Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна

УДК 612.66+616-092:577.15

03.00. 04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Активність ферментів утилізації ендогенних альдегідів в окисно-відновних реакціях у щурів різного віку при іммобілізації

Фоміна Олена Вікторівна

Харків - 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті охорони здоров`я дітей та підлітків АМН України (м. Харків).

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Давидов Вадим Вячеславович, Інститут охорони здоров'я дітей та підлітків АМН України, завідувач лабораторії вікової ендокринології і обміну речовин, м. Харків.

Офіційні опоненти:

- доктор біологічних наук, професор Перський Євген Ефроїмович, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна МОН України, завідувач кафедри біохімії, м. Харків;

- доктор біологічних наук, професор Петров Сергій Анатолійович, Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова МОН України, професор кафедри біохімії, м. Одеса.

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України (лабораторія регуляції метаболізму), м. Київ.

Захист відбудеться "19" квітня 2006 року о 1600 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи, 4, ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи, 4.

Автореферат розісланий "10" березня 2006 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Падалко В.І.

Анотація

Фоміна О.В. Активність ферментів утилізації ендогенних альдегідів в окисно-відновних реакціях у щурів різного віку при іммобілізації. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2005.

Виявлено, що в процесі онтогенезу у щурів в тканинах внутрішніх органів виникають умови для зміни ефективності функціонування ферментів, які каталізують окисно-відновні шляхи утилізації карбонільних сполук метаболізму, за умов іммобілізаціоного стресу. Вони виявляються у виникненні "напруги" у відновленні альдегідів в альдегідредуктазній реакції в печінці 1,5-місячних тварин, а також гальмуванні перетворень альдегідів в окисних та відновних реакціях в печінці і скелетному м'язі старих щурів. Вікове зниження швидкості утилізації ендогенних альдегідів у досліджених тканинах визначає зниження їхньої стійкості до вільнорадикального ушкодження. У зв'язку з цим важливу роль у підвищенні резистентності організму до дії ушкоджуючих факторів стресу здобуває спрямована регуляція утилізації ендогенних альдегідів.

Ключові слова: альдегіди, альдегідредуктаза, альдегіддегідрогеназа, печінка, м'яз, іммобілізаційний стрес, онтогенез.

Аннотация

Фомина Е.В. Активность ферментов утилизации эндогенных альдегидов в окислительно-восстановительных реакциях у крыс разного возраста при иммобилизации. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2005.

Диссертация посвящена исследованию возрастных и тканеспецифических особенностей изменения активности ферментов окислительно-восстановительных превращений эндогенных альдегидов у крыс при иммобилизации. На основании полученнных данных установлено, что возрастная модуляция активности ферментов окислительно-восстановительных превращений эндогеных альдегидов обуславливает формирование возраст-зависимых различий в эффективности утилизации карбонильних соединений на разных этапах онтогенеза. В печени 1,5-месячных животных низкая активность альдегиідредуктазы (АР) является одной из причин определенного "напряжения" в утилизации альдегидов в восстановительных реакциях. Постепенное повышение активности АР печени у крыс в течение первого года жизни предопределяет ведущую роль редуктазного пути в окислительно-восстановительных превращениях альдегидов в гепатоцитах. Модуляция активности альдегидредуктазы и альдегиддегидрогеназы в постмитохондриальной фракции печени на исследованном этапе онтогенеза отражается в постепенном повышении соотношения активности АР/АЛДГ. В скелетной мышце высокая активность митохондриальной изоформы альдегиддегидрогеназы у крыс 1,5-месячного обуславливает формирование оптимальных условий для утилизации эндогенных альдегидов в этом возрасте. В период от 2- до 12-месячного возраста у животных наблюдается ограничение активности АЛДГ в митохондриях, что формирует условия для сниженной скорости окисления альдегидов на данном отрезке онтогенеза. Установленный тканеспецифический характер этих изменений является одной из причин различий в скорости утилизации альдегидов в окислительных и восстановительных реакциях и, как следствие, в различной чувтвительности тканей внутренних органов к повреждающим факторам стресса. В работе было показано, что в печени основной путь утилизации эндогенных альдегидов сопряжен с реакцией их восстановления альдегидредуктазой. В мышечной ткани основной вклад в величину базальной активности исследованных энзимов у 1,5-, 6-, и 12-месячных крыс вносит митохондриальный изофермент АЛДГ. У старых животных в обеих иследованных тканях наблюдается снижение базальной ативности АР и АЛДГ. Данный сдвиг может являться одной из причин модуляции стрессорной устойчивости организма при старении.

В работе установлено, что в процессе 30-минутной иммобилизации возникают возраст-зависимые тканеспецифические особенности в активности изученных ферментов катаболизма эндогенных альдегидов. Изменения ферментативной активности сопровождаются возникновением ряда метаболических сдвигов. В работе обсуждается характер соотношений изменения активности альдегидредуктазы и альдегиддегидрогеназы с уровнем накопления продуктов свободнорадикального окисления белков и липидов при стрессе. В частности полученные данные указывают на то, что у 6- и 24-месячных животных после иммобилизации происходит накопление продуктов перекисного окисления липидов, что отражает возникновение у них стрессорной стимуляции свободнорадикального окисления в исследованных тканях внутренних органов. У крыс остальных возрастных экспериментальных групп, сопутствующая иммобилизационному стрессу интенсификация свободнорадикальных процессов была связана с усилением свободнорадикального окисления белков в субклеточных фракциях печени и скелетной мышцы. Установлено, что в обеих исследованных тканях при данной модели иммобилизационного стресса возникают условия для более эффективной утилизации альдегидов в редуктазном пути. При этом показано, что у крыс первого года жизни в печени и скелетной мышце при иммобилизации не происходит накопления продуктов превращений эндогенных альдегидов - шиффовых оснований, что является следствием достаточной активности ферментов окислительно-восстановительных утилизации карбонильных продуктов на данном отрезке онтогенеза. У старых животных повышенный уровень накопления продуктов превращенй альдегидов в печени и скелетных мышцах при иммобилизации является, по всей видимости, следствием торможения их превращений в альдегидредуктазной и альдегиддегидрогеназной реакциях. Данный сдвиг предопределяет у старых животных понижение их устойчивости к свободнорадикальному повреждению. В связи с этим, важную роль для повышения резистентности организма к действию повреждающих факторов стресса может иметь направленнная регуляция скорости утилизации эндогенных альдегидов.

