Са2+-транспортувальні системи секреторних клітин слинних залоз личинки drosophila melanogaster

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Іони Са2+ є важливими вторинними внутрішньоклітинними посередниками (Костюк, 1986; Berridge, Bootman, Lipp, 1998), зростання концентрації яких у цитозолі активує різноманітні клітинні процеси - скорочення м'язів (Шуба, 1981; Костерин, 1990; Бабіч, 1999), секрецію ферментів, гормонів (Гринькив, Клевец, Шостаковская, 1988; Дубицький, Шостаковська, 1992; Augustine et al., 1996; Ambudkar, 2000) і медіаторів (Augustine, 2001), запліднення (Jones et al., 2000) і ембріогенез (Webb, Miller, 2006), транскрипцію генів (Hardingham et al., 1997), апоптоз (Szalai, Krishnamurthy, Hajnoczky, 1999) тощо. У стані спокою цитозольна концентрація іонізованого Са2+ є надзвичайно низькою, хоча у позаклітинному просторі є порівняно високою. Це досягається завдяки узгодженому функціонуванню різноманітних типів Са2+-транспортувальних систем (каналів, обмінників, помп), які модулюють цитозольну концентрацію іонів Са2+ (Berridge, 1993).

Са2+-сигналізація є важливою умовою функціонування екзокринних клітин, особливо у регулюванні процесу секреції макромолекул і рідини (Ashby, Tepikin, 2002). Поряд із дослідженнями механізмів підтримання Са2+-гомеостазу в екзокринних залозах хребетних особливе місце займають малоклітинні залози безхребетних тварин. Цьому сприяють практичні аспекти застосування цих об'єктів, головним чином, завдяки особливостям будови їх слинних залоз. Зокрема, досить детально досліджено важливість Са2+-сигналізації у малоклітинних слинних залозах Calliphora erythrocephala (Berridge, Patel, 1968; Berridge, 1970; Fain, Berridge, 1979; Berridge, 1981; Berridge, 1982; Zimmermann, Walz, 1997; Zimmermann, Walz, 1999), Calliphora vicina (Zimmermann, 2000; Zimmermann et al., 2003; Dames et al., 2006; Schmidt, Baumann, Walz, 2008), Periplaneta americana (Lang, Walz, 1996; Hille, Walz, 2006), Chironomus plumosus (Клевец, Гураль, 1990; Клевець, Манько, 1992; Клевец, Манько, Федирко, 1996; Манько, Король, Клевець, Демків, 2000; Манько, Клевець, Ларіна, Стельмах, 2001; Манько, Бичкова, Клевець, 2004; Манько, Великопольська, 2005; Манько, 2006).

Одним із найважливіших модельних організмів у біологічних дослідженнях загалом є плодова мушка Drosophila melanogaster (Ashburner, Bergman, 2005). Основною перевагою використання цього об'єкта на практиці є завершене секвенування його геному, до складу якого входить більше 14 000 генів (Adams et al., 2000; Ashburner, Bergman, 2005). Це відкрило для дослідників Drosophila melanogaster нові можливості для з'ясування тих чи інших наукових аспектів життєдіяльності цього організму. Са2+-сигналізація відіграє важливу роль у функціонуванні різних органів Drosophila. З використанням різних методів у тканинах личинок і дорослих особин Drosophila melanogaster ідентифіковано ряд Са2+-транспортувальних систем, до яких належать ріанодин- та інозитол-1,4,5-трифосфатчутливі Са2+-канали внутрішньоклітинних депо (Hasan, Rosbash, 1992; Arnon et al., 1997; Sinha, Hasan, 1999; Venkatesh et al., 2001; Blumеnthal, 2001; Vazques-Martinez, 2003), потенціалкеровані Са2+-канали (Eberl et al., 1998; MacPherson et al., 2001) і TRP-канали плазматичної мембрани (Montell, Rubin, 1989; McPherson et al., 2001), Na+-Ca2+-обмінник (Ruknudin et al., 1997; Schwarz, Benzer, 1997), Са2+-помпа мембрани ендоплазматичного ретикулуму (Vazques-Martinez, 2003). Але немає жодних експериментальних підтверджень їх експресії у слинних залозах личинки Drosophila.

