Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

СЕЛЕКЦІЙНО-ГЕНЕТИЧНИЙ ІНСТИТУТ - НАЦІОНАЛЬНИЙ

ЦЕНТР НАСІННЄЗНАВСТВА І СОРТОВИВЧЕННЯ

УДК 58.02 + 575.113 + 633.11

ІДЕНТИФІКАЦІЯ І ЕФЕКТИ АЛЕЛІВ генів ТЕМПІВ РОЗВИТКУ ПШЕНИЦІ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття вченого ступеня

доктора біологічних наук

Файт ВІктор Іванович

Одеса 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Селекційно-генетичному інституті - Національному центрі насіннєзнавства та сортовивчення, УААН

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік УААН Стельмах Адольф Фомич, Селекційно-генетичний інститут - Національний центр насіннєзнавства та сортовивчення,

головний науковий співробітник відділу генетики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Лях Віктор Олексійович, Запорізький національний університет Міносвіти та науки України, завідувач кафедри садово-паркового господарства та генетики рослин

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Чеченєва Тетяна Миколаївна, Національний університет біоресурсів та природокористування Кабінету Міністрів України, завідувач кафедри молекулярної генетики та біобезпеки

доктор біологічних наук, професор Герасименко Володимир Пилипович, Одеський державний аграрний університет Мінагрополітики України, завідувач кафедри селекції, генетики та захисту рослин, проректор

Захист відбудеться “5” березня 2009 р. о 8³⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.363.01 Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення, 65036, м. Одеса-36, Овідіопольська дорога, 3

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення, 65036, м. Одеса-36, Овідіопольська дорога, 3

Автореферат розісланий “3” лютого 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради З.В. Щербина

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Основною задачею генетики є розробка методів цілеспрямованого маніпулювання певними генами, що контролюють господарсько-цінні ознаки, для поліпшення сортів рослин з використанням як класичних, так і сучасних методів генетичної інженерії і біотехнології. В обох випадках першочергове значення набувають дослідження щодо ідентифікації генів та визначення їх ефектів з метою добору кращих з них для подальшого маніпулювання [Law, Worland, 1990]. Серед шляхів маніпулювання значне місце займають методи молекулярного маркування, виділення та інтрогресії конкретних алелів.

Останнє десятиріччя у більшості селекційних програм значна увага приділяється підвищенню адаптивного потенціалу створюваних сортів [Литвиненко, 2001; Власенко, 2008]. При цьому відмічається, що успіх практичної селекції визначається рівнем теоретичних досліджень щодо особливостей генетичного контролю ознак і характера прояву останніх при варіюванні умов середовища. Саме тому актуальним є розвиток досліджень щодо генетичного контролю темпів розвитку, які суттєво впливають на рівень адаптивності рослин до певних умов вирощування і на формування реального урожаю [Snape, 2001].

Адаптація пшениці до умов вирощування в значній мірі обумовлена генетичною різноманітністю систем генів Ppd, Vrn, Vrd и Eps, що контролюють реакції генотипів на температурні та світлові фактори середовища, зокрема фотоперіодизм, реакцію на яровизацію та ії тривалість, інтенсивність освітлення і температуру вирощування. Рівень пристосованості рослин до конкретних умов може бути значно покращений шляхом маніпулювання генами вказаних систем після детального вивчення їх ефектів на спеціально створеному й генетично ідентифікованому матеріалі [Kato, 1992]. Тому є актуальним створення та ідентифікація подібного матеріалу, вивчення генетичної різноманітності та успадковування ознак, ідентифікація генофонду виду, визначення ефектів генів за низкою ознак, розробка методів молекулярного маркуванням певних алелів генів Vrn, Vrd, Ppd та Eps. Це дасть змогу у майбутньому розробити шляхи цілеспрямованого маніпулювання конкретними генами темпів розвитку, для створення більш адаптованих до умов степу України генотипів пшениці.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у відділі генетики Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення згідно завдань: “Охарактеризувати ефекти ідентифікованих локусів темпів розвитку та запропонувати способи маніпулювання ними” (1991-1995 рр., № держреєстрації 0194U035100); НТП УААН “Теоретичні основи селекції та насінництва сільськогосподарських культур”, завдання “Дослідити вплив генів темпів розвитку на агрономічні показники сільськогосподарських рослин” (1996-2000 рр., № 03.04-МВ/322-97) та “Вивчити генетичні основи контролю онтогенезу сільськогосподарських культур” (2001-2005 рр., № 0104U005926); НТП УААН “Сільськогосподарська біотехнологія”, завдання “Вивчити шляхи підвищення ефективності селекції пшениці з використанням ДНК технологій” (2001-2005 рр., № 0104U005944) і “Створити та оцінити вихідний матеріал пшениці для ДНК маркування цінних агрономічних ознак” (2006-2010 рр., № 0106U008265); НТП УААН “Генетичні системи комплексних ознак адаптивності сільськогосподарських культур”, завдання “Дослідити генетичні системи контролю морозостійкості озимої м'якої пшениці”(2006-2010 рр., № 0106U008247).

Автор приймав безпосередню участь у виконанні досліджень як відповідальний виконавець, а з 1998 року здійснював також наукове керівництво та координацію досліджень за вище наведеними розділами.

