диаметр бляшки, мм на 8 сутки* |
|
клон 57 |
1 мм |
тчк:4:7=(1:1:7) |
|
клон 58 |
1 мм |
7 |
|
клон 59 |
1 мм |
4 |
|
клон 83 |
1 мм |
7:3:тчк=(2:2:1) |
|
клон 84 |
5 мм |
тчк:7 = (2:1) |
|
клон 86 |
5 мм |
7 |
|
ЭК-328 |
7 |
||
вариант М |
тчк:7 = (100:1) |
* - в скобках указано соотношение бляшек разного размера; тчк - точечного размера, т.е. <1мм.
Вирионы клонов 160/57, 118/58, 103/84 и 116/59 обладали ГА, а также образовывали преципитат с АТ в РИЭФ, направленный к катоду (рис. 7). Клоны 424 и 298, подобно варианту М, не обладали ГА и в РИЭФ не образовывали подобной ракеты.
катод
Рисунок 8. Анализ с помощью РИЭФ антигенных структур ВКЭ, накапливающихся в КЖ клеток СПЭВ, инфицированных клонами из популяции варианта М. 1 - клон 118/58, 2 - клон 116/59, 3 - клон 103/84, 4 - клон 160/57, 5 - клон 298
Для клонов, полученных из популяции варианта М и прошедших 3-4 пассажа в культуре клеток СПЭВ, была определена нуклеотидная последовательность генов белка Е, а также фрагментов РНК, включающих позиции, где были выявлены различия между штаммом ЭК-328 и вариантом М. Мелкобляшечный клон 298 сохранил аминокислотные остатки в белке Е, характерные для варианта М (табл.9). Все крупнобляшечные клоны имели треонин в позиции 426, как у штамма Эк-328. Следовательно, эта позиция имеет прямое отношение к реверсии свойств полученных нами клонов.
Таблица 9. Фенотипические и генетические свойства клонов, выделенных из популяции варианта М
вирус |
фено тип |
кол-во клонирований |
19нт 5'НТО |
42нт 5'НТО |
1 prM |
64 E |
122 E |
124 E |
2190 нт E |
426 E |
2362нт E |
52 NS2A |
22 NS4A |
41 NS4A |
|
ЭК-328 |
Э |
a |
c |
A |
K |
E |
K |
c |
T |
t |
K |
S |
R |
||
Вариант M |
M |
g/а |
a |
V |
K |
G |
K |
t |
I |
c |
N |
G |
K |
||
160/57 |
Э |
3 |
а |
а |
V |
K |
G |
E |
t |
T |
c |
N |
G |
K |
|
118/58 |
Э |
3 |
а |
а |
V |
K |
E |
K |
t |
T |
с |
N |
G |
K |
|
116/59 |
Э |
3 |
g |
a |
V |
K |
G |
Q |
t |
T |
с |
N |
G |
K |
|
103/84 |
Э |
1 |
a |
a |
V |
Q |
G |
K |
t |
T |
c |
N |
G |
K |
|
клон 298 |
M |
4 |
g |
a |
V |
K |
G |
K |
t |
I |
c |
N |
G |
K |
|
клон 424 |
M |
4 |
н/о |
н/о |
н/о |
K |
G |
K |
t |
I |
c |
н/о |
н/о |
н/о |
н/о - не оценивали; прописные буквы - аминокислоты, строчные - нуклеотиды
Фенотип: Э - размер бляшек, свойства вирионов, как у штамма ЭК-328; М - размер бляшек, свойства вирионов, как у варианта М
Как говорилось выше, замена в позиции 122 у варианта М приводит к повышению положительного заряда белка Е. У клона 118/58, который, как и штамм Эк-328, образовывал крупные бляшки в культуре клеток СПЭВ и давал преципитат с АТ в РИЭФ, мы наблюдали обратную замену глицина на глютаминовую кислоту. У трех клонов 160/57, 116/59 и 103/84, также обладающих фенотипом штамма ЭК-328, в позиции 122 сохранялся глицин, как у варианта М. Тем не менее, у клона 160/57 появлялась замена лизина на глутаминовую кислоту в позиции 124. У клона 116/59 в той же позиции лизин заменялся на глутамин, а у клона 103/84 аналогичная замена лизина на глутамин появлялась в позиции 64. Эти замены приводят к снижению положительного заряда. Как видно на рис. 3, у крупнобляшечных клонов способность связываться с ГС была даже несколько ниже, чем у штамма ЭК-328. Это свидетельствует о том, что замены в позициях 124 и 64 являются компенсирующими. У всех клонов нуклеотиды в позициях 2190 и 2362 совпадали с таковыми у варианта М, т.е. эти клоны являются истинными ревертантами. Вне зависимости от фенотипа все клоны, полученные из варианта М, имели те же аминокислотные остатки в сигнальной последовательности PrM и в белках NS2a и NS4a, что и вариант М, т.е. эти замены, по-видимому, не имеют прямого отношения к описанному фенотипу. Представленные данные не позволяют сделать однозначного заключения о роли замены в позиции 19 в 5'-НTO в изменении характеристик варианта М, но очевидно, что эта замены не могут определять свойства вирионов этого вируса.
