Анализ системы экспрессии основных компонентов теломеразного комплекса человека

кДНК hTERT вставляли в вектор LeGO-iG2 [163], которую предварительно обработали эндонуклеазами рестрикции EcoRI и NotI. Полученную плазмиду обработали эндонуклеазами рестрикции Kpn2I и NotI, затем обработали Т4-

ДНК полимеразой. Далее полученную плазмиду лигировали, затем еще раз обработали эндонуклеазой рестрикции MfeI и перелигировали. кДНК hTERT получили обработкой вектора pGRN145 (Geron) эндонуклеазами рестрикции

EcoRI и NotI. Лигирование проводили с помощью набора реагентов Rapid DNA Ligation Kit компании Thermo Scientific по методике производителя.

Детальное описание ПЦР, получения продуктов обработки эндонуклеазами рестрикции, разделение фрагментов и их выделение, и другие необходимые процедуры представлены ниже.

После проведения ПЦР в смесь добавляли 10мкл 6х LА раствора, проводили разделение фрагментов ДНК в 0,8-1% агарозном геле. При необходимости проводили ПЦР с колонии клеток E. coli. Для этого 20 мкл ночной культуры, полученный из колонии клеток, центрифугировали при максимальной скорости на настольной центрифуге 1мин. Осадок подвергали ПЦР. Параметры ПЦР оставались такие же.

Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле

Для приготовления агарозного геля добавляли 0,8-1,0 г легкоплавкой агарозы к 100 мл раствора 1xTBE (табл.2). Раствор прогревали в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Полученный раствор охлаждали до ~ 40-60?С, добавляли 5 мкл водного раствора бромистого этидия 1 мг/мл, перемешивали, выливали в плашку. После застывания геля вносили образцы в ячейки и проводили электрофорез при напряжений тока ~ 100-150 В.

Разделение фрагментов ДНК контролировали с помощью камеры с УФ лампой.

Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили с помощью набора реагентов для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля фирмы

Thermo Scientific (GeneJET Gel Extraction Kit) согласно протоколу с использованием фирменных реагентов. Полоску агарозного геля массой ~ 0.1-

0.3 мг, содержавшую нужный фрагмент ДНК, растворяли в 0.1-0.3 мл буферного раствора Binding buffer (GeneJET Gel Extraction Kit) при 50?С до полного растворения геля. Перемешивали переворачиванием, пропускали через колонку для выделения ДНК. Промывали колонку 700 мкл буферного раствора

Wash buffer (GeneJET Gel Extraction Kit), элюировали ДНК 25 мкл воды mQ.

Концентрацию ДНК определяли по поглощению при 260 нм.

Приготовление векторов и вставок

Составляли следующую реакционную смесь:
ДНК (плазмидная или ПЦР-фрагмент)	3	мкг
10х буферный раствор для эндонуклеазы рестрикции
(каталог фирмы MBI Fermentas)	2	мкл
эндонуклеаза рестрикции 1	10 ед
эндонуклеаза рестрикции 2	0 или 10 ед
Н2О	до 20 мкл

Полученную смесь инкубировали при 37?С в течение 2-4 ч. Добавляли 2 мкл LA раствора, наносили на агарозный гель и приводили разделение фрагментов ДНК. ДНК-фрагмент нужной длины вырезали из геля и выделяли с помощью набора реагентов для выделения ДНК из агарозного геля (Thermo Scientific). При обработке двумя эндонуклеазами рестрикции KpnI и SalI, использовали последовательную обработку. Для этого после инкубации плазмиды или вставки эндонуклеазой рестрикции KpnI, дополнительно добавляли 2мкл 10x ДKpnI-SalI буферный р-р и 10 ед. эндонуклеазы рестрикции SalI, и смесь инкубировали при 37?С еще 2-4 ч.

Приготовление компетентных клеток E. coli

Свежую колонию клеток E. сoli штамма JM109 помещали в 5 мл среды

LB (табл.2) и инкубировали при 37?С ночь. 1мл ночной культуры добавлялось в 300мл LB и инкубировалось при температуре 16?С при перемешивании (200 об/мин) до оптической плотности А600 ~ 0,5. Культуру клеток выдерживали в течение 10 мин во льду, переносили в предварительно охлажденные центрифужные пробирки и осаждали центрифугированием в предварительно охлажденном роторе JA 14 при 5000 об/мин, 4?С в течение 10 мин. Супернатант сливали и ресуспендировали осадок в 100 мл охлажденного до 4?С буферного раствора ТВ (табл.2). Суспензию клеток инкубировали при помешивании при 0?С 10 мин. Клетки осаждали центрифугированием в роторе JA 14 при 5000 об/мин, 4?С 10 мин, промывали 100 мл охлажденным буферным раствором ТВ (табл.2), инкубировали при 0?С 10 мин и осаждали центрифугированием.

Клетки ресуспендировали в 20 мл буферного раствора ТВ, добавляли 1,4 мл ДМСО (до 7%) и инкубировали 10 мин при 0?С. Суспензию клеток переносили по 100 мкл в 1,5 мл предварительно охлажденные стерильные пробирки и быстро замораживали в жидком азоте. Клетки хранили при температуре -70?С.

Трансформация компетентных клеток E. coli

Пробирку с компетентными клетками размораживали во льду, добавляли 1-5 мкл раствора плазмидной ДНК (~ 0,1 мкг) в дистиллированной воде, инкубировали 30 мин при 0?С. Затем прогревали смесь на водяной бане в течение 40-50 сек при 42?С, охлаждали до 0?С, добавляли 800 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37?С. Аликвоту 10-20 мкл трансформационной смеси высевали на чашку Петри с твердой средой LB, содержавшей соответствующие антибиотики. Инкубировали чашку при 37?С в течение 16 часов.