Мета і завдання досліджень. Мета досліджень - ідентифікувати алелі генів темпів розвитку пшениці та оцінити їх ефекти за низкою агрономічних ознак для визначення перспектив використання в селекції пшениці на адаптивність в умовах степу України. Для досягнення вказаної мети передбачалось вирішення наступних завдань:

? створити набір майже ізогенних ліній за системами генів Vrn-1 твердої, Vrd і Ppd-1 м'якої пшениць, здійснити їх генетичну ідентифікацію та оцінити повноту відновлення генотипу рекурентного батька;

? встановити хромосомну локалізацію генів Vrd;

? розробити методику генетичного аналізу та ідентифікувати Vrn-1 і Vrd, Ppd-1 генотипи, встановити частоти їх розповсюдження у наборах сортів ярої твердої і озимої м'якої пшениці, відповідно;

? визначити ефекти генів Vrn-1 у ярої твердої, Vrd і Ppd-1 у озимої м'якої пшениці на тривалість етапів органогенезу, довжину конусу наростання і комплекс агрономічних ознак з використанням різного вихідного матеріалу;

? створити та охарактеризувати за низкою агрономічних ознак аналоги типу дворучок озимих сортів твердої пшениці, більш ранньостиглі аналоги ярих сортів та типово озимі генотипи м'якої пшениці, що отримані від схрещування тільки ярих сортів з неалельними генами ортологічної серії Vrn-1;

? розробити підходи до оцінки різноманітності та створення вихідного матеріалу за системою генів скоростиглості per se (Eps);

? вивчити генетичну різноманітність та успадковування відмінностей за ознакою “реакція на інтенсивність освітлення” у сортів ярої пшениці;

? виявити ДНК маркери для ідентифікації генотипів озимої та ярої пшениці, що відрізняються за алелями генів Ppd-1, Vrd і QTL темпів колосіння.

Об'єкт досліджень: генетичні системи темпів розвитку пшениці: Vrn-1, Ppd-1, Vrd та Eps.

Предмет досліджень: ідентифікація, успадковування конкретних алелів генів Vrn-1, Ppd-1, Vrd і Eps та їх ефекти за агрономічними показниками. ярий пшениця ген агрономічний

Методи досліджень: моносомний, гібридологічний аналіз і аналіз заміщених ліній - для локалізації генів та ідентифікації генотипів сортів і ліній; морфофізіологічний аналіз фаз розвитку рослин - для визначення тривалості етапів органогенезу і довжини конусу наростання; фенологічні спостереження і структурний аналіз - для визначення тривалості періоду “сходи - колосіння” і рівня формування господарсько-цінних ознак; методи штучного проморожування паростків і рослин у фазі кущіння - для визначення стійкості до негативних температур; електрофоретичний аналіз гліадинів і глютенинів - для оцінки повноти відновлення генотипу рекурентного батька у ізогенних ліній; різні варіанти ПЛР аналізу - для виявлення поліморфізму ДНК і пошуку маркерів певних генів Vrd, Ppd-1 або QTL темпів розвитку; статистичний аналіз - для визначення достовірності отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні з використанням оригінального вихідного матеріалу (майже ізогенні лінії) оцінено ефекти генів ортологічних серій Vrn-1 у ярої твердої і Ppd-1, Vrd у озимої м'якої пшениці за зимо-, морозостійкістю, скоростиглістю, висотою рослин, урожаєм та його складовими. Створено майже ізогенні лінії за системою генів Vrd, що не мають аналогів у світі. Вперше здійснено локалізацію генів Vrd у хромосомах. Розроблено методики гібридологічного аналізу за системами генів Ppd-1 і Vrd, що дозволило значно збільшити кількість ідентифікованих сортів за генами Ppd-1 і вперше ідентифікувати генотипи сортів озимої пшениці за системою генів Vrd, а також визначити Vrn-1 генотипи набору нових сортів ярої твердої пшениці. Встановлено причини більшого поширення того або іншого алелю генів Ppd-1 і Vrd у наборі сортів СГІ. Підтверджено, що при обмеженні генетичного різноманіття за системами Vrn-1 і Ppd-1 генів мінорні генетичні системи скоростиглості per se є головними чинниками селекційного маніпулювання тривалістю періоду “сходи-колосіння” у ярої м'якої пшениці. Вперше встановлено наявність відмінностей за двома генами скоростиглості per se у різних за реакцією на інтенсивність освітлення, але однакових за генами Vrn-1 і Ppd-1 генотипів. Виявлено нові ДНК маркери до генів Vrd1 та QTL темпів колосіння.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено селекційні рекомендації щодо використання генів Vrd2 і Ppd-В1а при створенні нових короткостеблових морозостійких і урожайних сортів озимої пшениці, генів Vrn-D1a і Vrn-В1a - більш скоростиглих аналогів ярих сортів м'якої і сортів дворучок твердої пшениць, відповідно. Виявлено критерії добору батьківських пар для схрещування з метою створення донорів генів скоростиглості per se. Показано можливість використання ДНК маркерів для ідентифікації та добору носіїв певних генів Ppd-1, Vrd і QTL темпів колосіння з перших генерацій, а також вирощування при низькій інтенсивності освітлення для добору генотипів ярої пшениці, що рано колосяться. Через маніпулювання генами ортологічної серії Vrn-1 створено новий вихідний матеріал ярої та озимої пшениці.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено інформаційний пошук, розроблено робочі гіпотези, обґрунтовано методологію постановки експериментів, визначено завдання досліджень та методи їх вирішення, виконано основну частину експериментальної роботи, аналіз і узагальнення отриманих результатів, сформульовано висновки і рекомендації. До дисертації включено також окремі сумісні дослідження з науковими співробітниками, результати яких викладено у спільних публікаціях з часткою авторства 30-90%.