Таким образом, при репродукции варианта М в культуре клеток СПЭВ образуется большой спектр ревертантов с различными компенсирующими заменами. Анализ ревертантов, полученных при выделении клонов из популяции варианта М, показал, что характерный для адаптированного к клещам варианта М фенотип определяется двумя заменами в белке Е в позициях 122 и 426, а также определенную роль может играть замена в позиции 19 5'-НТО.
Для клонов 160/57, 118/58, 116/59, и 103/84 провели оценку нейровирулентности и НИ для мышей линии BALB/c разного возраста (табл. 10). Клоны 118/58 и 116/59 восстановили НИ, однако у клонов 160/57 и 103/84 НИ осталась низкой. Клоны 160/57 и 116/59 имеют разные компенсирующие замены в позиции 124, клон 118/58 является обратным ревертантом, а клон 103/84 имеет компенсирующую замену, как клон 116/59, но в позиции 64. При этом, а.к. замены в других позициях у всех этих клонов одинаковы. Таким образом, отличия в НИ клонов варианта М, обладающих всеми другими фенотипическими признаками, свойственными родительскому штамму ЭК-328, могут быть связаны с конкретной аминокислотной заменой и ее позицией в белке Е, хотя также нельзя полностью исключить связь с заменами в других не изученных нами областях генома. Представленные данные позволяют предположить, что вирулентность вируса может определяться аффинностью связывания вирионов с рецепторами на каких-то определенных клетках, и компенсирующие замены модулируют взаимодействие с этими рецептороми.
Способность высоковирулентных вирусов персистировать в ЦНС была проверена на одном из клонов из популяции варианта М, восстановившим свою НИ. При и/п заражении мышей сублетальной дозой клона 116/59 3 мыши не заболели, а у 2 мышей развились параличи. На 6 неделе они полностью выздоровели. У всех животных, не заболевших и выздоровевших, на фоне иммунодепрессии, вызванной введением ЦФ, развития заболевания не наблюдалось, и инфекционный вирус в мозге не выявлялся. При проверке методом ОТ-ПЦР оказалось, что у всех мышей в мозге присутствует вирусная РНК. Таким образом, учитывая отсутствие клинических признаков заболевания и отдаленные сроки после начала инфекции, можно утверждать, что клон 116/59 в сублетальной дозе вызвал у них персистентную инфекцию.
Таблица 10. Вирулентность клонов варианта М для мышей линии BALB/c разного возраста
Вирус |
Вирулентность для мышей |
|||
Мыши 6 г БОЕ /ЛД50 |
Мыши 12 г БОЕ /ЛД50 |
|||
и/ц |
и/ц |
и/п |
||
ЭК-328 |
2 |
0,5 |
16 |
|
Вариант M |
0,4 |
2,5 |
250000 |
|
клон 160/57 |
8 |
0,3 |
>500 |
|
клон 118/58 |
1,6 |
1,6 |
2,5 |
|
клон 116/59 |
1 |
0,3 |
1 |
|
клон 103/84 |
6,3 |
2 |
>500 |
Таким образом, мы показали, что варианты ВКЭ, обладающие повышенной аффинностью связывания с ГАГ, а также варианты, ревертировавшие по этому свойству как за счет обратной, так и за счет различных компенсирующих замен, могут вызывать все типы инфекций: инаппарантную, острую и персистентную.