Выделение плазмидной ДНК для клонирования.

Выделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора реагентов для выделения плазмидной ДНК GeneJET Plasmid Miniprep Kit фирмы Thermo Scientific согласно протоколу с использованием фирменных растворов.

Колонию клеток штамма E. coli, несущую определенную плазмиду, помещали в 5 мл среды LB, содержавшей соответствующий антибиотик, и инкубировали при перемешивании в течение 16 ч на 37?С. Клетки осаждали центрифугированием при 7000 об/мин 5 мин, ресуспендировали в 250 мкл раствора Resuspension buffer (GeneJET Plasmid Miniprep Kit), добавляли 250 мкл раствора Lysis buffer (GeneJET Plasmid Miniprep Kit), перемешивали до образования вязкого раствора. К полученному раствору добавляли 350 мкл раствора Neutralization solution (GeneJET Plasmid Miniprep Kit), перемешивали до появления белых хлопьев. Суспензию осаждали центрифугированием при

14000 об/мин 5 мин, отбирали супернатант и пропускали его через колонку для выде ления ДНК (GeneJET Plasmid Miniprep Kit), промывали эту колонку 500 мкл буферного раствора Wash buffer, затем повторили промывку. Элюировали с колонки ДНК 50 мкл водой mQ.

3.6 Выделение плазмидной ДНК для трансфекции в эукориотические клетки

Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток проводили с использованием набора реагентов для выделения плазмидной ДНК фирмы

Thermo Scientific (GeneJET Plasmid Miniprep Kit). Колонию клеток E. Coli трансформированных плазмидой описанной выше в разделе 3.2.7, помещали в

100 мл среды LB, содержавшей соответствующий антибиотик, и инкубировали при перемешивании в ночь на 37?С. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин 10 мин, ресуспендировали в 1 мл Resuspension buffer (GeneJET Plasmid Miniprep Kit) и инкубировали при комн. темп. 15мин. Далее добавляли

2 мл Lysis buffer (GeneJET Plasmid Miniprep Kit), перемешивали до образования вязкого раствора и инкубировали 5-10 мин во льду. К полученному раствору добавляли 1,5 мл Neutralization solution (GeneJET Plasmid Miniprep Kit), перемешивали до появления белых хлопьев. Суспензию осаждали центрифугированием при 18000 об/мин 20 мин при 10?С. К супернатанту добавили 2,7 мл изопропанола, перемешали и инкубировали 20мин при комн. температуре. Далее осадок осаждали центрифугированием при 18000 об/мин, 30 мин при 20?С. Осадок промывали 70% этанолом, высушили и растворили в 1 мл воды mQ.

Для очистки плазмид от эндотоксинов для последующей трансфекции в эукориотические клетки использовали экстракцию эндотоксинов реагентом

Triton X-114 [172,173]. К 1мл раствору плазмиды добавили 110 мкл 3 М NaOAc с pH 5.5. Далее проводили экстракцию, для этого добавили 20 мкл Triton X-114 и проинкубировали во льду с периодическим перемешиванием до полного растворения Triton X-114. Далее раствор проинкубировали при 55?С, 5мин.

Водную фазу отделяли центрифугированием на настольной центрифуге при максимальной скорости и комн. температуре 5мин. Верхнюю водную фазу переносили в другую пробирку и повторяли экстракцию 3-4 раза. При экстракции необходимо использовать 1,5 мл пробирки с узким дном. После экстракции, плазмиду осаждали изопропанолом чтобы избавиться от остатков Triton X-114. Для этого к оставшемуся раствору добавили 0,7 объемов изопропанола, смешали и проинкубировали 20 мин при комн. температуре.

3.7 Трансфекция плазмид в эукориотические клетки и обработка клеток вальпроевой кислотой (ВПА)

Трансфекцию проводили в 24-луночных плашках для культивирования клеток. Для этого смесь плазмид массой 0,5 мкг экспрессирующих hTERT и hTR, в массовом отношении 1:10 соответственно, разбавляли средой Opti-MEM®I Medium до объёма 25мкл. Далее разбавленная смесь плазмид смешивали с равным объемом Lipofectamine 2000, разбавленного в 25 раз средой Opti-MEM®I Medium. Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре 15 мин и добавили в HEK293E или HEK293T клетки, которых предварительно посеяли в 24-луночной плашке и проинкубировали один день в среде DMEM при 37?С, 5% СО2, во влажном воздухе.

Препарат Конвулекс разбавили средой ДМЕМ в 10 раз, в результате получили 200мМ раствор вальпроевой кислоты (ВПА). 2,5мкл 200мМ раствора ВПА добавили в среду с трансфецированными клетками.

Инкубацию клеток трансфецированных плазмидами и/или обработанными ВПА продолжили еще 2 дня. После этого клетки промывали 1x PBS буфером, ресуспендировали в 0,2мл CHAPs буфере и инкубировали 30 мин во льду.

Затем полученный лизат центрифугировали при 16000g, 30 мин, 4єС.

Полученный раствор использовали для анализа количества теломеразы в клетке (определяли уровень hTR и теломеразную активность).