Апробація результатів. Результати досліджень були представлені на конференції молодих вчених “Шляхи раціонального використання земельних ресурсів України” (Чабани, 1995); на семінарі “Modern Plant Breeding Methods” (Kyiv, 1999); на конференціях “Ідеї М.І. Вавилова і сучасна аграрна наука” (Полтава, 2002), “Генетика в современном обществе” (Харьков, 2004); на науково-практичних конференціях “Інтегративність функцій рослинного організму” (Київ, 1998), “Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання” (Оброшино, 2005); на міжнародних конференціях і симпозіумах “Методологические основы формирования, ведения и использования коллекций генетических ресурсов растений” (Харьков, 1996), “Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі” (Львів, 1998 і 2004), “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва” (Харків, 1999), “Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология” (Москва-Минск, 2001), “Genetic collections, isogenic and alloplasmic lines” (Novosibirsk, 2001), “Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resources” (Yalta, 2002), “Геном растений” (Одесса, 2003), “Развитие ключевых направлений сельскохозяйственной науки в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы” (Алматы, 2004), “Молекулярная генетика, геномика и биотехнология” (Минск, 2004), “Теоретичні дослідження в селекції рослин та нові сорти - важливі фактори інноваційного розвитку сільськогосподарського виробництва у південному регіоні України” (Одеса, 2006), “Селекция и семеноводство полевых культур в XXI веке” (Воронеж, 2007); на 11-th EWAC Conference (Novosibirsk, 2000), 6-th International Wheat Conference (Budapest, 2000), III з'їзді ВТГіС (Москва, 2004), ІІ (2002) і ІІІ (2007) з'їздах УТГС.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 66 праць (16 одноосібно), зокрема 40 у наукових виданнях, 23 з яких внесено до переліку фахових видань ВАК України (7 одноосібно), 1 методична рекомендація, а також 25 тез і матеріалів наукових конференцій, симпозіумів та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Рукопис містить вступ, сім розділів, висновки, рекомендації, додатки та список використаних джерел. Загальний обсяг дисертації становить 252 сторінки і включає 55 таблиць та 23 рисунки. Список використаної літератури налічує 527 джерел, з яких 257 - латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Генетичні системи контролю темпів розвитку і принципи використання різноманітності (огляд літератури). У розділі здійснено аналіз досліджень з генетики типу і темпів розвитку пшениці. Показано, що відмінності за типом і темпами розвитку контролюються генами декількох ортологічних серій Vrn і Ppd генів, а також генами Vrd і скоростиглості per se. Обговорено хромосомну локалізацію, ідентифікацію генофонду, адаптивну і селекційну цінність вказаних генів в певних умовах, можливості їх цілеспрямованого використання в селекції. Узагальнено результати використання різних анеуплоїдних, майже ізогенних, рекомбінантно-інбредних ліній для маркування і вивчення ефектів генів якісних і кількісних ознак. Розглянуто можливості використання ПЛР аналізу для ДНК маркування генів типу і темпів розвитку.

Ідентифікація вихідного матеріалу, частоти і ефекти генів Ppd

Повнота відновлення генотипу рекурентного батька у майже ізогенних за генами Ppd ліній. Відсутність достовірних відмінностей за низкою агрономічних ознак між чотирма сублініями в межах кожної з трьох ізогенних ліній та між немаркованими (рецесивними) сибсами, що були дібрані при розщепленні нащадків остатнього беккросу, за кожним з трьох генів Ppd, і рекурентним батьком, а також повна аналогія спектрів запасних білків ендосперму зернини майже ізогенних за локусами Ppd ліній та сорту Миронівська 808 дозволяє стверджувати про достатньо повне відновлення генотипу рекурентного батька у створених майже ізогенних за генами Ppd1, Ppd2 або Ppd3 ліній сорту Миронівська 808.

Ідентифікація майже ізогенних за генами Ppd ліній. Ефект домінантного алелю Ppd3 майже ізогенної лінії сорту Миронівська 808 (СГІ) на скорочення тривалості періоду “сходи - колосіння” (ПСК) в польових умовах (м. Одеса) дорівнює за величиною ефектам алелів Ppd-D1а і Ppd-В1а заміщених і рекомбінантно-заміщених ліній John Innes Centre (Англія), а також алелю Ppd-D1а в умовах 12-годинного дня фітотрону. Ефект алелю Ppd-В1а у фітотроні суттєво менше ефектів домінантних алелів Ppd3 і Ppd-D1а. Домінантний алель Ppd1 сприяє скороченню ПСК у значно меншій мірі порівняно з домінантним алелем Ppd3 і алелями Ppd-D1а, Ppd-В1а. Ефект алелю Ppd2 щодо скорочення ПСК, як у полі, так і в умовах 12-годинного дня практично дорівнює нулю. У той же час в умовах 12-годинного дня рослинам сильно чутливих до фотоперіоду англійських сортів Avalon і Brigand 156 діб росту (без урахування попередньої 60-добової яровизації) виявилось недостатньо для колосіння. Рослини ж сильно фоточутливих українських сортів Миронівська 808 та Одеська 16 колосилися на 115-134 і 108-128 добу, відповідно. Тривалість ПСК індивідуальних рослин F₂ популяцій Avalon/Одеська 16, Brigand/Одеська 16 і Avalon/Миронівська 808 варіювала від 84 і 118, відповідно, до 156 і більше (рослини, що не колосилися) діб. Відношення розщеплення вказаних F₂ популяцій на рослини, що колосилися і не колосилися (Avalon і Brigand не колосилися), не відповідає теоретично очікуваному 3:1 (табл. 1), або на такі, що рано і пізно колосилися (межа - дата колосіння останньої рослини сорту Миронівська 808) - 1:3.

Таблиця 1

Розщеплення за часом колосіння F₂ популяцій від схрещування сильночутливих до фотоперіоду генотипів української і англійської селекції

Примітка. * ч²_3:1 і ч²_1:3 менше 3,84 для df =1 при Р=0,05

Отже відмінності за тривалістю періоду до колосіння сортів Миронівська 808, Одеська 16, Avalon і Brigand обумовлені не ефектами генів Ppd, а дією інших генетичних систем, що впливають на дану ознаку. Тому при гібридологічному аналізі сортів і ліній різного походження до групи рослин носіїв домінантних алелів генів Ppd в гомо- або гетерозиготному стані відносили рослини, які колосилися до початку колосіння першої рослини сорту Миронівська 808, а ті, колосіння яких відмічали одночасно або пізніше таких сорту Миронівська 808 і тих, що не колосилися, відносили до групи рецесивних генотипів.