Было изучено поведение популяции варианта М в пассажах in vitro и in vivo. Для оценки стабильности популяции варианта М при пассажах в культуре клеток СПЭВ была выбрана схема, предусматривающая пассирование вируса в двух режимах: три независимых линии вели таким образом, что КЖ инфицированных клеток брали для следующего пассажа до наступления ЦПД (24-36 ч после начала инфекции), а 3 линии - после наступления ЦПД (48-72 ч). Для всех линий пассажей 2 раза материал был заморожен между пассированием. Таким образом, было сделано 12 пассажей линий с ЦПД и 20 пассажей для линий без ЦПД. Полученные вирусы были оттитрованы методов бляшек.
Во всех линиях количество крупных бляшек увеличилось уже на первых пассажах до 7-10% и при дальнейшем пассировании колебалось от пассажа к пассажу, но оставалось на данном уровне. Во всех 6 линиях вирус не приобрел способности формировать направленный к катоду преципитат вирионов с АТ в РИЭФ. Для одной из линий, пассированной без выраженного ЦПД, была определена нуклеотидная последовательность в областях генома, где были найдены замены между штаммом ЭК-328 и вариантом М. Только в позиции в 5'НТО у пассированного в культуре клеток СПЭВ вируса наблюдали реверсию к штамму ЭК-328. НИ этого вируса повысилась до 600 БОЕ/ЛД50, однако не достигла уровня, свойственного штамму ЭК-328.
Полученные данные показывают, что в отличие от заражении с низкой множественностью, когда вирус клонировали из бляшки, при пассажах адаптированного к клещам варианта М в культуре клеток СПЭВ без выраженного эффекта "бутылочного горлышка" формируется стабильная гетерогенная популяция с содержанием 7-10% крупнобляшечного варианта.
При пассировании варианта М через мозг юных мышей наблюдали постепенное нарастание количества крупных бляшек. К 12 пассажу соотношение крупных и мелких бляшек было 1:1. Полученный вирус был назван RNm. Вирионы этого вируса нерегулярно образовывали катодный преципитат с АТ в РИЭФ. Секвенирование фрагмента РНК варианта RNm, кодирующего белок Е, показало, что он сохранил нуклеотидную последовательность варианта М (табл.10). Тогда из популяции варианта RNm были выделены 2 крупнобляшечных клона 46 и 48. Вирионы всех клонов вели себя в РИЭФ, как вирионы штамма ЭК-328. При секвенировании генов Е этих клонов было установлено, что все они имели нуклеотидную последовательность, аналогичную таковой родительского штамма ЭК-328, включая нуклеотиды в позициях 2190 и 2362, по которым вариант М отличается от родительского штамма Эк-328. У этих клонов и в позиции 9888 был уридин, как у штамма Эк-328. Аминокислотные замены могут иметь адаптивный характер и ревертировать при изменении селективного воздействия, однако, реверсия трех н.т. замен в разных частях генома крайне маловероятна, и их можно использовать в качестве маркера, позволяющего различить вариант М и штамм ЭК-328. Таким образом, крупнобляшечные клоны, выделенные из популяции варианта М, переадаптированного к мозгу белых мышей, оказались примесью родительского штамма ЭК-328, сохранившейся в популяции варианта М в процессе 17 пассажей через клещей. Это показывает, что ВКЭ может существовать в виде гетерогенной популяции не только при репродукции в клетках млекопитающих, но и в клещах.
В одном из экспериментов взрослые мыши линии BALB/c были и/п инфицированы 10000 БОЕ варианта М. Несколько мышей заболело. На пике болезни у них были взяты кровь и мозг. При титровании сгустка крови и мозговой суспензии методом бляшек была выявлена гетерогенность вирусной популяции. Соотношение крупных и мелких бляшек было примерно 1:1. Их этих популяций были изолированы крупнобляшечные клоны 51, 53 и 56. Вирионы всех клонов вели себя в РИЭФ как вирионы штамма ЭК-328. Секвенирование гена Е показало, что все эти клоны являются истинными ревертантами. Аминокислотные остатки в позициях 122 и 426, были как у штамма ЭК-328, но они сохранили н.т. замены, по которым вариант М отличается от штамма ЭК-328. Это свидетельствует о том, что при репродукции адаптированного к клещам варианта М in vivo изменение структуры популяции может идти за счет появления ревертантов.
Таблица 10. Характеристика ревертантов, появляющихся в популяции варианта М при пассажах in vivo.