3.8 Экспрессия и очистка теломеразы

Для экспрессии теломеразы клеточную линию HEK293E выращивали в среде ДМЕМ при 37?С, 5% СО2 и трансфецировали плазмидами p-DS-SFFV-hTERT и pBluescript-DS-U1-hTR. Для этого HEK293E клетки в 10см чашке петри трансфецировали 22 мг плазмидами и Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Для этого смесь плазмид массовом отношении 1:10 соответственно (2 мкг p-DS-SFFV-hTERT and 20 мкг pBluescript-DS-U1-hTR) разбавляли средой Opti-MEM®I Medium до объёма 1,5 мл. Далее разбавленная смесь плазмид смешивали с равным объемом Lipofectamine 2000, разбавленного в 26 раз средой Opti-MEM®I Medium. Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре 15 мин и добавили в HEK293E клетки в 10 см чашке. После 2-х дней инкубации после трансфекции, клетки пересевали в T150 матрац и инкубировали еще 2 дня. Инкубацию проводили в среде DMEM при 37?С, 5% СО2, во влажном воздухе.

После этого клетки промывали 1x PBS буфером, ресуспендировали в 10мл

CHAPs буфере и инкубировали 30 мин во льду. Затем лизат центрифугировали при 16000g, 30мин, 4єС. Затем 5мл аликвоты полученного S16 экстракта центрифугировали при 100000g, 45мин, 4єС через 1мл CHAPs буфера содержащий 20% глицерин. Для этого S16 экстракт наслаивали перед центрифугированием на содержащий глицерин CHAPs буфер. Центрифужную пробирку предварительно обработали раствором 6 мг/мл BSA в течение 2-х часов. Полученный супернатант наносили на поверхность CHAPs буфера, содержащего 20% глицерин. Затем препарат центрифугировали при 210000g, 2 часа, MLA-80 ротор,4єС в (Optima MAX-XP Ulracentifugaion, Beckman Coulter).

Осадок растворяли в 1мл ТРАП 1х буфере, содержащим 10% глицерина.

Полученный препарат аликвотили по 10-40 мкл и быстро заморозили в жидком азоте. Хранили при температуре -80єС.

3.9 Метод измерения ингибирования теломеразы in vitro (RQ-ТРАП)

Количественный RQ-ТРАП с разбавлением проводили в два этапа. На первом этапе к 5 мкл очищенной теломеразы (предварительно в 50 раз разбавленный препарат, полученный после выделения в 1х ТРАП буфере) добавили 5мкл исследуемого ингибитора в том же буфере. Смесь инкубировали

10мин при комнатной температуре, далее добавляли 5мкл mix1. Реакционную смесь инкубировали при 30єС, 30мин и инактивировали нагреванием на 80єС, 10мин. Затем 150 мкл ТРАП буфера добавляли для разбавления смеси. На втором этапе проводили ПЦР реакцию в объёме 10мкл смеси, содержащей 5мкл mix2 и 5 мкл разбавленного раствора, полученного на первом этапе.

Приготовление ПЦР смеси проводили при 0°С. Смесь mix2 готовили в больших количествах во льду, аликвотили и хранили при -80°С. При каждом измерении использовали новую аликвоту. Амплификацию проводили в 384-луночных ПЦР плашках на приборе CFX-384 Real-Time System, C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad), за 30 циклов с этапами 30 сек при 95єC, 30 сек при 60єC и 60 сек при

72 єC. Измерение флуоресценции SYBR Green проводили на шаге 60 єC.

Определение Ct величины проводили автоматически программой Bio-Rad CFX Manager (версия 1.6.541.1028) с использованием «пороговой линии». Все расчеты, нелинейные аппроксимации и построение графиков проводили программой Graph-Pad prism. Для проверки влияния на ПЦР, ингибиторы теломеразы добавляли как до теломеразной реакции, так и после. Все измерения проводились по три раза. Также каждое измерение по крайней мере еще раз повторяли в другие дни.

Для определения линейности сигнала ПЦР в реальном времени от активности теломеразы, при каждом эксперименте использовали 2-х кратное последовательное разбавление очищенной теломеразы. Для получения стандартной кривой, необходимой для количественных расчетов, при каждом эксперименте использовали 10-ти кратное последовательное разбавление TSR8 олигонуклеотида. Исследуемые олигонуклеотиды использовали в интервале концентрации 0.01нM-10мкM.

3.10 Прямой метод измерения теломеразной активности

20мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл 10х теломеразного буфера, 2 мкл очищенной теломеразы, 40 мкM dATP, 80 мкM dTTP, 2 мкM dGTP, 20 мкCi [?32P]-dGTP (3,000 Ci/ммоль) и 35 нM 5'-биотинилированный теломерный праймер b-HuG3, а так же исследуемое на ингибирование активности теломеразы вещество инкубировали 45 мин при 30єС. Реакцию остановливали добавлением ЭДТА, до конечной концентрации в смеси 25 мM. Следовые количества 5'радиоактивно меченного праймера содержащего биотин на 3'- конце 15bpLC добавляли в реакционную смесь в качестве конроля нанесения и внутреннего стандарта. Не прореагировавший радиоактивный нуклеотидтрифосфат удаляли из реакционной смеси с помощью 5мкл стрептавидиновых магнитных шариков (Dynal), которые предварительно промывали 2х BW буфером и ресуспендировали в 20 мкл этого же буфера.

Инкубацию взаимодействия биотинилированных праймеров с стрептавидиновыми магнитными шариками проводили в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем магнитные шарики промывали два раза 1х BW

буфером и один раз TE буфером. Затем промытые магнитные шарики ресуспендировали в 10мкл формамидной краски, нагреты до 95єС 5мин. 4мкл аликвоты образца наносили на 10% денатурирующий полиакриламидный гель. Разделенные фрагменты ДНК визуализировали при помощи Typhoon FLA 9500.