Аналіз розщеплення F₂ популяцій від схрещування майже ізогенних ліній СГІ і заміщених або рекомбінантно-заміщених ліній John Innes Centre дозволяє констатувати присутність у генотипах ізогенних ліній за генами Ppd3 або Ppd1 сорту Миронівська 808 одного домінантного алелю (табл. 2). При цьому обидва гени Ppd3 і Ppd1 не алельні гену Ppd-D1a. Ген Ppd3 алельний гену Ppd-B1a, а ген Ppd1 - більш слабкому з відомих, гену Ppd-A1a. Сорти Миронівська 808, Одеська 16 і майже ізогенна лінія Миронівська 808 Ppd2 виявилися носіями тільки рецесивних алелів всіх трьох генів Ppd-1. Згідно з результатами аналізу майже ізогенну лінію за геном Ppd3 будемо позначати Миронівська 808-Ppd-B1a, а за геном Ppd1 - Миронівська 808-Ppd-А1a.

Таблиця 2

Розщеплення за часом колосіння F₂ популяцій від схрещування ліній СГІ і ліній John Innes Centre

Примітки:

1. * ч²_3:1 менше 3,84 для df =1 при Р=0,05;

2. ** ч²_15:1 менше 3,84 для df =1 при Р=0,05;

3. *** ч²_63:1 менше 3,84 для df =1 при Р=0,05.

Генетичний аналіз відмінностей за реакцією на фотоперіод набору сортів озимої м'якої пшениці. Попередня оцінка 32 сортів СГІ і двох сортів КНДІСГ ім. П.П. Лук'яненка виявила наявність у більшості з них (23 або 63,9%) слабкої чутливості до фотоперіоду. Різниця за тривалістю періоду до колосіння між рослинами, що вирощувались в умовах скороченого і подовженого дня (d) у певних генотипів складала від 0 до 14 діб. Різниця за тривалістю періоду до колосіння у сортів другої групи (11 або 30,6%) складала від 16 до 24 діб і вони можуть бути охарактеризовані як середньочутливі до фотоперіоду генотипи [Файт, Стельмах, 1993]. Лише контрольним сортам Миронівська 808 і Ульянівка притаманна сильна фотоперіодична чутливість (d=75,6 і 41,8 діб, відповідно). Наявність слабкої або середньої фотоперіодичної чутливості вказує на присутність в генотипі сорту одного або декількох домінантних алелів генів Ppd-1, а сильної - тільки рецесивних алелів генів даної ортологічної серії.

Гібридологічний аналіз 78 сортів озимої пшениці, з яких 56 селекції СГІ, дозволив виявити наявність семи різних Ppd-генотипів. Як у загальному наборі, так і серед сортів СГІ з досить високою частотою (64,1 і 78,4%, відповідно) спостерігаються домінантні тільки за алелем Ppd-D1a генотипи (рис 1). За виключенням рецесивного генотипу в загальному наборі, частоти інших Ppd - генотипів в обох наборах досить малі (від 0 до 7%). Їх загальна частка в наборі сортів СГІ складала біля 20%.

Отже, частота домінантного алелю Ppd-D1a в наборі сортів СГІ складала 85,76,8%, а частоти алелів Ppd-A1a і Ppd-В1a - 8,93,8 і 5,43,0%, відповідно. Така досить висока частота алелю Ppd-D1a обумовлена присутністю в генотипах всіх сортів-донорів генів короткостебловості, що були використані в селекційних програмах, алелю Ppd-D1a. Перші короткостеблові сорти СГІ (Одеська 51, Одеська напівкарликова та ін.) успадкували алель Ppd-D1a від сорту Безоста 1 і його мутантної лінії Карлик 1. Сорти Обрій, Знахідка одеська та інші успадкували алель Ppd-D1a від ярого короткостеблового сорту Red River 68. Короткостеблові сорти колишньої Югославії, зокрема Zlatna dolina, були донорами гену Ppd-D1a для сортів Бригантина, Лузанівка одеська та інших зразків.

Ефекти алелів генів Ppd-1 на агрономічні ознаки. Присутність у генотипі сорту Миронівська 808 домінантного алеля Ppd-B1a або Ppd-A1a призводить до зниження продуктивності окремої рослини при широкорядному посіві (30х5 см²), головним чином, через достовірне зниження продуктивного кущіння ізогенних ліній. Окрім того, алель Ppd-A1a сприяє зменшенню висоти рослин, а алель Ppd-B1a - значному збільшенню маси 1000 насінин порівняно з рекурентним батьком. Достовірного впливу відмінностей Ppd генотипів на інші ознаки окремої рослини при широкорядному посіві виявити не вдалося.

При вузькорядному посіві (облікова площа 3 м²) рецесивні за трьома генами Ppd-1 сорти (Ppd-A1b Ppd-В1b Ppd-D1b) і рекурентний батько майже ізогенних ліній сорт Миронівська 808 характеризувалися більш високою зимостійкістю в умовах суворої зими 2002/2003 років (62% и 63% живих рослин, відповідно). Алель Ppd-A1а практично не впливав на рівень зимостійкості (зменшення на 4%), а Ppd-B1а сприяв достовірному зниженню його порівняно з рекурентним батьком (на 14%). Зимостійкість сортів генотипу Ppd-A1b Ppd-В1а Ppd-D1b в таких умовах складала 48%, а сортів генотипу Ppd-A1b Ppd-В1b Ppd-D1а була значно меншою (38%).

Домінантні алелі генів Ppd-1 виявляють суттєвий вплив на рівень морозостійкості на кінець лютого - на початок березня. Більшою морозостійкістю при цьому характеризувалися рецесивні (Ppd-A1b Ppd-В1b Ppd-D1b) за генами Ppd-1 сорти - 78% живих рослин. Морозостійкість сортів генотипу Ppd-D1а була суттєво меншою (на 18%) порівняно з рецесивними сортами. Ефект зниження морозостійкості алелем Ppd-В1а складав всього 5%.