вирус |
Характеристика вируса и источник выделения клонов |
Размер бляшек |
РИЭФ* |
замены в гене белка Е |
||||
несиноним. |
синоним. |
|||||||
122 |
426 |
2190 |
2362 |
|||||
Эк-328 |
- |
5-6 |
+ |
Glu |
Thr |
C |
T |
|
вариант M |
- |
<1mm |
- |
Gly |
Ile |
T |
C |
|
RNm |
11 пассажей вариантаМ через мозг мышей |
5mm:<1mm=1:1 |
+/- |
Gly |
Ile |
T |
C |
|
Клон 46 |
RNm |
5 |
+ |
Glu |
Thr |
C |
T |
|
Клон 48 |
RNm |
5 |
+ |
Glu |
Thr |
C |
T |
|
Клон 51 |
Кровь от заболевшей мыши после и/п введения варианта М |
5 |
+ |
Glu |
Thr |
T |
C |
|
Клон 53 |
мозг от заболевшей мыши после и/п введения варианта М |
5 |
+ |
Glu |
Thr |
T |
C |
|
Клон 56 |
мозг от заболевшей мыши после и/п введения варианта М |
5 |
+ |
Glu |
Thr |
T |
C |
*- + - наличие катодного преципитата вирионов с АТ, - отсутствие катодного преципитата вирионов
Далее мы попытались оценить влияние данных вирусов друг на друга при одновременной репродукции. Для этого клетки СПЭВ были инфицированы раздельно и смесью вирусов, взятых в разных соотношениях. Полученное потомство оценивали по соотношению крупных и мелких бляшек при титровании в культуре клеток СПЭВ, а также по его поведению в РИЭФ. Очевидно, что такой эксперимент может дать только приблизительные данные о соотношении вирусов с разными фенотипами в популяции. Тем не менее, было поставлено 3 подобных эксперимента, и во всех были получены сходные результаты. Данные одного из этих экспериментах приведены в табл. 11. При равном количестве штамма Эк-328 и варианта М в инокуляте при средней множественности заражения вирусы с разным фенотипом не мешают репродукции друг друга, а при низкой множественности титры варианта М даже увеличиваются. При этом при определенных соотношениях вирусов в инокуляте вариант М может снижать титры штамма Эк-328 и наоборот.
Необходимы тщательные исследования по изучению взаимодействия описанных вирусов при смешанной инфекции на генетическом уровне, а также изучение механизмов описанной интерференции и комплементации. Тем не менее, этот эксперимент и результаты обратных пассажей адаптированного к клещам варианта М показывают, что в клетках млекопитающих ВКЭ может длительно существовать в виде стабильной гетерогенной популяции, в которой присутствует как варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции в клетках млекопитающих, так и варианты, имеющие преимущества при репродукции в членистоногих.
При выделении мелкобляшечных клонов из популяции варианта М, т.е. при создании эффекта «бутылочного горлышка», в результате 1 пассажа в культуре клеток мы получили целый набор ревертантов с обратными и различными компенсирующими мутациями. Это свидетельствует о том, что образование мутантов является при определенных условиях частым событием при репродукции ВКЭ. Нельзя исключить, что подобные мутанты в следовых количествах могут возникать и длительно существовать в любой популяции, тем не менее, за счет интерференции основной популяции они так и остаются в следовых количествах. При клонировании селективное давление основной популяции снижается, и это приводит к резкому изменению структуры популяции с преобладанием более приспособленного к данным условиям варианта вируса.
Очевидным является вопрос. Если адаптация ВКЭ к клещам приводит к появлению таких мутантов с ГАГ-связывающим фенотипом, то подобные вирусы должны постоянно выявляться в клещах. Естественно нельзя ожидать, что все изоляты ВКЭ, выделенные из клещей, должны обладать таким фенотипом, поскольку неизвестно, на какой стадии адаптации в клещам находится этот вирус и как быстро такой вариант может отбираться в клещах в природных условиях, поскольку ВКЭ может длительное время циркулировать в популяции клещей без попадания в млекопитающих на счет трансфазовой или трансовариальной передачи.