У дисертаційній роботі вперше ідентифіковано й охарактеризовано Са2+-транспортувальні системи секреторних клітин слинних залоз личинки Drosophila melanogaster.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках науково-дослідної теми у межах робочого часу викладачів кафедри фізіології людини і тварин Львівського національного університету імені Івана Франка “Особливості функціонування та регуляції Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин малоклітинних залоз” (2007-2009 рр., № держреєстрації 0106U005902, науковий керівник д.б.н., доц. Манько В.В.), а також за сприяння Національного Центру Біологічних Наук у м. Бангалор, Індія.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала в ідентифікації й охарактеризуванні Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин слинних залоз личинки Drosophila melanogaster.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

1) дослідити вплив гіперкалієвої деполяризації плазматичної мембрани на вміст депонованого Са2+ у секреторних клітинах слинних залоз личинки Drosophila за дії блокаторів потенціалкерованих Са2+-каналів;

2) перевірити, як змінюється концентрація цитозольного Са2+ у секреторних клітинах слинних залоз за впливу гіперкалієвого середовища;

3) встановити залежність вмісту депонованого Са2+ від АТФ у різних концентраціях у секреторних клітинах слинних залоз, інкубованих у базовому вихідному та безкальцієвому середовищах;

4) дослідити вплив ріанодину і тапсигаргіну у різних концентраціях на зміни вмісту депонованого Са2+ у секреторних клітинах слинних залоз;

5) з'ясувати, чи експресуються у слинних залозах личинки Drosophila гени Itp-r83A, Са-Р60А, olf186-F, які кодують структуру молекул інозитол-1,4,5-трифосфатчутливого Са2+-каналу, Са2+-помпи мембрани ендоплазматичного ретикулуму і білка Orai плазматичної мембрани;

6) дослідити депокерований вхід іонів Са2+ у секреторні клітини досліджуваних залоз.

1. Матеріали і методи досліджень

Дослідження проведені на слинних залозах личинки Drosophila - парних прозорих мішкоподібних утворах, розміщених з боків глотки і оточених жировим тілом (Белоконь, 1979). Для визначення вмісту Са2+ у внутрішньоклітинних депо (ендоплазматичному ретикулумі, мітохондріях тощо) застосовували Са2+-чутливий флуоресцентний барвник хлортетрациклін. Ці дослідження проводили на слинних залозах личинок Drosophila melanogaster дикого типу Oregon. Їх вирощували на поживному агарозному середовищі при температурі 22-25 °С. Слинні залози виділяли із личинок третього вікового періоду у базовому вихідному розчині.

Про наявність Са2+-транспортувальних систем судили на підставі аналізу зміни вмісту депонованого Са2+ у тканині ізольованих залоз, інкубованих у контрольному (базовому вихідному чи безкальцієвому) та дослідних розчинах протягом 15 хв при кімнатній температурі (18-20 °С). Базовий розчин містив (ммоль/л): NaCl - 146,46, KCl - 3,58, CaCl2 - 3,15, Na2HPO4 - 0,35, KH2PO4 - 0,44, MgCl2 - 1, глюкоза - 5,55; рН 7,2. Потенціалкеровані Са2+-канали активували гіперкалієвою деполяризацією плазматичної мембрани ([K+]e = 100 ммоль/л). Для ідентифікації потенціалкерованих Са2+-каналів використовували їхні неспецифічні та специфічні блокатори: LaCl3 (1, 10, 50 і 100 мкмоль/л), ніфедипін (0,1, 1 та 10 мкмоль/л) і верапаміл (10 мкмоль/л). Пуринові рецептори плазматичної мембрани активували за участю АТФ (0,1 та 1 ммоль/л). Для дослідження змін вмісту депонованого Са2+ під впливом блокатора Са2+-помпи ендоплазматичного ретикулуму тапсигаргіну (1 і 10 мкмоль/л) його додавали до базового розчину. Для ідентифікації ріанодинчутливих Са2+-каналів використовували ріанодин (5 і 500 нмоль/л). Наприкінці інкубування слинних залоз у контрольному і дослідних розчинах їх фарбували хлортетрацикліном протягом 25 хв, який у концентрації 2 мкмоль/л додавали до розчинів інкубування. Після відмивання залоз від барвника визначали інтенсивність флуоресценції (лф = 480-530 нм) у різних мікроділянках залози за допомогою люмінесцентного мікроскопа ЛЮМАМ-И-1 (Росія): лзб. = 380 нм.