У залежності від типу досліджуваного матеріалу (сорти, ізогенні або рекомбінантно-заміщені лінії) домінантний алель Ppd-D1а сприяв скороченню тривалості періоду до колосіння на 3,1-6,8, Ppd-В1а - 3,1-8,3 і Ppd-A1а на 2,1 днів порівняно з відповідними рецесивними алелями. У високорослих сортів Миронівська 808 і Ciano F67 та в наборі комерційних сортів домінантні алелі генів Ppd сприяли скороченню висоти рослин. При цьому ранги різних Ppd генотипів за висотою рослин відповідали таким за тривалістю періоду до колосіння. Однак у середньорослого сорту Cappelle Desprez алель Ppd-B1а навпаки сприяв збільшенню висоти рослин порівняно з альтернативним алелем Ppd-B1b. Крім вище наведених ознак гени Ppd-B1а і Ppd-D1а сприяли зниженню кількості колосків та зерен головного колоса і зростанню фертильності колосків бічних пагонів, маси зерна рослини та маси 1000 зерен.

Відмінності між Ppd генотипами за урожаєм зерна залежали в значний мірі від умов зимівлі (рис. 2). У роки з несприятливими умовами зимівлі (2002/2003) лінії Миронівська 808-Ppd-A1а і, особливо, Миронівська 808-Ppd-B1а достовірно поступалися за урожаєм зерна сорту Миронівська 808 на 0,2 и 0,5 кг/м², відповідно. Сорти з присутністю в генотипі домінантних алелів генів Ppd-1 достовірно поступалися за урожаєм зерна рецесивним за генами Ppd сортам, головним чином за рахунок малої кількості продуктивних пагонів, внаслідок низької зимостійкості. У більшій мірі (у два рази) зниження урожаю спостерігаються серед сортів генотипу Ppd-D1а. Сорти генотипу Ppd-В1а знижали урожай у меншій мірі (на 0,03 кг/м²). У роки з м'якими зимами (2001/2002 і 2003/2004 рр.) лінія Миронівська 808-Ppd-B1а формувала суттєво більший урожай порівняно з Миронівською 808 (на 0,1 кг/м²) і лінією Миронівська 808-Ppd-A1а (на 0,09 кг/м²). Серед сортів у даних умовах більший урожай зерна сформували Ppd-D1а генотипи (0,54 кг/м²). Урожай сортів генотипу Ppd-В1а був дещо меншим (на 0,04 кг/м²) порівняно з сортами генотипу Ppd-D1а. Рецесивний за трьома генами Ppd-1 генотип у такі роки характеризувався урожаєм зерна, якій був на 0,09-0,13 кг/м² менше такого для сортів з наявністю в генотипі домінантних алелів генів Ppd.

Різниця за урожаєм зерна між сортами в такі роки обумовлена, головним чином відмінностями за масою зерна колоса. Необхідно відмітити, що ефект гену Ppd-B1а по збільшенню урожаю зерна в сприятливі роки близький до такого гена Ppd-D1а, але по зниженню зимостійкості в несприятливі роки и морозостійкості в кінці зими суттєво менше порівняно з останнім.

Генетичні відмінності за тривалістю потреби в яровизації озимої пшениці

Для позначення генів, що контролюють відмінності за тривалістю потреби в яровизації запропоновано символ Vrd (vernalization requirement duration) [Feit, Stelmakh, 2001, Stelmakh et al., 2005].

Створення, ідентифікація і характеристика майже ізогенних за генами Vrd ліній. Як рекурентні батьки при створенні майже ізогенних ліній за генами Vrd1 і Vrd2 були використані сорти Миронівська 808 та Еритроспермум 604, для яких притаманна 50-60-добова потреба в яровизації. Сорт Миронівська 808 сильно чутливий до тривалості освітлення (генотип Ppd-A1b Ppd-В1b Ppd-D1b). Сорт Еритроспермум 604 середньо чутливий до фотоперіоду та на відміну від першого сорту є носієм алелю Ppd-D1a. Донором домінантного алелю гену Vrd1 слугував сорт Norin 1 (20-добова потреба в яровизації і слабка чутливість до фотоперіоду), гену Vrd2 - сорт Чайка (потреба в яровизації 30 діб, сильна чутливість до фотоперіоду). Розщеплення на рослини, що колосилися або не колосилися після попередньої 40-добової яровизації, популяції ВС₉І₁ при створенні ізогенної лінії за геном Vrd1 (51:16) або геном Vrd2 (37:11) сорту Миронівська 808 (Миронівська 808-Vrd1 і Миронівська 808-Vrd2, відповідно), ВС₈І₁ за геном Vrd1 (15:7) і ВС₇І₁ за геном Vrd2 (46:14) сорту Еритроспермум 604 (Еритроспермум 604-Vrd1 і Еритроспермум 604-Vrd2, відповідно) відповідало моногенному (3:1).

Аналіз F₂ популяції від схрещування створених ізогенних ліній, сортів донорів і рекурентних батьків виявив, що ген Vrd1 лінії Миронівська 808-Vrd1 є алельним такому сорта-донора Norin 1, лінії Еритроспермум 604-Vrd1 і сорту Ольвія (табл. 3). Всі рослини F₂ популяцій, які отримані від схрещування вказаних генотипів колосилися до 90 діб з дня висадки паростків у полі (про строки обліку див. нижче). Ген Vrd2 лінії Миронівська 808-Vrd2 є алельним такому сорта-донора Чайка і лінії Еритроспермум 604-Vrd2, оскільки відсутнє розщеплення (всі рослини колосилися) F₂ гібридів від схрещування даних трьох генотипів.

Таблиця 3

Розщеплення F₂ популяцій від схрещування майже ізогенних ліній, сортів донорів генів Vrd і рекурентних батьків на рослини, що колосилися і не колосилися після 40-добової яровизації, 2002 р

Примітки:

1 * - ч²_3:1 менше 3,84 для df =1 при Р=0,05;

2 ** - ч²_15:1 менше 3,84 для df =1 при Р=0,05.