Ключевые слова: альдегиды, альдегидредуктаза, альдегиддегидрогеназа, печень, мышца, иммобилизационный стресс, онтогенез.

Summary

Fomina O.V. Activity of the ensymes of endogenous aldehydes utilization in oxidation-reduction reactions in rats of different ages during immobilization. - Manuscript.

The thesis for a degree of candidate of science in biology on speciality 03.00.04 - biochemistry. - V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv, 2005.

The work has shown that in the course of ontogenesis in rats certain conditions develop effecting changes in the functional efficiency of enzyme, which play a dominant role in utilization of metabolic carbonyl products in the internal organs tissue under immobilization stress condition They are manifested by development of certain "strain" in reduction of aldehydes in the course of the aldehyde reductase reaction in the liver of 1,5-months-old animals, as well as in slowing down their conversion in aldehyde reductase and aldehyde dehydrogenase reactions in the liver and in the skeletal muscles of old rats. Age-related decrease in the efficiency of endogenous aldehydes utilization in the internal organs tissue reflects a decrease in their resistance to free-radical damage. In this connection, a great significance in an increase in the organism resistance to the impact of oxidative stress damaging factors belongs to a direct stimulation of fermentative biosynthesis of endogenous aldehydes catabolism.

Key words: aldehydes, aldehyde reductase, aldehyde dehydrogenase, liver, muscle, immobilization stress.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. У процесі формування окислювального стресу в клітинах утворюється велика кількість проміжних продуктів метаболізму, що мають цитотоксичну дію (Владимиров Ю.А., 1972; Uchida К., 2000). Особливе значення серед них грають карбонільні сполуки, до яких, крім інших, відносяться аліфатичні альдегіди (Bartfay W.J. et al., 1999; Uchida К., 2000). На відміну від вільних радикалів, альдегіди є стабільними сполуками, здатними дифундувати на великі відстані та виступати в якості "вторинних місенджерів" окислювального стресу. За рахунок цього виникають умови для прояву ушкоджуючої дії ендогенних альдегідів на клітинні мембрани, наслідком чого стає ініціація апоптозу (Slater A.F. et al., 1994; Gil P. et al., 2002; Galves A.S. et al., 2003) і альтерація клітин (Estebauer Н., 1996; Bauer V.V., 1999). В основі ушкоджуючої дії ендогенних альдегідів лежить їхня властивість викликати ковалентну модифікацію макромолекул і, як наслідок того, змінювати структуру біологічних мембран (Grume T., Siems W.G., 1993; Davis M.J., 1999), пригнічувати активність гліколізу й окислювального фосфорилювання, синтез білків і нуклеїнових кислот. Цитотоксичні властивості альдегідів пов'язані з їх високою реакційною здатністю через електрофільність їхніх карбонільних груп. Особливого значення стимуляція утворення ендогенних альдегідів набуває в процесі виникнення стресорних уражень внутрішніх органів (Судаков К.В., 1980; Меерсон Ф.З., 1981, 1986; Барабой В.А.,1991; 1994; Liu ; J., Mori A., 1999; Ланкин В.З., 2000; Brody J.A., 2001; Davydov V.V., Shvets V.N., 2001, 2003). Згідно з накопиченими натепер даними, стрес виступає в якості важливого етіологічного фактора виникнення серцево-судинних захворювань (ішемічна хвороба серця, гіпертонічна хвороба та ін.), патології шлунково-кишкового тракту (виразкова хвороба шлунка), ендокринних і невротичних розладів (Чазов Е.И., 1974; Вальдман Ф.В. із співавт., 1979; Малая Л.Т., Волков В.И., 1980; Sime W.E., Buel J.C., 1980). Через це вивченню механізмів резистентності до стресу приділяється пильна увага дослідників. У процесі еволюції в клітинах сформувалася система катаболізму альдегідів. Її компонентами є ферменти, що відновлюють альдегіди в менш токсичні алкоголі, окислюють їх у карбонові кислоти, каталізують їхню кон'югацію з глютатіоном. У літературі висловлюється припущення про те, що ферменти утилізації ендогенних альдегідів беруть безпосередню участь в адаптації до ушкоджуючої дії окислювального стресу (Siems W.G. et al., 1997; 1998). У зв'язку з цим вони можуть виступати в ролі однієї з важливих ланок вікової зміни чутливості організму до дії факторів стресу і виникненню вікової патології (Lakatta E.G., 1990; Фролькис В.В., 1991). Однак, дотепер не існує чітких уявлень ні про особливості функціонування ферментів утилізації ендогенних альдегідів у тканинах внутрішніх органів при стресі, ні про вікові аспекти даного питання. З огляду на вищевикладене, в роботі було проведено вивчення активності і деяких властивостей ферментів, що каталізують окисно-відновні перетворення ендогенних альдегідів у печінці і скелетному м'язі щурів різного віку при іммобілізаційному стресі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано в рамках держбюджетної теми Інституту охорони здоров'я дітей і підлітків АМН України "Вивчити вікові особливості метаболічної адаптації до дії ушкоджуючих факторів окислювального стресу і розробити методи диференційованої антиоксидантної терапії" (№ державної реєстрації 0102U002283).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення вікових і тканинноспецифічних особливостей зміни активності ферментів, які каталізують окисно-відновні перетворення ендогенних альдегідів, а також вивчення регуляторних ефектів продуктів вільнорадикальних реакцій на зміну активності і властивостей ферменту окисних перетворень ендогенних альдегідів у щурів при 30-хвилинній іммобілізації.