Таблица 11. Характеристика вирусного потомства при смешанной инфекции клеток СПЭВ вариантом М и штаммом Эк-328 , взятых в разных соотношениях
Инокулят-множественность заражения (БОЕ/клетку) |
Вирусное потомство |
||||||
Общая |
Эк-328 |
М вариант |
Титр вируса lgБОЕ/мл |
РИЭФ*** |
|||
общий |
Эк-328* |
вариантМ** |
|||||
1,000 |
1,000 |
- |
7,6 |
7,6 |
- |
+ |
|
0,100 |
0,100 |
- |
7,3 |
7,3 |
- |
+ |
|
1,000 |
- |
1,000 |
6,7 |
-**** |
6,7 |
- |
|
0,100 |
- |
0,100 |
6,7 |
-**** |
6,7 |
- |
|
0,010 |
- |
0,010 |
6,7 |
-**** |
6,7 |
- |
|
1,000 |
0,500 |
0,500 |
7,1 |
7,1 |
6,7 |
+ |
|
0,550 |
0,500 |
0,050 |
7,1 |
7,1 |
5,5 |
+ |
|
0,550 |
0,505 |
0,005 |
6,3 |
6,3 |
- |
+ |
|
0,550 |
0,050 |
0,500 |
6,7 |
6,0 |
6,7 |
- |
|
0,100 |
0,050 |
0,050 |
7,1 |
7,1 |
8,5 |
- |
* - оценивали по количеству крупных бляшек; ** - оценивали по количеству точечных бляшек; *** - + - наличие катодного преципитата вирионов, - отсутствие катодного преципитата вирионов. В предварительных экспериментах было показано, что вирионы штамма ЭК-328, полученные при концентрировании КЖ, содержащей 6lgPFU, образуют катодный преципитат с АТ в РИЭФ. **** - как отмечалось ранее, так и данном эксперименте, при титровании варианта М иногда на фоне большого количества точечных бляшек можно было выявить 1-2 крупные бляшки.
Из клещей, собранных в разных регионах России, часто выделяют вирусы с мелкобляшечным фенотипом. Нами были просмотрено более 100 вируссодержащих клещевых суспензий, выделенных в разных регионах РФ. Более половины имели мелкобляшечный фенотип или представляли собой смешанную популяцию, которая в процессе лабораторных пассажей через мозг белых мышей или в культуре клеток СПЭВ превращались в вирусы с крупными бляшками (Карганова, 1991; Погодина и др., 1991; Карганова и др., 1992, 1994; неопубликованные данные). Часть из них были изучены подробнее, и было показано, что их свойства близки свойствам варианта М, в том числе у этих вирусов отсутствует ГА, вирионы не образуют преципитаты с АТ в РИЭФ. Естественно, нужны специальные исследования, чтобы установить, что представляют собой изоляты ВКЭ из клещей с мелкобляшечным фенотипом, связана ли мелкая бляшка с особенностями связывания вирионов в ГАГ клетками, и какую роль в их возникновении играет длительность пребывания в клещах. Тем не менее, очевидно, что в природной популяции в клещах циркулируют вирусы, обладающие фенотипом, близким адаптированному в лабораторных условиях к клещам варианту М, который представлен в данной работе.
Полученные данные относятся к лабораторной модели, которая не может быть просто экстраполирована на природную популяцию вируса КЭ. Тем не менее, описанный нами полиморфизм популяции вируса КЭ позволяет объяснить его способность к быстрой адаптации к новому хозяину. Схематично это можно объяснить следующим образом. Быстрое размножение вируса в новом хозяине осуществляется за счет активной репродукции либо уже присутствующих в популяции, либо вновь возникших мутантов, приспособленных к репродукции именно в этом виде хозяина. При этом основная популяция не может подавлять репродукцию этих мутантов, т.к. новый хозяин является для нее непермиссивной системой. При этом, по-видимому, наиболее неожиданные мутанты могут быть получены при репродукции вируса в совершенно новом хозяине, с которым этот вирус еще не встречался. Представленные нами данные показывают, что важную роль в этом играют мутации, определяющие начальные этапы взаимодействия вируса КЭ с клетками. Вероятно, определенное значение могут иметь и мутации, определяющие наиболее эффективное взаимодействие вирусной РНК и белков и клеточных факторов, формирующих репликативный комплекс, или участвующих в подавлении защитных средств клетки, в первую очередь, индукцию ИФН или ИФН сигнальные пути.
ВЫВОДЫ
Адаптация штамма ЭК-328 к клещам Hyalomma marginatum marginatum сопровождается набором несинонимических замен в геноме: нуклеотидными заменами в 5'-НТО, аминокислотными заменами в сигнальной последовательности белка prM, в области белков Е, NS2A, NS4A. Замены в белке Е Glu122Gly и Thr426Ile определяют основные свойства адаптированного к клещам варианта М, отличающие его от адаптированного к мышам родительского штамма ЭК-328.