Денситометрический анализ изображения проводили с помощью программы TotalLab Quant. IC50 рассчитывали с помощью программы GraphPad Prism.

3.11 Введение радиоактивной метки на 5'-конец олигонуклеотида 15bpLC

Реакцию проводили в 20 мкл. Реакционная смесь содержала 2 мкл 10х буферного раствора для Т4 полинуклеотидкиназы, 20 пмоль 15bpLC, 10 ед. Т4-полинуклеотидкиназы (MBI Fermentas, 10 ед./мкл) и 10 пмоль [г-32P]ATP (удельная активность 220 ТБк/ммоль или 6000 Ки/ммоль). Кинирование проводили при 37°C в течение 30 минут, после чего фермент инактивировали нагреванием в течение 15 минут при 75°C.

3.12 Трансфекция клеток ингибиторными олигонуклеотидами и получение клеточного экстракта

Трансфекцию проводили на HEK293E клетках с помощью Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в 96-луночных плашках для культивирования эукориотических клеток. Олигонуклеотды последовательно разбавляли средой Opti-MEM®I Medium до концентрации 220 мкM, 22 мкM, 2.2 мкM, 220 нM, 22 нM, 2.2 нM, 0.22 нM, 0.022 нM соответственно. В дальнейшем 5 мкл разбавленного олигонуклеотида смешивали с 5мкл Lipofectamine 2000, которую предварительно разбавляли в 17,7 раз средой Opti-MEM®I Medium в 96- луночной плашке и проинкубировали 15мин при комнатной температуре.

2.5*104 HEK293 клеток, ресуспендировали в 100мкл среды DMEM и добавляли каждую ячейку. После 2-х дней инкубации при 37єС в присутствии 5% СО2, клетки промыли 1х PBS буфером, затем ресуспендировали в 100мкл CHAPS буфера и инкубировали 30мин во льду. От клеточного дебриса избавлялись центрифугированием при 2464g, 30мин при 4єС. Концентрацию белка определяли по стандартной методике Брэдфорд [173].

3.13 RQ-ТРАП in vivo

5мкл клеточного экстракта, полученного после трансфекции клеток олигонуклеотидами, разбавляли в 10раз 1x ТРАП буфером. Затем 5 мкл разбавленного экстракта добавляли к 5мкл смеси mix2 во льду. ТРАП анализ проводили в одну стадию инкубированием реакционной смеси при 10єС 1час с последующей ПЦР реакцией. ПЦР, обработка данных и использование калибровочной кривой описаны выше (раздел 3.8). Известно, что Taq-полимераза активна в интервале температур 15-100°C. Мы наблюдали сохранение активности теломеразы во льду. Следовательно, 10°C достаточно, чтобы поддерживать теломеразу активной, тогда как Taq-полимераза неактивна в этих условиях. При использовании буфера, вместо клеточного экстракта, сигнал появляется при 27-30 циклах. Не трансфецированный клеточный экстракт последовательно 2-х кратно разбавляли и использовали для проверки линейности сигнала от активности теломеразы.

3.14 Проверка сборки теломеразы

Для проверки сборки мы использовали клеточные экстракты полученные при трансфекции клеток 5мкМ олигонуклеотидами. 500 мкл 5-ти кратно разбавленного ТРАП буфером клеточного экстракта центрифугировали в сахарозном градиенте. Сахарозный градиент получали 2-х кратным замораживанием-размораживанием 20% сахарозы в 1х ТРАП буфере.

Центрифугирование проводили в SW-41 Ti роторе (Beckman) при 4°C, 20h, 111132g (30000 об/мин) в J2-HS Beckman центрифуге. Фракции по 500мкл собрали начиная со дна пробирки. Для проверки теломеразной активности с каждой фракции отбирали по 2,5мкл и использовали в RQ-ТРАП in vivo.

3.15 Определение количества hTR с помощью метода обратной транскрипции сопряженной с ПЦР (RQ-ПЦР)

К каждой фракции добавляли 2 мкл гликогена (20мг/мл, Roche Applied Science). Затем РНК экстрагировали смесью фенол/хлороформом (1:1), осаждали этанолом и растворяли в 50мкл mQ воды. Полученный раствор РНК подвергали обратной транскрипции. Реакцию проводили в обьеме 10 мкл, содержащим 2 мкл 5x RT буфер, 2.5 мкл полученного раствора РНК, 1 мкМ олигонуклеотида hTR-R1, 0.5мМ dNTP, 0.2 мкл (1 ед.) Maxima Enzyme mix (Thermo Scientific) при 50°C, 2час. Затем реакционную смесь разбавили в 10раз mQ водой. 5 мкл разбавленного раствора использовали в ПЦР реакции, суммарный объем реакционной смеси составил 10мкл и содержал 1х Taq-буфер, 0.1 мM dNTP, 0.2 мкM hTR-F, 0.2 мкM hTR-R1, 1.5 мM MgCl2, 0.04 U/мкл Taq-полимераза, 0.25x SYBR-Green I в приборе CFX-96 Real-Time System (Bio Rad), за 30 циклов (30 сек при 95°C, 30 сек 58°C и 60 сек при 72°C). Для получения калибровочной кривой использовали 10-ти кратное последовательное разбавление раствора in vitro синтезированной hTR РНК.