Для виконання поставленої мети були визначені наступні задачі:

Вивчити вікову динаміку активності альдегідредуктази й альдегіддегідрогенази в мітохондріальній і постмітохондріальній фракції печінки і стегнового м'яза щурів, підданих 30-хвилинній іммобілізації.

Провести порівняльний аналіз активності ферментів окислювального і відновного шляхів утилізації ендогенних альдегідів у мітохондріальній і постмітохондріальній фракції печінки і стегнового м'яза щурів на різних етапах онтогенезу.

Виявити особливості регуляторного ефекту перекису водню і пропіонового альдегіду на активність альдегідредуктази постмітохондріальної фракції печінки у щурів різного віку при 30-хвилинній іммобілізації.

Установити характер взаємовідносин зрушень в активності альдегідредуктази й альдегіддегідрогенази з рівнем накопичення продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків у печінці і скелетному м'язі щурів різного віку, підданих 30-хвилинній іммобілізації.

Об'єкт дослідження - процес утилізації ендогенних альдегідів в окислювально-відновних реакціях у печінці і кістяковому м'язі щурів на різних етапах онтогенезу при іммобілізаційному стресі.

Предмет дослідження - активність альдегідредуктази й альдегіддегідрогенази, рівень накопичення продуктів вільнорадикального окислення білків і ліпідів у печінці і кістяковому м'язі, регуляція активності альдегідредуктази перекисом водню і пропіоновим альдегідом у постмітохондріальній фракції печінки щурів при іммобілізаційному стресі на різних етапах онтогенезу.

Методи дослідження. Спектрофотометрія (визначення активності альдегідредуктази, альдегіддегідрогенази і вмісту продуктів вільнорадикального окислення білків і ліпідів - карбонільованих білків і дієнових кон'югатів; спектрофлюориметрія (вимірювання концентрації шифових основ, адреналіну і 11-оксикортикостероїдів; диференціальне центрифугування (фракціонування гомогенатів печінки і скелетного м'яза).

Наукова новизна одержаних результатів визначається тим, що в роботі вперше було вивчено активність ферментів окисно-відновних перетворень у печінці і кістяковому м'язі щурів різного віку при іммобілізаційному стресі. Було встановлено, що протягом першого року життя в печінці щурів відбувається поступове збільшення активності альдегідредуктази (АР), що супроводжується формуванням оптимуму рН реакції 6,5, а також різноспрямованими регуляторними ефектами пропіонового альдегіду і перекису водню на фермент. У 24-місячному віці в печінці спостерігається паралельне зниження активності АР і загальної альдегіддегідрогеназної (АЛДГ) активності. Протягом дослідженого періоду онтогенезу (від 1,5- до 24 місячного віку) спостерігається поступове зростання величини співвідношення активності АР/АЛДГ у постмітохондріальній фракції печінки, що відбиває вікове підвищення ролі відновного шляху в утилізації ендогенних альдегідів. Показано, що в стегновому м'язі щурів від 1,5- до 24-місячного віку відбувається зменшення загальної активності АЛДГ, пов'язане зі зниженням активності мітохондріального ізоферменту.

Уперше встановлено, що умови для прояву максимальної ефективності утилізації ендогенних альдегідів в окислювально-відновних перетвореннях у стегновому м'язі виникають у 1,5-місячному, а в печінці - у 12-місячному віці. У старих щурів ефективність використання альдегідів в альдегідредуктазній і альдегіддегідрогеназній реакції в обох тканинах знижується в порівнянні з 12-місячними тваринами.

Уперше виявлено, що після 30-хвилинної іммобілізації в стегновому м'язі щурів усіх досліджених вікових груп знижується загальна активність АЛДГ. У постмітохондріальній фракції печінки у молодих (1,5-міс) і старих (24-міс) тварин відбуваються односпрямовані зрушення в активності досліджуваних ферментів, що виявляється в активації АР і АЛДГ. Одночасно з цим послабляється прояв інгібуючого впливу пропіонового альдегіду на альдегідредуктазу. Характер виникаючих зрушень в активності АР і АЛДГ свідчить про існування однотипних змін у співвідношенні шляхів утилізації ендогенних альдегідів при іммобілізаційному стресі в препубертатному періоді та у пізньому онтогенезі.

Теоретичне и практичне значення роботи. Одержані результати та їх узагальнення розширюють сучасні уявлення про вікові особливості функціонування ферментів, каталізуючих окисно-відновні перетворення альдегідів в тканинах внутрішніх органів при іммобілізаційному стресі. Результати досліджень вказують на особливу роль ферментів утилізації ендогенних альдегідів у зміні стійкості печінки та скелетного м'яза до дій ушкоджуючих факторів стресу на певних етапах онтогенезу. У роботі вперше встановлено характер регуляторного впливу продуктів вільнорадикальних реакцій (перекису водню та пропіонового альдегіду) на швидкість відновлення ендогенних альдегідів альдегідредуктазою. Вперше висловлюється припущення про перспективність створення нового підходу у захисті тканин від вільнорадикального ушкодження при стресі, пов'язаного зі спрямованим підвищенням швидкості утилізації карбонільованих продуктів метаболізму.

Особистий внесок здобувача. Усі результати, які приведені в роботі, були отримані здобувачем самостійно. Дисертантом особисто проведені експериментальні дослідження, статистична обробка та аналіз отриманих результатів. Планування напрямків досліджень та інтерпретація отриманих результатів здійснена спільно з науковим керівником, д.м.н., проф. В.В. Давидовим.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на V та VI Міжнародних симпозіумах "Біологічні механізми старіння" (Харків, 2002, 2004); на VII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002); на 4 та 6 Українських конференціях молодих вчених, присвячених пам'яті академіка В.В.Фролькіса (Київ, 2003, 2005); на науково-практичній конференції "Биология - наука ХХI века" (Пущино, 2004); на науково-практичній конференції "Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини" (Харків, 2004); на науково-практичній конференції "Ліки - людині. Сучасні проблеми створення, дослідження і апробації лікарських засобів" (Харків, 2004); на науково-практичній конференції з міжнародною участю "Від фундаментальних досліджень - до прогресу в медицині" (Харків, 2005); на конференції молодих вчених Інституту охорони здоров'я дітей та підлітків АМН України (Харків, 2005); на IV національному конгресі геронтологів та геріатрів України (Київ, 2005).