Про зміни вмісту цитозольного Са2+ судили на основі змін флуоресценції Са2+-чутливого флуоресцентного і генетично кодованого білка G-CaMP1.6 у секреторних клітинах слинних залоз відповідної лінії Drosophila melanogaster. В цій серії експериментів також використовували безкальцієвий розчин, у якому 1 ммоль/л CaCl2 заміняли ЕГТА (1 ммоль/л). Для спустошення внутрішньоклітинних депо Са2+ секреторних клітин використовували тапсигаргін (10 мкмоль/л) та іономіцин (10 мкмоль/л). Са2+-залежні зміни флуоресценції білка G-CaMP1.6 досліджували за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопа Olympus Fluoview1000 (Olympus, Japan), використовуючи об'єктив 10Ч/NA0.4, або Yokogawa spinning disс - Andor&Olympus (Yokogawa/Andor/Olympus, Japan) із об'єктивом 20Ч/NA0,7 (лзб. = 488 нм). Протягом кожного з експериментів у полі зору фокусували ділянку залози, що складалась приблизно із 10-15 клітин, і сканували її у часі: 3-5 хв - у контролі, а після додавання іономіцину, тапсигаргіну або СаСl2 - ще 20 хв.

Для того, щоб встановити експресію генів, які кодують структуру молекул Са2+-транспортувальних систем, застосували метод виділення сумарної РНК із тканини залоз, зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції за стандартною методикою (Sambrook, Russell, 2001), використовуючи лінію плодових мух дикого типу Canton-S. Полімеразну ланцюгову реакцію проводили на ампліфікаторі 96 Well Thermal Cycler, Veriti 9902 (Applied Biosystems, США) протягом 30 циклів і відповідному температурному режимі. Продукти полімеразної ланцюгової реакції візуалізували на 1,2 % агарозному гелі за допомогою етидію броміду (1 мкг/мл). За контроль вважали експресію гена рибосомального білка 49 (Rp49).

Для оцінки достовірності різниці між статистичними характеристиками двох альтернативних сукупностей даних визначали коефіцієнт Стьюдента (t), а вірогідними вважали зміни при показнику достовірності P?0,05.

2. Результати досліджень та їхнє обговорення

1. Ідентифікація потенціалкерованих Са2+-каналів

Гіперкалієва деполяризація плазматичної мембрани є одним із найпоширеніших експериментальних способів активації потенціалкерованих Са2+-каналів у клітинах різних типів. Ми дослідили вплив гіперкалієвого середовища ([K+]е = 100 ммоль/л) на вміст депонованого Са2+ у секреторних клітинах слинних залоз личинки Drosophila. За умови гіперкалієвої деполяризації плазматичної мембрани вміст Са2+ статистично достовірно (Р ? 0,05, n = 9) підвищувався відносно контролю на 51 %. Очевидно, за гіперкалієвої деполяризації плазматичної мембрани активуються потенціалкеровані Са2+-канали. Хоча зростання вмісту Са2+ у тканині залоз може бути наслідком його надходження у клітину і за рахунок зворотного режиму функціонування системи Na+-Ca2+-обміну, яка є чутливою до змін мембранного потенціалу (Blaustein, Lederer, 1999; Манько, 2006). Про можливу наявність Na+-Ca2+-обмінника у секреторних клітинах залоз личинки свідчить той факт, що за їх інкубування у гіпонатрієвому середовищі ([Na+]e = 16 ммоль/л) вміст Са2+ статистично достовірно підвищувався на 23 %. Тому для з'ясування того, що при гіперкалієвій деполяризації плазматичної мембрани іони Са2+ проникають у секреторні клітини слинних залоз личинки дійсно через потенціалкеровані Са2+-канали, на наступному етапі досліджень ми використали їхні неспецифічні та специфічні блокатори.

Встановлено, що стимульований гіперкалієвою деполяризацією вхід Са2+ у секреторні клітини слинних залоз личинки Drosophila внаслідок додавання до розчину інкубації La3+ лише у концентрації 50 мкмоль/л статистично достовірно пригнічувався на 12,12 %. Тим не менше, пригнічення катіонами La3+ стимульованого гіперкалієвою деполяризацією входу Са2+ у клітини залоз ще не може служити доказом його надходження через потенціалкеровані Са2+-канали, оскільки і Na+-Ca2+-обмінник (Trosper, Philipson, 1983; Клевець, Манько, Гальків, Федірко, 1995; Blaustein, Lederer, 1999) і, особливо, Са2+-помпа плазматичної мембрани (Herscher, Rega, 1997) характеризується значною чутливістю до них.