Достовірні дигенні відмінності в F₂ популяціях від схрещування сортів Norin 1, Ольвія і ліній Миронівська 808-Vrd1, Еритроспермум 604-Vrd1, з одного боку, та сорту Чайка і ліній Миронівська 808-Vrd2, Еритроспермум 604-Vrd2, з другого, вказували на те, що скорочена потреба в яровизації сортів Norin 1, Чайка і ізогенних за генами Vrd1 або Vrd2 ліній озимих сортів Миронівська 808 і Еритроспермум 604 контролюється неалельними домінантними генами Vrd.

Лінії Миронівська 808-Vrd1 і Миронівська 808-Vrd2 є сильно чутливими до фотоперіоду генотипами. Різниця кількості діб до колосіння між варіантами скороченого і подовженого днів (d) складала 66 і 64 діб, відповідно, що дорівнює такої (69 діб) сильно чутливого до фотоперіоду сорту Чайка. При цьому відновлення генотипу рекурентного батька за ознакою “чутливість до фотоперіоду” лінії Миронівська 808-Vrd1 відбулося в ВС₃. Лінії Еритроспермум 604-Vrd1 і Еритроспермум 604-Vrd2 за показником d (35 і 40 діб, відповідно) не відрізнялися від рекурентного сорту Еритроспермум 604 (d=39 діб), тобто є середньочутливими до скорочення тривалості дня генотипами.

Озимі сорти Миронівська 808 і Еритроспермум 604, що відрізняються за реакцією на тривалість дня, потребують для колосіння яровизацію тривалістю, як мінімум, 50 діб. Колосіння рослин сильночутливої до тривалості дня лінії Миронівська 808-Vrd1 спостерігали вже при мінімальній яровизації 35 діб, а середньочутливої до фотоперіоду лінії Еритроспермум 604-Vrd1 20 діб, тобто зменшення чутливості до фотоперіоду у останньої лінії збільшує ефект скорочення потреби в яровизації домінантним алелем Vrd1. Ефект гену Vrd2 на скорочення потреби в яровизації значно менший. Мінімальна тривалість яровизації, при який спостерігали колосіння рослин лінії Миронівська 808-Vrd2, складала 45 діб, а лінії Еритроспермум 604-Vrd2 - 40 діб.

Хромосомна локалізація генів Vrd. Відношення розщеплення дисомних F₂ популяцій Cappelle Desprez / Миронівська 808-Vrd1 (контроль 1) та Cappelle Desprez/Миронівська 808-Vrd2 (контроль 2) на рослини, які колосилися і не колосилися після 40-добової яровизації в умовах 16-годинного дня фітотрону, достовірно відповідало 13:3 у першій та 10:6 у другій, що вказує на відмінності батьківських форм за двома генами (табл. 4).

Таблиця 4

Розщеплення F₂ популяцій моно Cappelle Desprez/Миронівська 808-Vrd1 і моно Cappelle Desprez/Миронівська 808-Vrd2 на рослини, що колосилися і не колосилися після 40-добової яровизації, 16-годинний день

Розщеплення більшості F₂ популяцій моно Cappelle Desprez/Миронівська 808-Vrd1 або відповідало такому в контрольному варіанті або частка рослин, що колосилися була значно більшою порівняно з контрольним варіантом. У комбінації схрещування моно 4A/Миронівська 808-Vrd1 всі рослини колосилися до встановленої межі розподілу на фенотипові класи, тобто ген Vrd1, який скорочує мінімальну потребу в яровизації сорту Миронівська 808 з 50 до 35 діб, локалізований на 4А хромосомі. Відношення розщеплення на рослини, що колосилися і не колосилися в 20 комбінаціях схрещування моносомних ліній Cappelle Desprez з лінією Миронівська 808-Vrd2 було або аналогічне такому дисомної популяції (10:6), або відповідало 13:3. Лише рослини F₂ популяції моно 5D Cappelle Desprez/Миронівська 808-Vrd2 не колосилися до закінчення експерименту (на 132 добу, без урахування попередньої 40-добової яровизації), що може свідчити про локалізацію гену Vrd2 на хромосомі 5D. Теоретично розщеплення в даній комбінації повинно відповідати співвідношенню 1:3.

Для локалізації третього гену Vrd3, неалельного генам Vrd1 і Vrd2, використовували заміщені лінії Cappelle Desprez/Безоста 1. При відмінностях сортів Cappelle Desprez і Безоста 1 (генотип останнього Vrd1 Vrd1 vrd2 vrd2) за генами Vrd після 40-добової яровизації рослини однієї або декількох заміщених ліній повинні залишатися у фазі кущіння, оскільки домінантний алель першого сорту буде заміщено на рецесивний другого сорту. Із 17 заміщених ліній три 1A, 6A, 4B лінії, як і контрольний сорт Одеська 16 (потреба в яровизації 50 діб, генотип vrd1 vrd1 vrd2 vrd2), не колосилися до закінчення експерименту (>68 діб, відлік від 1 червня). Отже ген Vrd3, якій відповідає за 40-добову потребу в яровизації сорту Cappelle Desprez розташовано в одній з хромосом 1A або 6A або 4B.

Генетичний аналіз сортів озимої пшениці за генами Vrd. Оцінка 32 сортів СГІ, 2 сортів Краснодарського НДІСГ ім. П.П. Лук'яненка, а також двох контрольних сортів Миронівська 808 і Ульянівка виявила, що потреба в яровизації двох останніх генотипів складає не менше 50 діб. Для більшості сортів (24 або 66,7%) виявилося достатнім для колосіння 30-добової яровизації. Сортам другої, значно меншої, групи (10 або 27,8%) для колосіння необхідна 40-добова яровизація. Таким чином, вивчені сорти СГІ і сорти Юна та Спартанка мають у своєму генотипі домінантні алелі генів Vrd1 і/або Vrd2. А сорт Ульянівка, як і Миронівська 808, є рецесивним за даною системою генотипом.