Публікації матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових робіт, серед яких 5 статей у фахових виданнях та 10 тез доповідей.

Структура и обсяг дисертації. Дисертаційна робота представлена на 157 сторінках машинописного тексту та складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів дослідження, висновків, списку використаної літератури, що містить 324 джерела. Робота ілюстрована 16 таблицями та 30 рисунками.

2. Основний зміст роботи

Огляд літератури

Огляд містить сучасні уявлення про особливості формування і роль ендогенних альдегідів у клітинному метаболізмі. Особлива увага приділяється розгляду можливих шляхів утилізації карбонільованих продуктів в окисних і відновних реакціях. Наведено характеристику ферментів альдокеторедуктазного субсімейства, що каталізують утилізацію альдегідів, в окисно-відновних реакціях (альдегідредуктази і альдегіддегідрогенази). Систематизовано і охарактеризовано дані про структуру і властивості вивчених ферментів. Відображено дані про особливості функціонування ферментів катаболізму альдегідів на різних етапах онтогенезу і можливі механізми регуляції їх активності. Проаналізовано сучасні дані відносно особливої ролі ферментів окисно-відновних перетворень альдегідів у захисті клітин від ушкоджуючої дії окислювального стресу.

Матеріали та методи дослідження

Дослідження було проведено на щурах лінії Вістар 5-ти вікових груп (1,5-, 2-, 6-, 12-, 24-місячних), яких утримували у стандартних умовах віварію. Кожна група, у свою чергу, поділялася на три підгрупи: 1 - інтактні, 2 - щури, що перебували під дією іммобілізаційного стресу, 3 - тварини, яким за 60 хвилин до іммобілізації парентерально вводили розчин екстракту аронії (Aronia melanocarpa) на фізіологічному розчині хлористого натрію в дозі 0,2 г/кг маси тіла (Ипатова О.И., Прозоровский В.Н., 2000).

Для моделювання іммобілізаційного стресу щурів позбавляли можливості рухатись прив'язуючи за кінцівки спиною до нерухомої опори (дошки). Експозиція - 30 хвилин. Ефективність відтворення іммобілізаційного стресу контролювали шляхом визначення концентрації адреналіну (Atrac С., Madnusson T.A., 1978) і 11-оксикортикостероїдів (Резников А.Г., 1980) у сироватці крові.

У зразках заморожених тканин печінки і скелетного м'яза визначали вміст продуктів вільнорадикального окислення ліпідів (дієнових кон'югатів і шифових основ) та карбонільованих білків. Вимірювання концентрації дієнових кон'югатів проводили за методом Стальной И.Д. (1977), використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції 2,2.105 М-1.см-1. Для кількісного визначення шифових основ використовували спектрофлюориметричний метод Rice-Evans C.A. et al. (1991). Виміри виконували на спектрофлюориметрі Hitachi (Японія) (довжина хвилі збудження - 360 нм, довжина хвилі емісії - 430 нм).

Визначення вмісту карбонільованих білків проводили у заморожених у рідкому азоті зразках тканини печінки і скелетного м'яза, а також в субклітинних фракціях з урахуванням коефіцієнта молярної екстинкції 2,1.104 М-1.см-1 (Дубинина Е.Е., 2000).

У мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях печінки і скелетного м'яза проводили визначення альдегіддегідрогеназної і альдегідредуктазної активностей. Для визначення активності альдегідредуктази 0,1 мл проби, що містила 0,3-1,0 мг білка, вносили у спектрофотометричну кювету, що містила (кінцеві концентрації) 0,05 М калій-фосфатний буфер з різним значенням рН, 0,01 М альдегід (пропіоновий або глутаровий), а також 0,0001 М NADН (NADРН). Швидкість реакції вимірювали за зміною оптичної щільності при 340 нм і визначали в нмоль/мг білка за 1 хв. У постмітохондріальній фракції печінки проводили дослідження кінетичних параметрів альдегідредуктазної реакції графічним методом.

Для визначення активності альдегіддегідрогенази 0,1 мл проби, що містила 0,5 - 1,0 мг білка, вносили в спектрофотометричну кювету, що містила (кінцеві концентрації) 0,05 М пірофосфатний буфер (рН 9,0), 0,01 М пропіоновий альдегід, а також 0,0005 М окислений NAD+ (0,025 М окислений NADР+), 0,0001 М піразол, 0,002 М ротенон. Швидкість реакції вимірювали за зміною оптичної щільності при 340 нм і виражали в нмоль/мг білка за 1 хв (Пирожков С.В., Панченко Л.Ф., 1988).

Концентрацію білка в пробах визначали за методом Lowry O. et al. (1955).

Результати досліджень статистично обробляли за методом Wilcoxon-Mann-Whitney [Лакин Г.Ф., 1990]. Вірогідними вважали результати при Р < 0,05.

3. Результати дослідження та їх обговорення

Дослідження показали, що в онтогенезі у щурів відбувається характерна зміна активності і властивостей ферментів, що каталізують реакції утилізації ендогенних альдегідів в окисно-відновних перетвореннях, які мають тканиноспецифічний характер.

Протягом першого року життя спостерігається поступове підвищення активності NADН-залежної альдегідредуктази з використанням різних субстратів в печінці (табл. 1,2).