Під впливом ніфедипіну (0,1 мкмоль/л) не спостерігалося статистично достовірних змін вмісту Са2+ у слинних залозах, інкубованих у базовому вихідному середовищі. Проте за його наявності у середовищі інкубування гіперкалієва деполяризація плазматичної мембрани спричиняла статистично достовірне (Р < 0,05, n = 8-9) зростання вмісту Са2+ на 37 %. До того ж, за відсутності блокатора спостерігали статистично достовірне (Р < 0,05, n = 8-9) підвищення його вмісту у слинних залозах під впливом гіперкалієвого середовища на 54 %. Отже, за наявності у середовищі ніфедипіну відбувається пригнічення входу Са2+ у секреторні клітини слинних залоз, спричиненого гіперкалієвою деполяризацією.

За наявності у середовищі інкубування верапамілу (10 мкмоль/л) вміст Са2+ у депо під впливом гіперкалієвої деполяризації плазматичної мембрани статистично достовірно не змінювався. Хоча за відсутності блокатора вміст Са2+ під впливом гіперкалієвої деполяризації статистично достовірно (Р < 0,05, n = 16) підвищувався на 11 %.

Те, що гіперкалієва деполяризація плазматичної мембрани не спричиняла статистично достовірних змін вмісту Са2+ у депо за наявності у середовищі інкубування верапамілу, служить функціональним підтвердженням наявності потенціалкерованих Са2+-каналів у секреторних клітинах слинних залоз личинки Drosophila.

Оскільки зростання рівня флуоресценції Са2+-ХТЦ-комплексу відображає зростання його депонованого рівня (Caswell, Hutchison, 1971; Caswell, Warren, 1972; Манько, 2008), пряма реєстрація змін цитозольного Са2+ дозволяє детальніше з'ясувати вклад потенціалкерованих Са2+-каналів у підвищення його концентрації у цитозолі. Для підтвердження наявності потенціалкерованих Са2+-каналів у плазматичній мембрані секреторних клітин слинних залоз личинки Drosophila ми проаналізували зміни концентрації цитозольного Са2+ під впливом гіперкалієвої деполяризації за допомогою флуоресцентного Са2+-індикатора G-CaMP1.6.

Нами встановлено, що внаслідок збільшення [K+]e до 100 ммоль/л вміст цитозольного Са2+ статистично достовірно (Р ? 0,001, n = 35) підвищувався на 27 %.

Цікаво, що підвищення флуоресценції G-CaMP1.6 мало різний характер навіть у межах однієї слинної залози.

Зокрема, у 60 % усіх досліджених клітин зростання вмісту цитозольного Са2+ було транзієнтним і тривало 328,8 ± 12,84 с. Швидкість наростання цього транзієнта виявилася статистично достовірно (n = 21, Р ? 0,001) більшою на 62 % від швидкості його спадання. Це може свідчити про те, що висхідна його частина зумовлена пасивним транспортуванням Са2+, очевидно, потенціалкерованими Са2+-каналами плазматичної мембрани. Низхідна частина піку відображає, мабуть, активне транспортування Са2+ у внутрішньоклітинні депо або/і назовні клітини. В інших випадках (40 % секреторних клітин) спостерігалося нетранзієнтне зростання рівня Са2+, що, на нашу думку, може маскуватися його надходженням системою Na+-Ca2+-обміну плазматичної мембрани у зворотному режимі функціонування.

Отже, потенціалкеровані Са2+-канали секреторних клітин слинних залоз личинки Drosophila є чутливі до фармакологічних блокаторів типу фенілалкіламінів і менш чутливі - до дигідропіридинів. В епітеліальних клітинах екскреторних органів Drosophila було встановлено експресію генів, що кодують структуру молекули б1-субодиниці потенціалкерованого Са2+-каналу, який виявився чутливим до дигідропіридинів і фенілалкіламінів (McPherson et al., 2001). Тому, на нашу думку, ідентифіковані потенціалкеровані Са2+-канали секреторних клітин слинних залоз личинки Drosophila melanogaster за їх чутливістю до фармакологічних сполук цих класів належать до L-типу.