Суттєву роль при проведенні гібридологічного аналізу за генами Vrd відіграє часова межа розподілу F₂ популяції на фенотипові класи. Облік рослин, що колосяться і не колосяться, F₂ популяцій та вихідних батьківських форм на 62, 77 і 90 добу з дня висадки недояровизованих (40 діб) зелених паростків навесні в полі дозволив виявити, що сорт Norin 1 (донор гену Vrd1), лінії Миронівська 808-Vrd1 і Миронівська 808-Vrd2 колосилися до 77 діб вегетації, а сорт Аврора (генотип vrd1 vrd1 Vrd2 Vrd2) - до 85 діб (табл. 5).

Таблиця 5

Співвідношення розщеплення на рослини, що колосилися: не колосилися, сортів, ліній і F₂ популяцій після 40-добової яровизації через різні проміжки часу, 2001 р

Примітки:

1. * - ч²_3:1 < 3,84, при df=1;

2. ** - ч²_15:1 < 3,84, при df=1.

Сорти з тривалою (50-60 діб) потребою в яровизації (Миронівська 808 і Еритроспермум 604) до закінчення експерименту знаходились у фазі кущіння. Лише на 92-96 добу (у залежності від року вивчення) спостерігали вихід у трубку окремих рослин сорту Еритроспермум 604 і на 90-94 - сорту Миронівська 808. Фактично отримане розщеплення F₂ популяцій на рослини, що колосилися и не колосилися (у даний клас включали і рослини, які на час обліку були у фазі кущіння) більш повно відповідає теоретично очікуваному через 90 діб вегетації.

Гібридологічний аналіз 55 сортів озимої пшениці (з яких 43 сорти СГІ) дозволив виявити п'ять груп різних Vrd генотипів. Двадцять вісім сортів або 50,9±6,74% відповідали генотипу Vrd1 Vrd1 vrd2 vrd2. Частоти генотипів vrd1 vrd1 vrd2 vrd2 (10,9±4,20%), vrd1 vrd1 Vrd2 Vrd2 (16,4±4,99%) і Vrd1 Vrd1 Vrd2 Vrd2 (18,25,20%) виявились значно нижчими і суттєво не розрізнялися між собою. І лише з частотою біля 3,6±2,51% виявлені генотипи - можливі носії третього неалельного генам Vrd1 и Vrd2 гена Vrd3. Більша частота алелю Vrd1 у вивченому наборі сортів (67,96,30%) порівняно з алелем Vrd2 (34,56,41%) може бути обумовлена або кращою селекційною цінністю носіїв алелю Vrd1 в умовах півдня України або більшою частотою його використання при створенні нових сортів у селекційних програмах.

Особливості органогенезу і довжина конусу наростання різних за генами Vrd ліній озимої м'якої пшениці. Гени Vrd виявляють достовірний вплив на тривалість II і III етапів органогенезу майже ізогенних ліній сортів Миронівська 808 і Еритроспермум 604 в польових умовах (м. Одеса). Тривалість II етапу органогенезу рекурентних батьків сортів Миронівська 808 і Еритроспермум 604, що різняться за фотоперіодичною чутливістю, складала у обох 89 діб (табл. 6).

Таблиця 6

Тривалість етапів органогенезу ізогенних за генами Vrd ліній в умовах осіннього посіву, 2001/2002 рр

Примітка. * - загальна тривалість VI і VII етапів разом.

Домінантний алель Vrd1 сприяв достовірному скороченню тривалості II етапу органогенезу середньочутливої до фотоперіоду лінії Еритроспермум 604-Vrd1 до 25,7, а сильночутливої до фотоперіоду лінії Миронівська 808-Vrd1 до 57,7 діб. Тривалість II етапу органогенезу ліній Еритроспермум 604-Vrd2 і Миронівська 808-Vrd2 складала 53,7 і 73,3 діб, відповідно, тобто ефект гену Vrd2 на скорочення тривалості II етапу органогенезу був суттєво меншим порівняно з ефектом гену Vrd1. Середня чутливість до фотоперіоду призводила до більш контрастних відмінностей майже ізогенних за генами Vrd1 або Vrd2 ліній сорту Еритроспермум 604 за тривалістю II етапу органогенезу порівняно з такими сильночутливого до фотоперіоду сорту Миронівська 808. Це вказує на часткову взаємодію ефектів домінантних Vrd і Ppd генів на скорочення тривалості II етапу органогенезу.

Достовірні відмінності між лініями кожного з двох сортів за тривалістю III етапу органогенезу є наслідком відмінностей за тривалістю II етапу органогенезу, оскільки тривалість наступного етапу знаходиться у зворотній залежності від такої попереднього. Тривалість IV, V і VI+VII етапів органогенезу не залежала від Vrd генотипу лінії (відмінності недостовірні) обох сортів. Різна тривалість II і III етапів визначала достовірні відмінності за тривалістю періоду до колосіння між Vrd лініями кожного з сортів.

Попередня диференційована штучна яровизація різної тривалості в залежності від генотипу лінії (Еритроспермум 604-Vrd1 - 25, Еритроспермум 604-Vrd2 - 35, Еритроспермум 604 - 50 діб) нівелювала відмінності трьох Vrd генотипів за тривалістю II і всіх наступних етапів органогенезу. Отже гени Vrd контролюють відмінності за тривалістю II етапу органогенезу, тобто тривалість вегетативної фази розвитку.

Майже ізогенні лінії сильно чутливого до фотоперіоду сорту Миронівська 808 не відрізнялись між собою за довжиною конусу наростання на протязі всього періоду вегетації. У ліній середньочутливого до фотоперіоду сорту Еритроспермум 604 відмінності за вказаним показником спостерігали тільки після переходу тієї або іншої лінії до III етапу органогенезу, коли в онтогенезі виявляється дія генів Ppd [Стельмах, Мартынюк, 1998].