Таблиця 1

Активність NADН-залежної альдегідредуктази (нмоль/мг білка за 1 хв) у печінці і скелетному м'язі щурів в реакції відновлення пропіонового альдегіду при іммобілізаційному стресі (M+m; n = 6)

Вікова група (міс)	Печінка	Скелетний м`яз
	інтактні	стрес	інтактні	стрес
1,5	22,4 ± 3,3	46,2 ± 4,1*	1,62 ± 0,40	1,42 ± 0,31
2	48,3 ± 6,1**	49,6 ± 7,2	0,41 ± 0,12**	0,41 ± 0,03
6	44,6 ± 7,1**	34,4 ± 7,0	0,42 ± 0,04**	1,42 ± 0,12*
12	95,5 ± 7,2**	50,5 ± 8,1*	1,61 ± 0,21	1,23 ± 0,31
24	61,3 ± 0,1**	98,1 ± 9,1*	1,53 ± 0,11	1,21 ± 0,11

Примітки: * Р < 0,05 до інтактних відповідного віку; ** Р < 0,05 до інтактних 1,5-місячних.

Таблиця 2

Активність NADН-залежної альдегідредуктази (нмоль/мг білка за 1 хв) у печінці щурів в реакції відновлення глутарового альдегіду при іммобілізаційному стресі (M+m; n = 6)

Вікова група (міс)	Інтактні	Стрес
1,5	28,2 ± 4,1	63,3 ±9,0 *
2	48,3 ± 9,3 **	56,4 ± 10,3
6	75,1 ± 10,1 **	35,2 ± 5,1 *
12	113,6 ± 6,2 **	86,4 ± 7,2 *
24	66,4 ± 3,0 **	87,3 ± 10,1 *

Примітки: * Р < 0,05 до інтактних відповідного віку; ** Р < 0,05 до інтактних 1,5-місячних.

Виникаючі зрушення у 2-, 6- і 12- місячних тварин доповнюються формуванням рН оптимуму альдегідредуктази, відповідного значенню 6,5 і виникненням ряду вікових особливостей у прояві регуляторних ефектів перекису водню і пропіонового альдегіду на цей фермент (рис. 1).

У старих тварин відбувається пониження активності NADН- і NADРН-залежної АР у печінці в порівнянні з 12-місячними щурами. У результаті цього в гепатоцитах тварин даної вікової групи формуються умови для гальмування швидкості утилізації альдегідів, що відповідає даним літератури (Pansarasa О. et al, 1999; Kasapoglu М., Ozben Т., 2001).

Рис. 1. Активність NADН-залежної альдегідредуктази при різних значеннях рН середи реакції в печінці щурів різного віку при іммобілізаційному стресі.

Примітки: * Р < 0,05 до інтактних відповідного віку; ** Р < 0,05 до інтактних 1,5-місячних.

Важливу роль в обмеженні активності АР печінки при старінні може мати зміна характеру регуляторного впливу на неї продуктів оксидативного стресу і, зокрема, посилення інгібуючого ефекту пропіоналю і, навпаки, зникнення активуючої дії перекису водню. Часткове інгібування АР в печінці щурів при старінні супроводжується виникненням цілого комплексу змін, до яких належать пониження величини рН оптимуму альдегідредуктазної реакції (див. рис. 1), а також підвищення швидкості відновлення глутатіонових кон'югатів альдегідів, як субстратів у порівнянні з аналогічними показниками у 12-місячних тварин.

Активність АЛДГ у печінці щурів всіх вікових груп значно нижче, ніж активність АР, що може вказувати на порівняно невисокий внесок окислювального шляху в утилізацію альдегідів у гепатоцитах (табл. 3).

фермент альдегід щур іммобілізація

Таблиця 3

Активність NAD-залежної альдегіддегідрогенази (нмоль/мг білка за 1 хв) в реакції окислення пропіонового альдегіду в субклітинних фракціях печінки щурів різного віку при іммобілізаційному стресі (M+m; n = 6)

Вікова група (міс)	Мітохондріальна фракція	Постмітохондріальна фракція
	інтактні	стрес	інтактні	стрес
1,5	3,8±0,8	2,1±0,5*	3,9 ± 0,4	6,7 ± 1,7
2	2,9 ± 0,8	2,5 ± 0,5	5,4 ± 0,5	3,9 ± 1,3
6	4,2 ± 1,1	3,8 ± 0,9	2,8 ± 0,4	2,9 ± 0,5
12	3,5 ± 0,8	1,6 ± 0,5	4,5 ± 0,4	4,7 ± 0,6
24	2,3 ± 0,4	1,3 ± 0,2*	2,9 ± 0,3	4,4 ± 0,5*

Примітки: * Р < 0,05 до інтактних відповідного віку; ** Р < 0,05 до інтактних 1,5-місячних.

На першому році життя в печінці щурів не відбувається істотних змін у загальній активності АЛДГ. До 24-місячного віку вона знижується в порівнянні з ії величиною у 12-місячних щурів. Це зрушення зумовлене зниженням активності ферменту в мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях печінки.

У процесі онтогенезу у м'язі модуляція активності вивчених ферментів катаболізму ендогенних альдегідів пов'язана головним чином зі зміною активності АЛДГ (табл. 4). Низька активність АР у м'язовій тканині вказує на порівняно невеликий внесок відновних перетворень в утилізацію альдегідів у міоцитах (див. табл. 2). В свою чергу, зміни загальної АЛДГ активності в стегновому м'язі мають залежний від віку характер. Однією з причин цього можуть бути особливості розподілу активності ферменту в різних субклітинних фракціях на різних етапах онтогенезу.

Таблиця 4

Активність NAD-залежної альдегіддегідрогенази (нмоль/мг білка за 1 хв.) в реакції окислення пропіонового альдегіду в субклітинних фракціях скелетного м'яза щурів різного віку при іммобілізаційному стресі (M+m; n = 6)

Вікова група (міс)	Мітохондріальна фракція	Постмітохондріальна фракція
	інтактні	стрес	інтактні	стрес
1,5	20,2 ± 3,1	7,4 ± 0,5*	2,7 ± 0,4	2,2 ± 0,4
2	2,3 ± 0,4	2,3 ± 0,8	3,6 ± 0,25	1,1 ± 0,1*
6	5,2 + 1,0	6,4 ± 1,5	4,1 ± 0,3	2,7 ± 0,4*
12	8,1 ± 2,1	5,0 ± 1,0	3,1 ± 0,6	4,1 ± 0,3
24	1,5 ± 0,3	1,5 ± 0,3*	3,9 ± 0,3	,7 ± 0,3*

Примітки:* Р < 0,05 до інтактних відповідного віку; ** Р < 0,05 до інтактних 1,5-місячних.