ВКЭ имеет два типа рецепторов на поверхности клеток млекопитающих: высокоаффинный и низкоаффинный. Адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами на поверхности клетки, которые служат низкоаффинным рецептором для этого вируса.
При репродукции в клетках млекопитающих вариант ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом восстанавливает способность к низкоаффинному связыванию с ГАГ клеток за счет появления обратных и компенсирующих замен. Свойства ревертантов зависят от характера и расположения компенсирующих замен в белке Е.
Получена модель инаппарантной формы КЭ при периферическом заражении мышей линии BALB/c адаптированным к клещам вариантом М, которая характеризуется формированием длительного протективного иммунитета без выраженного синтеза антител к основному вирусному гликопротеину Е. Особенности инаппарантной инфекции определяются быстрым удалением вируса из кровотока за счет повышенной сорбции вирионов на клетках крови, ранней активации неспецифического иммунитета, а также активацией Th1-лимфоцитов.
На экспериментальной модели показано, что ВКЭ может существовать в виде гетерогенной популяции, содержащей варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции либо в клещах, либо в млекопитающих. Переадаптация к млекопитающим адаптированного к клещам вируса происходит за счет изменения соотношения этих вариантов в популяции, а также за счет появления новых мутантов с более высокой приспособленностью к репродукции в данной системе.
Скорость изменения генетической структуры популяции ВКЭ и разнообразие мутантов определяется характеристикой хозяина и наличием эффекта "бутылочного горлышка".
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Тимофеев А.В., Карганова Г.Г., Мальдов Д.Г., Лашкевич В.А., Эльберт Л.Б. Обнаружение возможного рецептора для клещевого энцефалита с помощью антиидиотипических антител. //ДАН СССР. - 1990.-т. 315(1).- С. 226-228.
2. Дживанян Т.И., Карганова Г.Г., Соболев С.Г., Королев М.Б., Каштанова Г.М., Чупринская М.В., Лашкевич В.А. Свойства частиц, формирующихся при воспроизведении острой инфекции адаптированного к клещам H.plumbeum вируса клещевого энцефалита. //Вопр. вирусол.-1991.- № 4.- С.297-300.
3. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Дживанян Т.И., Левина Л.С., Карганова Г.Г., Рясова Р.А., Сергеева В.А., Лашкевич В.А. Явление антигенной дефектности у циркулирующих в природе штаммов вируса клещевого энцефалита и его возможная связь с серонегативными формами заболевания. //Вопр. вирусол.- 1992.- №2.- С.103-107.
4. Maldov D.G., Karganova G.G., Timofeev A.V. Tick-borne encephalitis virus interaction with the target cells. //Arch. Virology.- 1992.- Vol.127.- P.321-325.
5. Васильев В.В., Злобин В.И., Дживанян Т.И., Карганова Г.Г., Верхозина М.М., Воронко И.В., Гусарова Н.А., Лашкевич В.А. Изучение электрофоретической подвижности вирусспецифических белков штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в различных регионах СНГ. Вопр. вирусол.-1993.- №1-С.11-16.
6. Дрокин Д.А., Злобин В.И., Карганова Г.Г., Вихорева Т.В., Якименко В.В., Дживанян Т.И., Лашкевич В.А. Изменение геномов штаммов вируса клещевого энцефалита в результате пассажей на мышах. //Вопр. вирусол.-1994.-№1.-С. 160-162.
7. Мальдов Д.Г., Гмыль Л.В., Карганова Г.Г. Изменение активности Na+,K+-АТФазы при репродукции вируса клещевого энцефалита в культуре клеток СПЭВ. //Вопр. Вирусол.-1997.-№1-С. 23-26.
8. A.V.Timofeev, S.G.Ozherelkov, A.V.Pronin, A.V.Deeva, G.G.Karganova, L.B.Elbert and J.R.Stephenson. Immunological basis for protection in a murine model of tick-borne encephalitis by a recombinant adenovirus carrying the gene encoding the NS1 non-structural protein. //J. Gen. Virol.-1998.-Vol.79.- P. 689-695.
9. Тимофеев А.В., Кондратьева Я.Ю., Карганова Г.Г., Стефенсон Дж. Протективная активность бактериальной плазмиды, несущей ген неструктурного белка NS1 вируса клещевого энцефалита. //Вопр. Вирусол.- 2001.- № 1.-С.22-24.