3.16 Получение hTR методом in vitro Т7-транскрипции

Матрицу для Т7-трансрипции получали с помощью ПЦР (30 циклов: 40сек 94?C, 20сек 58?C, 90сек 72?C) в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1нг плазмиды pBluescript-DS-U1-hTR, 1х Pfu буфера (Fermentas), 0,5 мкМ T7-hTR-forward праймера, 0.5 мкМ hTR-reverse праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.1 U Pfu полимеразы. ПЦР продукт очищали с помощью GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific). Затем РНК синтезировали с помощью MEGAScript-T7 Kit (Invitrogen). Синтезированную РНК экстрагировали последовательно насыщенным раствором фенола и хлороформом, осаждали этанолом, затем очищали на 5% поликариламидном геле в денатурирующих условиях. Для этого после электрофореза, гель окрашивали в течение 10мин раствором SYBR-Green I, который готовили разбавлением коммерческого раствора SYBR-Green I 10000х в 10000раз буфером 1x TBE. После разделения фрагменты визуализировали УФ лампой, соответствующую hTR полосу вырезали и РНК экстрагировали 1х ТЕ буфером в присутствии фенола в течение ночи. РНК из полученного раствора осаждали этанолом, осадок растворяли в воде mQ.

3.17 Определение уровня hTR в клетках с помощью RQ-ПЦР

Мы заметили, что клеточный экстракт не влияет на обратно транскрипционную реакцию, однако ингибирует ПЦР. 7-ми кратное разбавление продукта обратно транскрипционной реакции mQ водой элиминировал эффект на ПЦР. 5 мкл разбавленный кДНК использовали в ПЦР как описано в разделе 3.15. Не трансфецированный клеточный экстракт последовательно 2-х кратно разбавляли, и использовали как позитивный контроль и для проверки линейности сигнала от количества клеточного экстракта. Полученные результаты по уровню hTR в клетке нормировали делением по уровню GAPDH, который параллельно анализировали по той же методике и на том же препарате с праймерами Fw и Rv. Для этого в анализе вместо праимеров hTR-R1 и hTR-F использовали праймеры Fw и Rv соответственно. Все ПЦР амплификации проводили трехкратно.

3.18 МТТ анализ цитотоксичности олигонуклеотидов

20мкл соли 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия бромид (МТТ) с концентрацией 5 мг/мл (в PBS 1x) добавляли в HEK293 клетки, трансфецированные олигонуклеотидными ингибиторами и инкубированные в течение 2-х дней по протоколу описанному в разделе 3.12.

После 3-х часов инкубации в присутствии МТТ соли при 37єC, 5% CO2 среду удалили и добавили 150 мкл ДМСО с последующим перемешиванием.

Флуоресценцию образцов измеряли при 555 нм, в качестве референсного сигнала использовали 670 нм. Затем сигнал, полученный при 670 нм отнимали от сигнала измеренного при 555 нм. Сигнал 670нм - соответсвует возбуждении образца светом с длиной волны 607нм, 555нм - соответсвует длине волны 555нм. Полученные данные нормализовали к сигналу, полученному от нетрансфецированных клеток.

Выводы

Новая система экспрессии основных компонентов теломеразного комплекса человека позволяет повысить уровень теломеразы в клетках HEK293E по сравнению с описанными ранее.

Разработанный метод количественного определения теломеразной активности позволяет измерять ингибирование теломеразы веществами, влияющими на ПЦР и стабилизирующими G-квадруплексы.

Производные антра[2,3-b]тиофен-5,10-диона, 2-алкилтио-5-арилметилен-4H-имидазолин-4-он и его медь содержащий комплекс являются ингибиторами теломеразы.

Химерные олигонуклеотиды, состоящие из двух частей, комплементарных разным районам hTR и соединенных ненуклеотидным линкером, ингибируют сборку теломеразы.

Димеризация теломеразы человека подтверждена с помощью серии химерных олигонуклеотидов, ингибирующих активность теломеразы.

Список литературы

1. Jemal A.., Bray F., Center M., Ferlay J. Global Cancer Statistics. // CA CANCER J CLIN. 2011. V. 61. P. 69-90.

2. Hanahan D., Weinberg R. The Hallmarks of Cancer. // Cell. 200. V. 100. P. 57-70.

3. Shay J., Wright W. Telomerase: a target for cancer therapeutics. // Cancer Cell. 2002. V. 2. P. 57-265.

4. Cimino-Reale G., Pascale E., Battiloro E., Starace G., Verna R., D'Ambrosio

5. The length of telomeric G-rich strand 3'-overhang measured by oligonucleotide ligation assay. // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. E35.

6. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains.// Exp Cell Res. 1961. V. 25. P. 585-621.

7. Cong Y.S., Wright W.E., Shay J.W. Human telomerase and its regulation. // Microbiol Mol Biol Rev. 2002. V. 66. P. 407-425.

8. Celli G., de Lange T. DNA processing is not required for ATM-mediated telomere damage response after TRF2 deletion. // Nature Cell Biology. 2005.

9. Cohen S.B., Graham M.E., Lovrecz G.O., Bache N., Robinson P.J., Reddel

10. Protein composition of catalytically active human telomerase from immortal cells. // Science. 2007. V. 30. P. 1850-1853.

11. Weinrich S.L., Pruzan R., Ma L., Ouellette M., Tesmer V.M., Holt S.E., Bodnar A.G., Lichtsteiner S., Kim N.W., Trager J.B., Taylor R.D., Carlos R., Andrews W.H., Wright W.E., Shay J.W., Harley C.B., Morin G.B. Reconstitution of human telomerase with the template RNA component hTR and the catalytic protein subunit hTRT. // Nat Genet. 1997. V. 17. P. 498-502.

12. Заридзе Д. Канцерогенез. -М.: Медицина, 2004, 576c.