2. Ідентифікація пуринових рецепторів плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз

Надходження іонів Са2+ у клітину із позаклітинного середовища може відбуватися не тільки за участю потенціалкерованих, але й рецепторкерованих Са2+-каналів у плазматичній мембрані. До них належать так звані P2-рецептори, що активуються позаклітинним АТФ (Ralevic, Burnstock, 1998). Для ідентифікації пуринових рецепторів у секреторних клітинах ми використали АТФ у різних концентраціях. Під впливом АТФ у концентрації 0,1 ммоль/л спостерігали незначне статистично достовірне (Р < 0,05, n = 6-8) підвищення вмісту депонованого Са2+ на 31 % у слинних залозах, інкубованих у базовому вихідному середовищі.

Очевидно, підвищення вмісту Са2+ спричинене надходженням цих іонів у клітину за участю Р2X-рецепторів, що функціонують як Са2+-провідні канали у плазматичній мембрані (Ralevic, Burnstock, 1998). Одночасно можуть активуватися і Р2Y-рецептори. Але за наявності іонів Са2+ у позаклітинному середовищі під впливом АТФ переважають ті процеси, які ініціюються активацією P2X-рецепторів - надходженням Са2+ у клітину та його депонуванням. Цікавим виявився той факт, що АТФ у концентраціях 0,1 та 1 ммоль/л за інкубування слинних залоз у безкальцієвому середовищі викликав неочікуване і статистично достовірне (Р < 0,01, n = 8-10) підвищення вмісту депонованого Са2+, але на 19 і 16 % відповідно (рис. 3). Очевидно, за таких умов рівновага під впливом АТФ зміщується, все таки, до процесів вивільнення цих катіонів ІФ3-чутливими Са2+-каналами, спряженими із Р2Y-рецепторами, хоча його надходження P2X-рецепторами у клітини ще переважає. Це може бути спричинене тим, що безкальцієвий розчин не містив жодних Са2+-хелаторів. Крім того, підвищення вмісту депонованого Са2+ може бути наслідком його закачування, за участю Са2+-уніпортера, у мітохондрії, оскільки відомо, що ІФ3-чутливі Са2+-канали знаходяться у тісному функціональному зв'язку з цими органелами (Rizzuto, Duchen, Pozzan, 2004; Манько, 2008).

Отримані результати свідчать про те, що на плазматичній мембрані секреторних клітин слинних залоз личинки Drosophila наявні пуринові рецептори.

3. Експресія гена Itp-r- 83A у секреторних клітинах

Відомо, що активація Р2Y-рецепторів за участю нуклеотидів впливає або на аденілатциклазу, підвищуючи рівень цАМФ у клітині, або на фосфоліпазу С, спричинюючи генерацію ІФ3 (Ralevic, Burnstock, 1998). Для того, щоб встановити експресію гена, який кодує структуру молекули ІФ3-чутливого рецептора у слинних залозах, ми застосували методи молекулярної біології. Полімеразна ланцюгова реакція специфічної матричної РНК слинних залоз ампліфікувала фрагмент кодуючої ДНК гена Itp-r-83A.

Важливо, що цей траснкрипт виявився меншого розміру (180 п.н.), ніж аналогічний Itp-r-83A-транскрипт матричної РНК тканин личинки загалом (233 п.н.; рис. 4, доріжка 5). Очевидно, у слинних залозах відбувається специфічний сплайсинг матричної РНК гена Itp-r-83A, розмір транскрипту якого дещо відрізняється від загального Itp-r-83A-транскрипту матричної РНК тканин личинки загалом.

Отже, експресія гена Itp-r-83A у слинних залозах личинок Drosophila може свідчити про те, що як і в хребетних організмів (Ashby, Tepikin, 2002) ІФ3-чутливий Са2+-канал також вносить свій внесок у функціонування екзокринних секреторних органів Двокрилих.

4. Ідентифікація депокерованого входу Са2+ у секреторні клітини

Відомо, що основним шляхом надходження Са2+ в електронезбудливі клітини є депокерований, або ємнісний (Parekh, Putney, 2005), при якому спустошення внутрішньоклітинних депо активує Са2+-канали плазматичної мембрани (Putney, 2007). Його ідентифіковано у багатьох незбудливих, зокрема, і секреторних клітинах. Проте немає відомостей про його наявність у слинних залозах личинки Drosophila, що було основною метою цих досліджень.

