Активація процесів біосинтезу та функціонування в тканинах щурів

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Убіхінон (CoQ, 2,3-диметокси-5-метил-6-поліпренілбензохінон) - органічна жиророзчинна сполука, що складається із бензохінонового ядра та поліізопреноїдного бічного ланцюга. Гідроксигрупи в 1 та 4 положеннях ядра дозволяють йому легко вступати в реакції окислення-відновлення; ця здатність обумовлює більшість біохімічних функцій CoQ (Донченко Г.В., 1988). Основною функцією CoQ в біологічних системах вважають участь в транспорті відновних еквівалентів в ланцюзі транспорту електронів (ЛТЕ) мітохондрій; крім того CoQ бере участь в підтримці про- та антиоксидантного балансу, транспорті протонів в плазматичних мембранах та інших процесах (Бурлакова Е.Б., 1998, Forsmark-Andree P., 1995, Crane F.L., 1991). Суттєве функціональне навантаження на CoQ та значна роль, яку він відіграє у ряді важливих клітинних функцій, обумовлюють широкий інтерес до цієї сполуки як теоретично (роль в біоенергетичних процесах, їх взаємозв'язок з сигнальними системами клітини, вплив на функціонування генетичного апарату), так і практично (з точки зору перспектив застосування CoQ).

Біосинтез CoQ є багатостадійним процесом, що забезпечується функціонуванням значної кількості ензиматичних систем. Основними етапами його біосинтезу є синтез бензохінонового ядра, поліізопреноїдного ланцюга, їх конденсація та термінальні етапи метилування і метоксилування (Turunen M., 2004.). Процес біосинтезу CoQ регулюється як на клітинному рівні,так і на рівні організму. Зниження вмісту CoQ в організмі спостерігається за умов Е-гіповітамінозу, ряду патологічних станів (зокрема, патології серцево-судинної, нервової систем, м'язових дистрофіях), та ін. Показано, що старіння, канцерогенез, лікарські засоби типу статинів можуть призводити до зменшення вмісту CoQ у плазмі крові та у тканинах людини (Crane F.L., 2001).

CoQ широко використовується в клінічній практиці за профілактики та лікування серцево-судинних захворювань, терапії стресорних станів різного ґенезу, при терапії онкологічних захворювань, патологій імунної системи та ін. (Rosenfeldt F., 2003, Донченко Г.В., 2005, Roffe L., 2004). Проте істотна вартість виробництва CoQ у промислових масштабах веде до значного зростання складової CoQ в ціні кінцевого товару (фармацевтичного препарату чи іншої продукції). Іншим суттєвим недоліком фармацевтичних препаратів на основі CoQ та іншої CoQ-вмісної продукції (використання CoQ як субстрату) є спричинене ними пригнічення певних ділянок складних шляхів ендогенного синтезу CoQ та зниження його ендогенного пулу після закінчення курсу CoQ-тереапії або після припинення застосування CoQ-вмісної продукції. Для уникнення такого ефекту і для зниження вартості терапії CoQ є необхідним пошук нових підходів підвищення рівня внутрішньоклітинного CoQ за рахунок посилення його біосинтезу de novo та активації CoQ-залежних оксидо-редуктаз ЛТЕ мітохондрій.

Тому пошук шляхів корекції вмісту CoQ в тканинах за допомогою введення екзогенних комплексів попередників та модуляторів його біосинтезу є надзвичайно актуальним та важливим, оскільки він спрямований на розробку нового підходу до терапії патологічних станів, обумовлених зниженням вмісту та функціональної активності CoQ. Одночасно такий підхід дозволяє уникнути ефекту відміни препарату після закінчення терапевтичного курсу.

Попередні дослідження відділу біохімії коферментів Інституту біохімії
ім. О.В. Палладіна НАН України і дані літератури свідчать про принципову можливість стимуляції ендогенного синтезу CoQ. Тому виправданою, актуальною та перспективною є обрана нами мета роботи: пошук природних біологічно активних сполук (БАС), які можуть бути попередниками CoQ, а також розробка на їх основі комплексу БАС для стимуляції біосинтезу та функціонування CoQ в організмі.

Мета дослідження - визначити можливість активації процесів біосинтезу та функціонування CoQ в тканинах дослідних тварин за допомогою попередників та модуляторів його біосинтезу.

Завдання дослідження:

· Дослідити включення міченого тирозину в CoQ та біосинтетично споріднені сполуки - убіхроменол, холестерол, сквален в печінці щурів, особливості розподілу і обміну досліджуваних сполук в субклітинних фракціях печінки щурів в нормі та за умов недостатності в організмі вітамінів А і Е.

· Визначити CoQ-статус організмів дослідних тварин за утримання їх на стандартному раціоні віварія та за дії БАС, що можуть бути потенційними активаторами ендогенного синтезу CoQ і впливати на його функціонування в ЛТЕ мітохондрій.