13. Zvereva M. I., Shcherbakova D. M., Dontsova O. A.. Telomerase: structure, functions, and activity regulation. // Biochemistry (Mosc). 2010. V. 75. P. 1563-1583.

14. Blagoev K.B. Cell proliferation in the presence of telomerase. // PLoS ONE. 2009. V. 4. P. e4622.

15. Hamad N.M., Banik S.S., Counter C.M. Mutational analysis defines a minimum level of telomerase activity required for tumourigenic growth of human cells. // Oncogene. 2002. V. 21. P. 7121-7125.

16. Hodes R. Molecular targeting of cancer: telomeres as targets. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2001. V. 98. P. 7649-7651.

17. Ruden M., Puri N. Novel anticancer therapeutica targeting telomerase. //

18. Cancer Treatment Reviews. 2013. V. 39. P. 444-456.

19. Chen H., Li Y., Tollefsbol T.O. Strategies targeting telomerase inhibition. // Mol Biotechnol. 2009. V. 41. P. 194-199.

20. Tominaga T., Kashimura H., Suzuki K., Nakahara A., Tanaka N., Noguchi M., Itabashi M., Ohkawa J. Telomerase activity and expression of human telomerase catalytic subunit gene in esophageal tissues. // J Gastroenterol. 2002. V. 37. P. 418-27.

21. Lь M.H., Liao Z.L., Zhao X.Y., Fan Y.H., Lin X.L., Fang D.C., Guo H., Yang S.M. hTERT-based therapy: A universal anticancer approach (Review). // Oncology Reports. 2012. V. 28. P. 1945-1952.

22. Harley C.B. Telomerase and cancer therapeutics. // Nat Rev Cancer. 2008. V. 8. P. 167-179.

23. Brunsvig P.F., Kyte J.A., Kersten C., Sundstrom S., Moller M., Nyakas M., Hansen G.L., Gaudernack G., Aamdal S. Telomerase peptide vaccination in NSCLC: a phase II trial in stage III patients vaccinated after chemoradiotherapy and an 8-year update on a phase I/II trial. // Clin Cancer Res. 2011. V. 17. P. 6847-6857.

24. Williams S.C. No end in sight for telomerase-targeted cancer drugs. // Nat Med. 2013. V. 19. P. 6.

25. Middleton G., Silcocks P., Cox T., Valle J., Wadsley J., Propper D., Coxon F., Ross P., Madhusudan S., Roques T., Cunningham D., Falk S., Wadd N., Harrison M., Corrie P., Iveson T., Robinson A., McAdam K., Eatock M., Evans J., Archer C., Hickish T., Garcia-Alonso A., Nicolson M., Steward W., Anthoney A., Greenhalf W., Shaw V., Costello E., Naisbitt D., Rawcliffe C., Nanson G., Neoptolemos J. Gemcitabine and capecitabine with or without telomerase peptide vaccine GV1001 in patients with locally advanced or metastatic pancreatic cancer (TeloVac): an open-label, randomised, phase 3 trial. // Lancet Oncol. 2014. V. 15. P. 829-840.

26. Huo L.F., Tang J.W., Huang J.J., Huang P.T., Huang C.F., Kung H.F., Lin M.C. Cancer immunotherapy targeting the telomerase reverse transcriptase. // Cell Mol Immunol. 2006. V. 3. P. 1-11.

27. DiPersio J.F., Collins Jr R.H., Blum W., Devetten M.P., Stiff P., Elias L., et al. Immune responses in AML patients following vaccination with GRNVAC1, autologous RNA transfected dendritic cells expressing telomerase catalytic subunit hTERT. // ASH Annu Meeting Abstr. 2009. V.

28. Su Z., Dannull J., Yang B.K., Dahm P., Coleman D., Yancey D., Sichi S., Niedzwiecki D., Boczkowski D., Gilboa E., Vieweg J. Telomerase mRNA-transfected dendritic cells stimulate antigen-specific CD8+ and CD4+ T cell responses in patients with metastatic prostate cancer. // J Immunol. 2005. V.

29. Su Z., Vieweg J., Weizer A.Z., Dahm P., Yancey D., Turaga V., et al. Enhanced induction of telomerase-specific CD4(+) T cells using dendritic cells transfected with RNA encoding a chimeric gene product. // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 5041-5048.

30. Kobayashi A., Weinberg V., Darragh T., Smith-McCune K. Evolving immunosuppressive microenvironment during human cervical carcinogenesis. // Mucosal Immunol. 2008. V. 1. P. 412-420.

31. Jacob D., Davis J., Zhu H., Zhang L., Teraishi F., Wu S., Marini F.C., Fang B. Suppressing orthotopic pancreatic tumor growth with a fiber-modified adenovector expressing the TRAIL gene from the human telomerase reverse transcriptase promoter. // Clin Cancer Res. 2004. V. 10. P. 3535-3541.

32. Li Y., Idamakanti N., Arroyo T., Thorne S., Reid T., Nichols S., VanRoey M., Colbern G., Nguyen N., Tam O., Working P., Yu D.C. Dual promoter-controlled oncolytic adenovirus CG5757 has strong tumor selectivity and significant antitumor efficacy in preclinical models. // Clin Cancer Res. 2005.

33. Nemunaitis J., Tong A.W., Nemunaitis M., Senzer N., Phadke A.P., Bedell C., Adams N., Zhang Y.A., Maples P.B., Chen S., Pappen B., Burke J., Ichimaru D., Urata Y., Fujiwara T. A Phase I Study of Telomerase-specific Replication Competent Oncolytic Adenovirus (Telomelysin) for Various Solid Tumors. // Mol Ther. 2009. V. 18. P. 429-34.