Методами зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції ми отримали транскрипт гена olf186-F специфічної матричної РНК із слинних залоз личинки Drosophila (рис. 4, доріжка 2). Слід зазначити, що він виявився такого ж розміру (270 п.н.), як і аналогічний ампліфікований фрагмент ДНК матричної РНК із тканин личинок загалом (рис. 4, доріжка 3). Встановлення експресії гена olf186-F може свідчити про важливе значення депокерованого входу іонів Са2+ у ці секреторні клітини для процесів Са2+-сигналізації і здійснення притаманних їм фізіологічних функцій, наприклад, секреції слини.

На цьому етапі досліджень ми вирішили отримати функціональне підтвердження цього припущення із застосуванням методів конфокальної мікроскопії. Для пасивного спустошення внутрішньоклітинних депо Са2+ секреторних клітин слинних залоз личинки Drosophila використали іономіцин (10 мкмоль/л). Внаслідок обробки слинних залоз іономіцином спостерігали статистично достовірне (Р < 0,01, n = 30), але незначне і нетранзієнтне підвищення флуоресценції на 11 %.

Середньоарифметична тривалість транзієнта, розрахована від 30-ти клітин, становила 378,0 ± 25,2 с. Швидкість його наростання виявилася статистично достовірно (n = 30, Р ? 0,001) більшою на 80 % від швидкості спадання, що може свідчити про пасивний характер входу Са2+ у клітини, очевидно, за участю депокерованих Са2+ каналів; низхідна частина піку відображає, мабуть, активне транспортування Са2+ у внутрішньоклітинні депо, наприклад, мітохондрії.

За дії тапсигаргіну (10 мкмоль/л) на слинні залози, інкубовані у безкальцієвому середовищі, рівень флуоресценції статистично достовірно (Р ? 0,05, n = 51) нетранзієнтно підвищувався на 35 % (рис. 6). На відміну від цього, збільшення позаклітинної концентрації Са2+ у всіх випадках спричиняло статистично достовірне (Р < 0,001, n = 51) транзієнтне зростання рівня флуоресценції - в середньому на 89 %.

Слід зазначити, що ці транзієнти мали складний характер і суттєво відрізнялися за своїми часовими й амплітудними параметрами навіть у межах однієї залози. Унаслідок сумації швидких і повільних транзієнтів від різних клітин Са2+-сигнал, зареєстрований від фрагмента залози, має виражене плато (тривалістю 60 с). Вторинне підвищення флуоресценції від фрагмента залози є відображенням послідовної сумації нетранзієнтних підвищень флуоресценції, зареєстрованих від поодиноких клітин.

Цікаво, що за відсутності тапсигаргіну внаслідок заміни безкальцієвого Са2+-вмісним розчином рівень флуоресценції статистично достовірно (Р < 0,001, n = 30) транзієнтно зростав у всіх клітинах лише на 38%.

Крім того, швидкість його наростання виявилася на 65% меншою (n = 30, Р ? 0,001) від швидкості наростання транзієнта, спричиненого позаклітинним Са2+ (2 ммоль/л) після обробки залоз іономіцином.

Наведені вище дані свідчать, що у секреторних клітинах слинних залоз личинки Drosophila наявна система депокерованого входу Са2+. Цілком можливо, що у депокерованому надходженні Са2+ у ці секреторні клітини важливу роль відіграє трансмембранний білок Orai, експресію гена якого ми встановили. Хоча це ще не може бути однозначним підтвердженням того, що депокерований вхід Са2+ у секреторні клітини цих органів реалізується лише CRAC-каналами. Адже відомо, що не всі клітини, які кодують Orai, генерують ICRAC (Wissenbach et al., 2007; DeHaven et al., 2007; Gross et al., 2007). Тому, вважають, канальні комплекси, задіяні у депокерованому вході Са2+, можуть мати різний молекулярний склад (Cheng et al., 2008). З огляду на це припускаємо, що ідентифікований нами депокерований вхід іонів Са2+ у секреторні клітини слинних залоз личинки Drosophila melanogaster може бути опосередкований не тільки Orai, але й іншими субодиницями, наприклад, TRPC, функціонуючи як канальний комплекс.