Загальна АЛДГ активність зі усіх досліджених груп максимально виражена у 1,5-місячних щурів. 80% від цієї величини складає активність мітохондріальної форми ензиму. У тварин інших досліджених вікових груп відбувається обмеження активності мітохондріальної АЛДГ порівняно з 1,5-місячними. Виникаючі зміни виявляються в зменшенні величини співвідношення активності АР/АЛДГ. У старих щурів низька величина активності АЛДГ в мітохондріях зумовлює шестиразове зниження величини співвідношення активності АЛДГ в мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях і дворазове зниження загальної активності АЛДГ у порівнянні з аналогічними показниками у 12-місячних щурів. Разом з тим у них спостерігається підвищення активності ензиму в постмітохондріальній фракції в порівнянні з 12-місячними.

Одержані дані указують на те, що протягом першого року життя в печінці щурів формуються умови для ефективної утилізації ендогенних альдегідів в окисно-відновних реакціях. Зрушення, що виникають в активності вивчених ферментів у печінці і стегновому м'язі у 24-місячних щурів, є однією з причин зниженої швидкості окисно-відновних перетворень ендогенних альдегідів в пізньому онтогенезі. Зміни швидкості утилізації карбонільних сполук сприяють модуляції стійкості клітин до вільнорадикального ушкодження при стресі (Е. Cadenas, K.J. Davies, 2000). Враховуючи це, далі було проведене визначення активності АР і АЛДГ у печінці і стегновому м'язі щурів різного віку при іммобілізаційному стресі.

Дослідження показали, що 30-хвилинна іммобілізація тварин різних вікових груп супроводжується різноспрямованими змінами активності АР у печінці. У 1,5- і 24-місячних щурів активність ферменту збільшується, у 6- і 12-місячних - знижується у порівнянні з початковою величиною. Разом з тим, при іммобілізації у тварин всіх вікових груп відбувається зміна швидкості відновлення глютатіонового кон'югата пропіоналя альдегідредуктазою (див. рис.1). Це зрушення відображує виникнення структурних перебудов в активному центрі ферменту, що закономірно приводить до зміни його властивостей. На користь цього припущення свідчить і той факт, що при іммобілізації на певних етапах онтогенезу спостерігається зміна характеру регуляторної дії перекису водню, яка доповнюється зміною ступеня прояву. Це відображається в посиленні інгібуючого впливу пропіонового альдегіду на фермент 1,5- і 12-місячних тварин, а також в ослабленні його ефекту, що інгібує, у 24-місячних щурів. Паралельно відбувається зниження активуючої дії перекису водню на АР печінки у 12-місячних тварин і, навпаки, поява її активуючого ефекту на активність ферменту старих щурів за умов іммобілізації. Одержані дані дають підставу для припущення про те, що характер регуляторних дій альдегідів і перекису водню на АР може визначати спрямованість і величину зміни активності ферменту в печінці за умов стресу.

Активація АР в печінці після 30-хвилинної іммобілізації у 1,5- і 24-місячних щурів доповнюється підвищенням загальної АЛДГ-активності. У основі даної зміни лежить стресова активація постмітохондріального ізоферменту АЛДГ (див. табл. 3). Разом з тим важливо відзначити, що у тварин даних вікових груп іммобілізація супроводжується частковим інгібуванням АЛДГ у мітохондріях.

У стегновому м'язі у 1,5-, 6- і 12-місячних щурів спостерігається зниження загальної АЛДГ-активності, зумовлене обмеженням активності АЛДГ у мітохондріях. При цьому в м'язовій тканині, на відміну від печінки, не було виявлено стресової активації постмітохондріального ізоферменту АЛДГ. На додаток до модуляції активності АЛДГ, у 6-місячних тварин відбувається 3,5-кратне підвищення АР у порівнянні з початковою величиною, а у решти досліджених за віком груп після іммобілізації активність АР істотно не змінюється. Дані зрушення в активності вивчених ферментів зумовлюють зниження величини співвідношення АР/АЛДГ в м'язовій тканині при іммобілізації.

Аналіз одержаних результатів свідчить про існування тканиноспецифічних особливостей у метаболізмі карбонільних сполук у печінці і стегновому м'язі. У печінці вони виявляються в домінуючій ролі альдегідредуктазної реакції, а в скелетному м'язі - в особливому значенні альдегіддегідрогеназної реакції в окисно-відновних перетвореннях ендогенних альдегідів. У процесі онтогенезу в обох досліджених тканинах зростає частка альдегідредуктазного шляху в метаболізмі альдегідів. Проте, механізм виникнення подібного зрушення в печінці і стегновому м'язі істотно розрізняється. У печінці він переважно пов'язаний з активацією АР, а в м'язовій тканині - з частковим інгібуванням мітохондріальної АЛДГ.

Виникнення зрушень в активності АР і АЛДГ зумовлює прояв максимальної ефективністі процесу утилізації ендогенних альдегідів в окисних і відновних шляхах в печінці у 12-місячному, а в стегновому м'язі - у 1,5-місячному віці. При старінні як в печінці, так і в скелетному м'язі формуються умови для зниження швидкості використання ендогенних альдегідів в альдегідредуктазній і альдегіддегідрогеназній реакціях у порівнянні з 12-місячними тваринами.

При іммобілізаційному стресі виникають залежні від віку тканиноспецифічні зрушення в активності ферментів, які каталізують окисно-відновні перетворення альдегідів. У печінці вони в більшій мірі пов'язані з модуляцією активності альдегідредуктази, а в м'язовій тканині - альдегіддегідрогенази. Оцінюючи можливі причини появи змін в активності досліджених ферментів у тканинах щурів при іммобілізаційному стресі, можна припустити особливу роль в цьому базального рівня окислювальної модифікації поліпептидного ланцюга молекули ферменту. Дане припущення підтверджується відомостями про те, що превентивне введення антиоксидантного препарату (екстракту аронії) попереджує виникнення у іммобілізованих тварин зрушень в активності АР і АЛДГ печінки (рис. 2, 3).