34. Brower V. Telomerase-Based Therapies Emerging Slowly. // J Natl Cancer Inst. 2010. V. 102. P. 520-521.

35. Boukamp P., Popp S., Krunic D. Telomere-dependent chromosomal instability. // J Investig Dermatol Symp Proc. 2005. V. 10. P. 89-94.

36. Phatak P., Burger A.M. Telomerase and its potential for therapeutic intervention. // Br J Pharmacol. 2007. V. 152. P. 1003-1011.

37. Cao Y., Huschtscha L.I., Nouwens A.S., Pickett H.A., Neumann A.A., Chang A.C., Toouli C.D., Bryan T.M., Reddel R.R. Amplification of telomerase reverse transcriptase gene in human mammary epithelial cells with limiting telomerase RNA expression levels. // Cancer Res. 2008. V. 68. P. 3115-3123.

38. Morin G. The Human Telomere Terminal Transferase Enzyme Is a Ribonucleoprotein That Synthesizes TTAGGG Repeats. // Cell. 1989. V. 59. 521-529.

39. Fajkus J. Detection of telomerase activity by the TRAP assay and its variants and alternatives. // Clinica Chimica Acta. 2006. V. 371. P. 25-31.

40. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.L., Coviello G.M., Wright W.E., Weinrich S.L., Shay J.W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. // Science. 1994.

41. Kim N.W., Wu F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP). // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 2595-2597.

42. De Cian A., Cristofari G., Reichenbach P., De Lemos E., Monchaud D., Teulade-Fichou M.P., Shin-Ya K., Lacroix L., Lingner J., Mergny J.L. Reevaluation of telomerase inhibition by quadruplex ligands and their mechanisms of action. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2007. V. 104. P. 17347-17352.

43. Piotrowska K., Kleideiter E., Mьrdter T.E., Taetz S., Baldes C., Schaefer U., Lehr C.M., Klotz U. Optimization of the TRAP assay to evaluate specificity of telomerase inhibitors. // Lab Invest. 2005. P. 85. V. 1565-1569.

44. Pascolo E., Wenz C., Lingner J., Hauel N., Priepke H., Kauffmann I., Garin-Chesa P., Rettig W.J., Damm K., Schnapp A. Mechanism of human telomerase inhibition by BIBR1532, a synthetic, non-nucleosidic drug candidate. // J Biol Chem. 2002. V. 277. P. 15566-15572.

45. Damm K., Hemmann U., Garin-Chesa P., Hauel N., Kauffmann I., Priepke

46. H., Niestroj C., Daiber C., Enenkel B., Guilliard B., Lauritsch I., Mьller E.,

47. Pascolo E., Sauter G., Pantic M., Martens U.M., Wenz C., Lingner J., Kraut N., Rettig W.J., Schnapp A. A highly selective telomerase inhibitor limiting human cancer cell proliferation. // EMBO. 2002. V. 20. P. 6958-6968.

48. Wu K.L., Wilkinson S., Reich N.O., Pettus T.R. Facile synthesis of naphthoquinone spiroketals by diastereoselective oxidative [3 + 2] cycloaddition. // Org Lett. 2007. V. 9. P. 5537-5540.

49. Barma D.K., Elayadi A., Falck J.R., Corey D.R. Inhibition of telomerase by BIBR 1532 and related analogues. // Bioorg Med Chem Lett. 2003. V. 13. P. 1333-1336.

50. Cohn E.P., Wu K.L., Pettus T.R., Reich N.O. A new strategy for detection and development of tractable telomerase inhibitors. // J Med Chem. 2002. V. P. 3678-3686.

51. Wege H., Chui M.S., Le H.T., Tran J.M., Zern M.A. SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. E3-3.

52. Uehara H., Nardone G., Nazarenko I., Hohman R.J. Detection of telomerase activity utilizing energy transfer primers: comparison with gel- and ELISA-based detection. // Biotechniques. 1999. V. 26. P. 552-558.

53. Rossetti L., Franceschin M., Bianco A., Ortaggi G., Savino M. Perylene diimides with different side chains are selective in inducing different G-quadruplex DNA structures and in inhibiting telomerase. // Bioorg Med Chem Lett. 2002. V. 12. P. 2527-2533.

54. Oda M., Ueno T., Kasai N., Takahashi H., Yoshida H., Sugawara F., Sakaguchi K., Hayashi H., Mizushina Y. Inhibition of telomerase by linear-chain fatty acids: a structural analysis. // Biochem J. 2002. V. 367. P. 329-334.

55. Reed J., Gunaratnam M., Beltran M., Reszka A.P., Vilar R., Neidle S. TRAP-LIG, a modified telomere repeat amplification protocol assay to quantitate telomerase inhibition by small molecules. // Anal Biochem. 2008. V. 380. P. 99-105.

56. Gollahon L.S., Holt S.E. Alternative methods of extracting telomerase activity from human tumor samples. // Cancer Lett. 2000. V. 159. P. 141-149.

57. Zendehrokh N., Dejmek A. Telomere repeat amplification protocol (TRAP) in situ reveals telomerase activity in three cell types in effusions: malignant cells, proliferative mesothelial cells, and lymphocytes. // Mod Pathol. 2005.

58. Herbert B., Pitts A.E., Baker S.I., Hamilton S.E., Wright W.E., Shay J.W., Corey D.R. Inhibition of human telomerase in immortal human cells leads to progressive telomere shortening and cell death. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2012. V. 96. P. 14276-14281.