5. Ідентифікація внутрішньоклітинних систем транспортування Са2+ у секреторних клітинах слинних залоз

Відомо, що система підтримання внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+ є подібною у клітинах різних типів. Тому на цьому етапі ми вирішили дослідити, які важливі Са2+-транспортувальні системи внутрішньоклітинних депо функціонують у секреторних клітинах слинних залоз личинки Drosophila.

Для встановлення наявності ріанодинчутливих Са2+-каналів у секреторних клітинах слинних залоз личинки Drosophila melanogaster ми дослідили вплив ріанодину у різних концентраціях на зміни вмісту депонованого Са2+ у їх тканині. З'ясувалося, що ріанодин (5 нмоль/л) не викликав статистично достовірних змін вмісту Са2+ у слинних залозах. Хоча у концентрації 500 нмоль/л спричиняв статистично достовірне (Р < 0,05, n = 8-9) підвищення вмісту Са2+ на 24 %. Це свідчить про можливу наявність ріанодинчутливих Са2+-каналів у досліджуваних секреторних клітинах. Відомо, що ріанодинчутливі Са2+-канали широко екcпресуються в незбудливих тканинах (Rubin, Adolf, 1994; Giannini, Sorrentino, 1995; Король, Клевець, Манько, 1998; Blumеnthal, 2001; Манько, Бичкова, Клевець, 2004). Правда, постулювання наявності цієї системи транспортування у секреторних клітинах слинних залоз Drosophila потребує більш детального функціонального підтвердження.

Важливою системою депонування іонів Са2+ у клітинах є Са2+-помпа мембрани ендоплазматичного ретикулуму. Нами встановлено експресію гена Ca-P60A, який кодує структуру її молекули.

Ми отримали Ca-P60A-транскрипт матричної РНК слинних такого ж розміру (241 п.н.), як і аналогічний транскрипт матричної РНК суцільних тканин личинок загалом. Цілком можливо, що ідентифікований нами ген, який кодує структуру молекули Са2+-помпи мембрани ЕПР, має значення у процесах Са2+-сигналізації в секреторних клітинах слинних залоз личинки Drosophila.

З'ясувалося також, що у концентрації 1 мкмоль/л тапсигаргін спричиняв статистично достовірне (Р < 0,001, n = 8-10) підвищення вмісту депонованого Са2+ на 45 % у слинних залозах, інкубованих у базовому вихідному середовищі. Правда, за концентрації тапсигаргіну 10 мкмоль/л статистично достовірних його змін не виявлено. Тим не менше, у такій концентрації тапсигаргін спричиняв незначне і статистично достовірне зростання рівня цитозольного Са2+ у секреторних клітинах, які експресують флуоресцентний білок G-CaMP1.6 (рис. 6).

Отже, окрім ІФ3-чутливих Са2+-каналів, у мембрані ендоплазматичного ректикулуму секреторних клітин слинних залоз личинки Drosophila наявні ріанодинчутливі Са2+-канали і Са2+-помпа.

Система Са2+-сигналізації у малоклітинних залозах личинок двокрилих організована за схожим принципом у порівнянні із екзокринними органами хребетних.

Звичайно, цьому сприяє досить високий рівень гомології структури геномів цих організмів. Адже відомою є філогенетична збереженість метаболічних і сигнальних шляхів Drosophila melanogaster і ссавців на клітинному рівні (Ashburner, Bergman, 2005). Тому не виключено, що існує певна ідентичність деяких особливостей функціонування їх екзокринних слинних залоз. Тому, цілком можливо, слинні залози личинок Drosophila можуть бути своєрідною моделлю дослідження і пояснення причин патологій травних залоз, пов'язаних із порушенням процесів підтримання Са2+-гомеостазу у їх секреторних клітинах.

У результаті проведених досліджень нами ідентифіковано ряд Са2+-транспортувальних систем у секреторних клітинах слинних залоз личинки Drosophila melanogaster: потенціалкеровані та депокеровані Са2+-канали плазматичної мембрани, ІФ3- і ріанодинчутливі Са2+-канали внутрішньоклітинних депо, Са2+-помпу мембрани ендоплазматичного ретикулуму. Показано наявність Р2-рецепторів на плазматичній мембрані. Припускаємо, що важливу роль у процесах Са2+-сигналізації досліджуваних залоз відіграє і система Na+-Ca2+-обміну. Встановлено також експресію генів Itp-r83A, Са-Р60А, olf186-F, які кодують структуру молекули інозитол-1,4,5-трифосфатчутливого Са2+-каналу, Са2+-помпи мембрани ендоплазматичного ретикулуму і білка Orai плазматичної мембрани секреторних клітин.