Ефекти генів Vrd на агрономічні ознаки. В умовах м'яких зим 2001/2002, 2003/2004 і 2004/2005 років комерційні сорти генотипу vrd1 vrd2 (тут і далі вказано гаплоїдний генотип) і рекурентні батьки ізогенних ліній сорти Миронівська 808 та Еритроспермум 604 характеризувалися кращою морозостійкістю (метод “пучків”) як на початку грудня або березня, так і в середині січня, що можна було й очікувати, оскільки рецесивні vrd1 vrd2 генотипи характеризуються більшою тривалістю II етапу органогенезу. Присутність у генотипі комерційних сортів та ізогенних ліній домінантного алеля тільки гена Vrd2 практично не впливала на морозостійкість на початку грудня і середині січня (рис. 3). На початку березня ефект домінантного алеля гена Vrd2 у комерційних сортів і середньочутливої до фотоперіоду лінії Еритроспермум 604-Vrd2 (за виключенням сильночутливої до фотоперіоду лінії Миронівська 808-Vrd2) на зниження морозостійкості вже був суттєвим і складав 2-11%. Комерційні сорти генотипу Vrd1 vrd2 і ізогенні лінії Еритроспермум 604-Vrd1 і Миронівська 808-Vrd1 характеризувалися суттєво меншою часткою живих рослин на початку грудня (за виключенням лінії Миронівська 808-Vrd1), в середині січня і на початку березня порівняно з рецесивними генотипами vrd1 vrd2. Під кінець зими (початок березня) відмінності за морозостійкістю між генотипами Vrd1 vrd2 і vrd1 vrd2 зростали до 26-29%. Отже темпи зниження морозостійкості в другій половині зими у генотипів з присутністю тільки домінантного алеля гена Vrd1 значно вищі порівняно з такими сортів генотипу vrd1 Vrd2. Генотипи з присутністю одразу двох домінантних алелів Vrd1 і Vrd2 не відрізнялися за морозостійкістю від сортів з присутністю тільки домінантного алеля Vrd1.

Аналогічне рангування різних Vrd генотипів за зимостійкістю було виявлено і в умовах суворої зими 2002/2003 років. Незалежно від виду рослинного матеріалу, генотипи vrd1 vrd2 характеризувалися достатньо високим рівнем стійкості (36-62% живих рослин). Присутність в генотипі комерційних сортів або ізогенних ліній одного домінантного алеля Vrd1 або разом з Vrd2 призводило до достовірного зниження зимостійкості (5-37%). Більш зимостійким виявився генотип vrd1 Vrd2 (30-66%).

Присутність у генотипі домінантних алелів генів Vrd2 (1-5 діб) і, особливо, Vrd1 (2-6 діб) сприяло скороченню тривалості періоду до колосіння (ПСК) незалежно від типу рослинного матеріалу та року вирощування, порівняно з рецесивними генотипами vrd1 vrd2. Більш скоростиглими були носії домінантних алелів одразу двох генів Vrd1 і Vrd2. Вони колосилися на 2 і 1 діб раніше генотипів vrd1 Vrd2 і Vrd1 vrd2, відповідно. У роки з раннім відновленням весняної вегетації відносні відмінності за вказаною ознакою між певними Vrd генотипами зростали, а в роки з пізньою весною - значно зменшувалися. Середня чутливість до фотоперіоду ізогенних ліній сорту Еритроспермум 604 сприяла скороченню ПСК порівняно з сильночутливими до фотоперіоду лініями сорту Миронівська 808.

Рангування різних Vrd генотипів за висотою рослин відповідало такому за ПСК. Генотипи з присутністю тільки рецесивних алелів генів Vrd1 та Vrd2, що пізно колосилися, виявилися і найбільш високорослими. Присутність у генотипі домінантного алеля гена Vrd2 сприяла зниженню висоти рослин у меншій, а гена Vrd1 - у більшій мірі порівняно з генотипами vrd1 vrd2. Спільна дія домінантних алелів Vrd1 і Vrd2 призводила до ще більшого зниження висоти рослин.

У роки з м'якими зимами сорти Vrd1 vrd2, vrd1 Vrd2 та Vrd1 Vrd2 суттєво перевищували сорти генотипу vrd1 vrd2 за урожаєм зерна, але достовірно не відрізнялись один від одного. Хоча і спостерігали тенденцію до збільшення урожаю в напрямі Vrd1 Vrd2 - Vrd1 vrd2 - vrd1 Vrd2. Основні відмінності за урожаєм зерна в такі роки обумовлені різноманітністю вказаних генотипів за масою зерна з колоса. У майже ізогенних ліній сортів Миронівська 808 і Еритроспермум 604 в роки з м'якими зимами виявлено достовірний вплив Vrd генотипу на масу 1000 зерен (МТЗ). Високорослі, сильночутливі до фотоперіоду лінії Миронівська 808-Vrd1 і Миронівська 808-Vrd2 не відрізнялися за МТЗ, але обидві достовірно поступалися рекуренту за даною ознакою. Короткостеблові середньочутливі до фотоперіоду лінії Еритроспермум 604-Vrd1 і Еритроспермум 604-Vrd2 формували МТЗ, яка перевищувала таку рекурентного батька на 0,2 і 2,0 г, відповідно. У роки з суворою зимою (2002/2003) перше місце за урожаєм зерна, як серед комерційних сортів, так і ізогенних ліній займав більш зимостійкий рецесивний (vrd1 vrd2) генотип. При значно нижчій зимостійкості сорти генотипу vrd1 Vrd2 і лінія Миронівська 808-Vrd2 формували урожай на рівні рецесивних сортів. Ізогенні лінії Миронівська 808-Vrd1, Еритроспермум 604-Vrd1 і сорти генотипів Vrd1 vrd2 та Vrd1 Vrd2 знижували урожай порівняно з генотипами vrd1 vrd2 в 1,6 - 3,5 рази.