59. Wishart D.S. Small molecules and disease. // PLoS Comput Biol. 2012. V. 8. P. e1002805.

60. Mergny J.L., Riou J.F., Mailliet P., Teulade-Fichou M.P., Gilson E. Natural and pharmacological regulation of telomerase. // Nucleic Acids Res. 2002. V.

61. Fletcher T.M., Cathers B.E., Ravikumar K.S., Mamiya B.M., Kerwin S.M. Inhibition of human telomerase by 7-deaza-2'-deoxyguanosine nucleoside triphosphate analogs: potent inhibition by 6-thio-7-deaza-2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate. // Bioorg Chem. 2001. V. 29. P. 36-55.

62. Grulich A.E., van Leeuwen M.T., Falster M.O., Vajdic C.M. Incidence of cancers in people with HIV/AIDS compared with immunosuppressed transplant recipients: a meta-analysis. // Lancet. 2007. V. 370. P. 59-67.

63. Chaturvedi A.K., Madeleine M.M., Biggar R.J., Engels E.A. Risk of human papillomavirus-associated cancers among persons with AIDS. // Journal of the National Cancer Institute. 2009. V. 101. P. 1120-1130.

64. Engels E.A., Biggar R.J., Hall H.I., Cross H., Crutchfield A., Finch J.L., Grigg R., Hylton T., Pawlish K.S., McNeel T.S., Goedert J.J. Cancer risk in people infected with human immunodeficiency virus in the United States. //

65. International Journal of Cancer. 2008. V. 123. P. 187-194.

66. Engels E.A., Pfeiffer RM., Goedert J.J., Virgo P., McNeel T.S., Scoppa S.M., Biggar R.J. Trends in cancer risk among people with AIDS in the United States 1980-2002. // AIDS. 2006. V. 20. P. 1645-1654.

67. Sauerwald A., Sandin S., Cristofari G., Scheres S.H., Lingner J., Rhodes D. Structure of active dimeric human telomerase. // Nat Struct Mol Biol. 2013. V. 20. P. 454-460.

68. El-Daly H., Kull M., Zimmermann S., Pantic M., Waller C.F., Martens U.M. Selective cytotoxicity and telomere damage in leukemia cells using the telomerase inhibitor BIBR1532. // Blood. 2005. V. 104. P. 1742-1749.

69. Gryaznov S. US Patent No. 7,494,982 (24 February 2009).

70. Gryaznov S.M. Oligonucleotide N3'-P5' Phosphoramidates and Thio-Phoshoramidates as Potential Therapeutic Agents. // Chemistry & Biodiversity. 2010. V. 7. P. 477-493.

71. Thompson P.A., Drissi R., Muscal J.A., Panditharatna E., Fouladi M., Ingle A.M., Ahern C.H., Reid J.M., Lin T., Weigel B.J., Blaney S.M. A phase I trial of imetelstat in children with refractory or recurrent solid tumors: a Children's Oncology Group Phase I Consortium Study (ADVL1112). // Clin Cancer Res. 2013. V. 19. P. 6578-6584.

72. Tefferi A., Begna K., Laborde R., Patnaik M., Lasho T., Zblewski D., Finke C., Schimek L., LaPlant B., Hanson C., Stuart M., Pardanani A. Imetelstat, a Telomerase Inhibitor, Induces Morphologic and Molecular Remissions In Myelofibrosis and Reversal Of Bone Marrow Fibrosis. // 55th ASH Annual Meeting. 2013. # 662.

73. Gryaznov S.M., Lloyd D.H. Modulation of oligonucleotide duplex and triplex stability via hydrophobic interactions. // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 5909-5915.

74. Золотов. Ю.А. Основы аналитической химии. - М.: Высшая школа, 2000.

75. Templeton N.S. Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies. // Taylor & Francis Group. 2009.

76. Varshney A., Ramakrishnan S.K., Sharma A., Santosh B., Bala J., Yadava P.K., Jaiswal R.K. Global expression profile of telomerase-associated genes in HeLa cells. // Gene. 2014. V. 547. P. 211-217.

77. Li S., Rosenberg J.E., Donjacour A.A., Botchkina I.L., Hom Y.K., Cunha G.R., Blackburn E.H. Rapid Inhibition of Cancer Cell Growth Induced by Lentiviral Delivery and Expression of Mutant-Template Telomerase RNA and Anti-telomerase Short-Interfering RNA. // Cancer Res. 2004. V. 64. P. 4833-4840.

78. Cotton M., Saltik M., Baker A. Transfection Complexes Generated with Adenovirus and Polyethylenimine-Condensed DNA. // Adenovirus Methods and Protocols. 1999. V. 21. P. 295-307.

79. Yasuda K., Ogawa Y., Yamane I., Nishikawa M., Takakura Y. Macrophage activation by a DNA/cationic liposome complex requires endosomal acidification and TLR9-dependent and -independent pathways. // J Leukoc Biol. 2005. V. 77. P. 71-79.

Список сокращений

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДТТ - дитиотреитол мРНК - матричная РНК

ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота РНКаза - рибонуклеаза

dNTP - смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов

TR - теломеразная РНК (Telomerase RNA)

TERT - белок теломеразной обратной транскриптазы (Telomerase reverse transcriptase), hTERT - TERT человека

ТРАП - протокол амплификации теломерных повторов

FDA - (Food and Drug Administration - Министерства здравоохранения и социальных служб США, занимающееся контролем качества пищевых продуктов, лекарственных препаратов)

G4-лиганды - соединения, связывающиеся с G4-квадруплексами ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты ВПА - вальпроевая кислота ПНК - пептидная нуклеиновая кислота

Размещено на Allbest.ru