Виникаючі при стресі зміни в активності вивчених ферментів припускають модуляцію швидкості окислювально-відновних перетворень ендогенних альдегідів в печінці і м'язах. Проте рівень реалізації цих зрушень в зміні швидкості утилізації альдегідів в умовах in situ у тварин різних вікових груп істотно розрізняється.

Рис. 2. Вплив попереднього введення антиоксиданта (АО) на активність NADН-залежної альдегідредуктази постмітохондріальної фракції печінки щурів різного віку при іммобілізаційному стресі.

Примітка: * Р < 0,05 до іммобілізованих тварин відповідного віку.



Рис. 3. Вплив попереднього введення антиоксиданта (АО) на зміну активності NAD-залежної альдегіддегідрогенази в субклітинних фракціях печінки щурів різного віку, підданих іммобілізаційному стресу.

Примітки: А - мітохондріальна фракція; Б - постмітохондріальна фракція; * Р < 0,05 до іммобілізованих тварин відповідного віку.

На це, зокрема, вказують дані про накопичення шифових основ у печінці і м'язах щурів різного віку при іммобілізації (рис. 4).

Представлені результати можуть свідчити про те, що активність ферментів катаболізму ендогенних альдегідів у щурів першого року життя виявляється достатньою для попередження у них накопичення в печінці і скелетному м'язі при іммобілізаційному стресі ендогенних альдегідів. У 1,5-місячних тварин, що мають порівняно низьку базальну активність альдегідредуктази, це забезпечується додатковою стресовою активацією ферменту. Разом з тим, стан адаптивних можливостей альдегідредуктази печінки щурів даної вікової групи при сильних стресових діях на організм вимагає спеціального вивчення.

У старих щурів, не зважаючи на виникнення компенсаторної активації альдегідредуктази і альдегіддегідрогенази, при стресі відбувається накопичення карбонільних продуктів метаболізму в печінці і м'язах. Це, ймовірно, служить одним із проявів феномена дезадаптації метаболізму в пізньому онтогенезі.

Таким чином, в процесі онтогенезу у щурів відбувається зміна ефективності функціонування ферментів, каталізуючих окисно-відновні шляхи утилізації карбонільних сполук метаболізму в тканинах внутрішніх органів за умов іммобілізаційного стресу. Вона виявляється у виникненні своєрідної "напруги" у відновленні альдегідів в альдегідредуктазній реакції у печінці 1,5-місячних тварин, а також гальмуванні їх перетворень в альдегідредуктазній і альдегіддегідрогеназній реакціях у печінці і скелетних м'язах старих щурів.

Рис. 4. Вміст шифових основ (у %) в печінці і скелетному м'язі у щурів, підданих іммобілізаційному стресу.

Примітки: концентрація шифових основ у інтактних тварин в кожній віковой групі прийнята за 100%; * Р < 0,05 до інтактних тварин відповідного віку.

Вікове зниження ефективності утилізації ендогенних альдегідів в тканинах внутрішніх органів виступає в ролі одного з чинників зниження їх стійкості до ушкоджуючих факторів стресу. В зв'язку з цим, перспективним напрямом у захисті тканин від вільнорадикального ушкодження при стресі є розробка заходів, які направлені на підвищення швидкості утилізації ендогенних альдегідів. Даний підхід є новим напрямком в антіоксидантній терапії, який має великі перспективи в лікуванні захворювань, пов'язаних з формуванням окислювального стресу в організмі. Ймовірно, його ефективність може істотно різнитися в процесі онтогенезу і в більшій мірі виявлятися під час препубертатного періоду і при старінні.

Висновки

У результаті проведених експериментів було встановлено вікові і тканиноспецифічні особливості зміни активності ферментів, що беруть участь в окисно-відновних перетвореннях ендогенних альдегідів у печінці і скелетному м'язі щурів. Ці особливості зумовлюють зміну стійкості тканин внутрішніх органів до дії ушкоджуючих факторів іммобілізаційного стресу. За результатами дослідження були зроблені наступні висновки:

1. У період з 1,5- по 12-місячний вік у печінці щурів відбувається поступове підвищення активності АР, яке супроводжується формуванням оптимуму рН реакції, відповідного значенню 6,5, і характерною зміною регуляторних ефектів на фермент пропіонового альдегіду і перекису водню. У 24-місячному віці активність АР знижується в порівнянні з ії величиною у 12-місячних тварин. Ці зміни зумовлюють провідну роль редуктазного шляху в окисно-відновних перетвореннях альдегідів у гепатоцитах і відображаються в поступовому підвищенні співвідношення активності АР/АЛДГ у постмітохондріальній фракції на дослідженому етапі онтогенезу.

2. У м'язовій тканині основний внесок у величину базальної активності досліджених ензимів у 1,5-, 6-, і 12-місячних щурів робить мітохондріальний ізофермент АЛДГ. При цьому зміни активності ферменту окисних перетворень ендогенних альдегідів мають залежний від віку характер. Максимальна величина активності мітохондріального ізоферменту АЛДГ у 1,5-місячних тварин зумовлює у них формування умов для найбільшої ефективності окислювальних перетворень ендогенних альдегідів. У період від 1,5- до 24- місячного віку спостерігається зниження активності АЛДГ в мітохондріях, найбільш виражене у 24-місячних тварин.

3. За умов іммобілізаційного стресу у щурів 1,5- і 24-місячного віку відбувається підвищення активності АР і АЛДГ в постмітохондріальній фракції печінки, а також часткове інгібування мітохондріальної АЛДГ. Стресова активація АР супроводжується проявом активуючого впливу перекису водню на ензим печінки старих щурів і посиленням інгібуючоі дії пропіоналю на фермент у 1,5-місячних щурів. При іммобілізації 12-місячних тварин відбувається обмеження активності АР, яке супроводжується характерними зрушеннями в прояві на неї дії регуляторних ефектів пропіоналю і перекису водню.