Висновки

кальцій цитозоль ріанодин клітинний

У дисертаційній роботі відповідно до поставленої мети і завдань дослідження вперше ідентифіковано Са2+-транспортувальні системи у секреторних клітинах слинних залоз личинки Drosophila melanogaster: потенціалкеровані та депокеровані Са2+-канали плазматичної мембрани, ІФ3- і ріанодинчутливі Са2+-канали внутрішньоклітинних депо, Са2+-помпу мембрани ендоплазматичного ретикулуму.

На основі аналізу отриманих результатів зроблено такі висновки:

1. Потенціалкеровані Са2+-канали плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз личинки Drosophila за своїми фармакологічними властивостями подібні до Са2+-каналів L-типу епітеліальних клітин мальпігієвих трубочок дорослих особин Drosophila melanogaster.

2. Зростання вмісту депонованого Са2+ у секреторних клітинах слинних залоз, інкубованих у базовому вихідному і/або безкальцієвому середовищах, за впливу АТФ у різних концентраціях свідчить про активацію P2-рецепторів їх плазматичної мембрани. Тому АТФ може відігравати роль первинного посередника у досліджуваних клітинах.

3. Ріанодин спричиняє підвищення вмісту депонованого Са2+ у секреторних клітинах слинних залоз, що свідчить про наявність ріанодинчутливих Са2+-каналів внутрішньоклітинних депо.

4. Під впливом тапсигаргіну вміст Са2+ у внутрішньоклітинних депо секреторних клітин слинних залоз змінюється, що є доказом наявності Са2+-помпи ендоплазматичного ретикулуму.

5. Слинні залози личинки Drosophila melanogaster експресують гени Itp-r83A, Са-Р60А, olf186-F, які кодують структуру молекули ІФ3-чутливого Са2+-каналу, Са2+-помпи мембрани ендоплазматичного ретикулуму і білка Orai плазматичної мембрани секреторних клітин.

6. Після спустошення внутрішньоклітинних депо за участю іономіцину і тапсигаргіну у відповідь на відновлення позаклітинної концентрації іонів Са2+ активується депокерований вхід іонів Са2+ у секреторні клітини досліджуваних залозах.

Література

1. Чорна Т.І., Манько В.В., Клевець М.Ю. Потенціалокеровані Са2+-канали у плазматичній мембрані секреторних клітин слинних залоз личинки Drosophila melanogaster // Експерим. та клін. фізіологія і біохімія. - 2007. - № 2. - С. 29-34.

2. Chorna T.I., Hasan G., Man'ko V.V., Klevets M.Yu. Genes expression of calcium signaling molecules in salivary glands of Drosophila melanogaster larvae // Укр. біохім. журн. - 2009. - Т. 81, № 1. - С. 78-81.

3. Чорна Т., Манько В., Клевець М. Системи транспортування Са2+ у слинних залозах личинки Drosophila melanogaster // Вісник Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2009. - Вип. 49. - С. 182-189.

4. Чорна Т.І., Хасан Г., Манько В.В. Депокерований вхід Са2+ у секреторні клітини слинних залоз личинки Drosophila melanogaster // Біологічні студії/Studia Biologica. - 2009. - Т. 3, № 1. - С. 45-56.

5. Чорна Т.І., Нецик О.В., Клевець М.Ю. Адаптація методу визначення вмісту мембранозв'язаного Са2+ для дослідження Са2+-транспортувальних систем у слинних залозах личинки Drosophila melanogaster // Тези доповідей II Міжнародної конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”, 21-23 березня 2006 р., м. Львів. - Львів, 2006. - С. 449.

6. Чорна Т.І., Манько В.В. Вплив ніфедипіну на стимульований гіперкалієвою деполяризацією вхід Са2+ у секреторні клітини слинних залоз личинки Drosophila melanogaster // Тези доповідей III Всеукраїнської наукової конференції “Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології”, 4-6 жовтня 2006 р., м. Київ. - Київ, 2006. - С. 140-141.

Размещено на Allbest.ru