10. Тимофеев А.В., Кондратьева Я.Ю., Орловский В.Г., Локтев В.Б., Карганова Г.Г. Изучение корреляции тяжести течения заболевания клещевым энцефалитом и концентрацией интерлейкинов 2 и 6 в сыворотках больных клещевым энцефалитом. //Терапевтический архив.-2002.-№ 6.-С.22-23.
11. Романова Л.Ю., Козловская Л.И., Шевцова А.С., Карганова Г.Г. Метод доказательства отсутствия РНК вируса клещевого энцефалита в биопробах.// Вопр. вирусол.- 2006.- №1.- С.38-41.
12. Романова Л.Ю., Гмыль Л.В., Локтев В.Б., Протопова Е.В., Дживанян Т.И., Лашкевич В.А., Карганова Г.Г. Изменение антигенной структуры поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам и млекопитающим. //Вопр. вирусол.- 2006.- №6.- С.31-34.
13. Romanova L.I., Gmyl A.P., Dzhivanian T.I., Bakhmutov D.N., Lukashev A.N., Gmyl L.V., Rumyantsev A.A., Burenkova L.A., Lashkevich V.A., Karganova G.G. Microevolution of Tick-Borne Encephalitis virus (TBEV) in course of host alternation. //Virology.-2007.-Vol.362(1).-P.75-84.
14. Лашкевич В.А., Карганова Г.Г. Современные аспекты профилактики клещевого энцефалита. //Вопр. вирусол.- 2007.- №5.- С.31-32.
Монография
1. A.V.Timofeev, G.G.Karganova. Tick-borne encephalitis vaccine: from past to future.- 2003.-СПП.- Москва, РФ.-Стр. 44.
Санитарные правила
1. Санитарно-эпидемиологические правила 3.1.3.2352-07 «Профилактика клещевого вирусного энцефалита»
Научные статьи, опубликованные в сборниках:
Карганова Г.Г., Дживанян Т.И., Терешкина Н.В., Гмыль Л.В., Антыкова Л.П., Лашкевич В.А. Изменение патогенетических и иммуногенных характеристик вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам и млекопитающим./"Актуальные проблемы природноочаговых инфекций". Сборник материалов II республиканской научно-практической конференции, посвященной 75-летию инфекционной службы Удмуртии.-1998.-Ижевск. С.167-169.
Kарганова Г.Г. Emerging потенциал переносимых клещами флавивирусов млекопитающих./"Эпидемиологическая обстановка и стратегия борьбы с клещевым энцефалитом на современном этапе". Материалы расширенного пленума проблемной комиссии "Клещевой и другие вирусные энцефалиты" РАМН.-2003.-Москва-С. 16-17.
Кондратьева Я.Ю., Локтев В.Б., Орловский В.Г., Куржуков Г.П., Тимофеев А.В., Карганова Г.Г. Обнаружение антител к белкам E, NS1, NS3 и NS5 вируса клещевого энцефалита в сыворотках крови больных КЭ./"Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней". Материалы Всероссийской научно-практической конференции.-2004.-Самара.- Т.2.-С.219-221.
Романова Л.Ю., Бахмутов Д.В., Дживанян Т.И., Гмыль Л.В., Румянцев А.А., Лукашев А.Н., Гмыль А.П., Карганова Г.Г. Молекулярные основы изменения фенотипических характеристик вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам и млекопитающим./"Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней". Материалы Всероссийской научно-практической конференции.-2004.-Самара.-Т.2.-С.225-229.
Романова Л.Ю., Козловская Л.И., Дживанян Т.и., Гмыль Л.В., Румянцев А.А., Лукашев А.Н., Гмыль А.П., Карганова Г.Г. Молекулярные основы аттенуации вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам. Окружающая среда и здоровье". Материалы всероссийской научно-практической конференции.-2005.- Суздаль.-С.182-185.
Г.Г.Карганова, А.П.Гмыль, Л.Ю.Романова, Л.В.Гмыль. Особенности эволюции переносимых клещами арбовирусов./«Арбовирусы и арбовирусные инфекции». Материалы расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции».- 2006.-Астрахань.- С.30-35.
Л.Ю.Романова, Л.И.Козловская, Ю.В. Рогова, Т.И.Дживанян, А.П.Гмыль, Г.Г.Карганова. Стабильность популяции адаптированного к клещам варианта вируса клещевого энцефалита с повышенной сорбцией на клеточных гликозаминогликанах при пассажах в культуре клеток СПЭВ./«Медицинская вирусология».Труды ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН.-2007.-Москва.-Т.24.- С.73-79.