4. Іммобілізація 1,5-, 6- і 12-місячних щурів супроводжується зниженням загальної АЛДГ-активності стегнового м'яза, яке зумовлено частковим інгібуванням мітохондріального ізоферменту, що зумовлює підвищення ролі редуктазного шляху при стресі у тварин даних вікових груп. АР активність у м'язовій тканині при іммобілізаційному стресі практично не піддана модуляції, на відміну від тканини печінки.

5. У щурів першого року життя в печінці і стегновому м'язі при іммобілізаційному стресі не відбувається накопичення продуктів метаболізму альдегідів (ШО), що відображує високу ефективність функціонування ферментів катаболізму ендогенних альдегідів. У старих щурів, не зважаючи на стресову активацію АР і АЛДГ в печінці і стегновому м'язі, відбувається накопичення карбонільних сполук метаболізму.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

Фомина Е.В., Давыдов В.В. Особенности влияния рН на альдегидредуктазную активность печени крыс разного возраста, подвергнутых иммобилизационному стрессу // Украинский биохимический журнал. - 2004. - Т. 76, №6. - С. 77-81. (Дисертант брала участь в моделюванні іммобілізаційного стресу у тварин, вимирювала активність альдегідредуктази в постмітохондріальної фракції печінки у щурів різного віку при різних значеннях рН середовища).

Фомина Е.В., Давыдов В.В. Альдегідредуктазная активность печени крыс разного возраста при иммобилизационном стрессе // Проблемы старения и долголетия. - 2004. - Т. 13, №4. - С. 510-517. (Дисертантом було проведено виділення і фракціонування тканини печінки та проводилося вимірування активності альдегідредуктази у постмітохондріальної фракції печінки у щурів різного віку при іммобілізації).

Фомина Е.В., Давыдов В.В. Тканеспецифические особенности изменения активности альдегідредуктазы и альдегіддегидрогеназы у крыс при иммобилизационном стрессе // Успехи геронтологии - 2005. - №17. - С. 55-60. (Дисертант визначала активність альдегідредуктази і альдегіддегідрогенази в субклітинних фракціях печінки і скелетного м`яза печінки у щурів різного віку при іммобілізації).

Фомина Е.В., Давыдов В.В. Возрастные особенности изменения активности NAD-зависимой альдегіддегидрогеназы в печени и скелетной мышце крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу // Проблемы старения и долголетия - 2005. - №2. - С. 122-130. (Дисертант визначала активність альдегідредуктази і альдегіддегідрогенази в субклітинних фракціях печінки і скелетного м`яза печінки у щурів різного віку при іммобілізації).

5. Фомина Е.В., Давыдов В.В. Возрастные особенности функционирования альдегідредуктазы в печени и скелетной мышце крыс при иммобилизационном стрессе // Вопр. биол., мед. и фарм. химии. - №2. - 2005. - С. 27-31. (Дисертант визначала вміст продуктів вільнорадикального окислення білків і ліпідів в субклітинних фракціях печінки та скелетного м`яза).

6. Фомина Е.В., Давыдов В.В., Чуйкова В.И. Роль ферментов катаболизма альдегідов в возрастном изменении устойчивости тканей к окислительному стрессу // Тезисы докладов международного симпозиума "Биологические механизмы старения". - Харьков. - 2002. - С. 40.

7. Фомина Е.В., Суворова И.М., Чуйкова В.И. Возрастные особенности формирования оксидативного стресса в мозге и сердце крыс разного возраста в процессе иммобилизации // Материалы IV Украинской конференции молодых ученых, посвященных памяти академика В.В. Фролькиса. - Киев - 2003. - С. 34-35.

8. Фомина Е.В. Возрастные особенности формирования оксидативного стресса в печени и скелетной мышце крыс, подвергнутых кратковременной иммобилизации // Тезисы научно-практической конференции "Биология - наука ХХI века". - Пущино. - 2004. - С. 132. (Дисертантом було проведено визначення вмісту продуктів вільнорадикального окислення ліпідів (диєнових кон`югатів и шифових основ) у крові і гомогенатах печінки і скелетного м`яза у щурів різного віку, підданих іммобілізації).

9. Фомина Е.В. Возрастные особенности изменения активности альдегідредуктазы в печени крыс при иммобилизационном стрессе // В материалах YI международного симпозиума "Биологические механизмы старения". - Харьков. - 2004. - С. 29-30.

10. Фоміна О.В. Активність ферментів катаболізму альдегідів печінки щурів різного віку при короткочасному стресі // Матеріали науково-практичної конференції "Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини". - Харків. - 2004. - С. 87.

11. Фоміна О.В. Изучение защитного действия экстракта аронии при оксидативном стрессе // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю "Ліки - людині. Сучасні проблеми створення, дослідження і апробації лікарських засобів". - Харків. - 2004. - С. 152-153.

12. Fomina E.V., Davydov V.V Differential changes in the properties of aldehyde reductase from adult and old rats liver during immobilized stress // Society of Free Radical Biology and Medicine. - Washington. - 2004. - Р. 427.

13. Фоміна О.В. Вікові особливості регуляції активності альдегідредуктази печінки щурів після іммобілізації // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю "Від фундаментальних досліджень - до прогресу в медицині". - Харків. - 2005. - С. 64.

14. Фомина Е.В. Возрастные особенности изменения активности альдегідредуктазы и альдегіддегидрогеназы в печени и мышце крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу // Материалы VI Украинской конференции молодых ученых, посвященной памяти академика В.В. Фролькиса. - Киев. - 2005. - С. 183-184.

15. Фомина Е.В., Давыдов В.В., Фурменкова Н.В. Активность ферментов утилизации энодогенных альдегидов при иммобилизационном стрессе у крыс разного возраста // Материалы IV национального конгресса геронтологов и гериатров Украины "Проблемы старения и долголетия". - Киев. - 2005. - С. 19-20.

Размещено на Allbest.ru