А.С.Шевцова, Ю.И.Рогова, Л.Ю.Романова, Я.Ю.Кондратьева, Г.Г.Карганова. Различия в характере взаимодействия с интерфероновой системой клетки, выявленные у двух близкородственных вариантов вируса клещевого энцефалита./Труды ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН «Медицинская вирусология».-2007.-Москва.-Т.24.-С.89-96.
Л.Ю.Романова, Л.И.Козловская, Г.Г.Карганова. Взаимодействие вирионов с клеточными гепарансульфат гликозаминогликанами и нейроинвазивность вируса клещевого энцефалита./ «Медицинская вирусология».Труды ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН.- 2007.-Москва.-Т.24.-С.273-279.
Г.Г.Карганова. Клещ как фактор микроэволюции вируса клещевого энцефалита./«Паразитология в ХХI веке - проблемы, методы, решения». Материалы IV Всероссийского съезда паразитологического общества при РАН.-2008.-С.-Петербург.-Т.2.-С. 23-27.
Размещено на Allbest.ur
Подобные документы
Пути и механизмы регуляции иммунитета с помощью нейромедиаторов, нейропептидов и гормонов. Парасимпатический отдел вегетативной нервной системы и регуляция иммунного ответа. Механизмы регуляции иммунного ответа соматотропином и опиоидными пептидами.
презентация [243,2 K], добавлен 02.12.2016Из каких отделов состоит тело ракообразных. Сколько ходильных ног у рака расположено на головогруди. Чем покрыто тело ракообразных. Почему рак линяет. Сходства и отличия ракообразных и паукообразных. Меры специфической профилактики клещевого энцефалита.
презентация [1,0 M], добавлен 01.04.2014Особенности поведения и опасность клещей. Правила поведения в случае обнаружения укуса клеща, первая помощь, последствия, способы защиты от нападения. Что такое клещевой энцефалит, формы протекания заболевания, типы вируса, профилактика энцефалита.
реферат [710,7 K], добавлен 20.04.2010Отрицательная роль вирусов в жизни человека как возбудителей ряда опасных заболеваний: оспы, гепатита, энцефалита, краснухи, кори, бешенства, гриппа. "Индикаторы жизни": происхождение и природа вирусов, их строение. Взаимодействие вируса с клеткой.
реферат [164,7 K], добавлен 01.04.2009Исследование понятия и основных особенностей ДНК-геномных вирусов. Изучение жизненного цикла вируса. Характеристика вируса папилломы человека. Описание болезней, вызываемых вирусом папилломы человека. Лабораторная диагностика папилломавирусной инфекции.
реферат [94,2 K], добавлен 17.03.2014Латенция и вирогения как типы взаимодействия вируса с клеткой. Процесс адсорбции вируса и его проникновения в клетку, синтез вирусных белков. Этапы созревания дочерних вирусных частиц, способы их выхода из клетки, общие принципы сборки вирионов.
реферат [18,6 K], добавлен 29.09.2009Свойства вирусов, особенности их строения и классификация. Взаимодействие вируса с клеткой. Процессы, связанные с размножением вируса. Описание основных вирусных заболеваний. Эволюция вирусов на современном этапе. Влияние загрязнения внешней среды.
реферат [466,4 K], добавлен 24.03.2011Основные этапы и общая схема клеточного иммунного ответа. Презентация процессированного антигена. Активация Т-хелпера первого типа. Схема взаимодействия клеток в ходе клеточного иммунного ответа (по А.А. Воробьеву). Дефрагментация ДНК при апоптозе.
реферат [1,6 M], добавлен 01.11.2012Вирус иммунодефицита человека — ретровирус из рода лентивирусов, вызывающий медленно прогрессирующее заболевание — ВИЧ-инфекцию. Схематическое строение вируса. Проникновение ВИЧ в клетку человека. Транспорт вирусной ДНК в ядро и интеграция в геном.
презентация [20,6 M], добавлен 03.05.2017Исследование свойств, функций и механизма действия цитокинов, гормоноподобных медиаторов межклеточного взаимодействия. Аутокринно-паракринная регуляция иммунного ответа. Характеристика цитокиновой сети воспалительного ответа. Факторы некроза опухоли.
презентация [1,9 M], добавлен 27.05.2014