· Визначити можливість корекції вмісту CoQ в організмі тварин за Е-гіповітамінозу за допомогою комплексів попередників та активаторів біосинтезу CoQ.

· Дослідити вплив комплексів попередників та модуляторів біосинтезу CoQ на активність CoQ-залежних ензиматичних систем ЛТЕ мітохондрій за умов Е-гіповітамінозу.

· Дослідити ефект комплексів попередників та модуляторів біосинтезу CoQ на активність CoQ-залежних ензиматичних систем ЛТЕ мітохондрій, вміст продуктів вільнорадикальне окислення ліпідів та протеїнів, активність ензимів антиоксидантного захисту за умов дії адріаміцину та визначити можливість корекції CoQ-статусу організмів дослідних тварин за цих умов.

1. Матеріали і методи досліджень

Дослідження проводили на білих безпородних щурах-самцях масою 55 - 65 г (в дослідах із утриманням на раціоні А40) та 160 - 220 г (в дослідах із утриманням на стандартному раціоні віварію), які відбиралися для експериментів за методом аналогів, утримувалися на карантині протягом 2 тижнів. З метою моделювання Е-гіповітамінозу щурів відсаджували на раціон А40 з додаванням до нього 35-40 МО вітаміну А і утримували на ньому протягом 3,5 місяців. Тварини контрольної групи додатково до основного раціону отримували препарат фармакопейного вітаміну Е в дозі 100 МО/кг раціону.

Виділення субклітинних фракцій проводили методом диференціального центрифугування за (Schneider V.C. 1948). Для дослідження вмісту CoQ та токоферолу у гомогенаті використовували методику, розроблену у відділі біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, яка дозволяє визначати мікрокількості токоферолу та CoQ в незначних кількостях досліджуваного матеріалу (Донченко Г.В., 1979). Вміст протеїну в гомогенаті та субклітинних фракціях визначали за методом Лоурі (Lowry O.H., 1951), модифікованим для високих концентрацій протеїну. Аналіз вмісту продуктів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК), проводили спектрофотометрично за методом (Стальная И.Д., 1977). Вміст дієнових кон'югатів визначали спектрофотометрично за методом (Стальная И.Д., 1977). Вміст продуктів окислення протеїнів досліджували спектрофотометрично за (Дубинина Е.Е., 1995) з модифікацією для гомогенатів тканин. Активність каталази (EC 1.11.1.6) в пробах визначали спектрофотометрично за (Дубинина Е.Е., 1995). Активність супероксиддисмутази (EC 1.15.1.1) вивчали за (Misra H.P., 1972). Ензиматичну активність NADH-CoQ-оксидоредуктази (NQR) (EC 1.6.5.3) та сукцинат-CoQ-оксидоредуктази (SQR) (EC 1.3.5.1) визначали за методом Тарасової (Тарасова Н.В., 1976) та Ziegler (Ziegler D., 1967) відповідно. Виділення речовин неомилюваної фракції гомогенатів та субклітинних фракцій тканин тварин та фракціонування CoQ, убіхроменолу, в-оксистеролів, токоферолів та сквалену проводили за методом тонкошарової хроматографії (Донченко Г.В., 1979). Вміст убіхроменолу визначали спектрофотометрично (Hemming F.W., 1961).

Статистичну обробку результатів здійснювали на комп'ютері програмою MS Excel 2003 за методами Ст'юдента або Манна-Уітні (Лапач С.Н., 2001).

2. Результати досліджень та їх обговорення

Вплив різного рівня забезпеченності організму вітамінами А та Е на обмін CoQ і споріднених сполук. Для з'ясування участі вітамінів А та Е в обміні CoQ, убіхроменолу, сквалену і холестеролу досліджували особливості розподілу та обміну цих біосинтетично споріднених сполук в субклітинних фракціях печінки щурів в нормі та за умов недостатності вітамінів А і Е.

Білі щури з масою тіла 40-50 г були розділені за методом аналогів на дві групи та утримувались на А,Е-авітамінозному раціоні А40 протягом 6 тижнів. Контролем були тварини, що отримували додатково до авітамінозного раціону 35-40 МО вітаміну А і 0,1 мг вітаміну Е в розрахунку на одну тварину за добу. [7,8-3H] тирозин вводили підшкірно як радіоактивний попередник CoQ і біосинтетично споріднених до нього сполук в дозі по 37 kBq на 1 г маси тіла за 2, 4 та 8 годин до декапітації.

За умов А,Е-гіповітамінозу спостерігали різке зниження рівня радіоактивності CoQ в розрахунку на 1 г протеїну у всіх досліджуваних субклітинних фракціях печінки щурів з А,Е-гіповітамінозом в порівнянні із тваринами контрольної групи (дані не наводяться), тоді як характер динаміки цих показників у часі суттєво не змінювався. Отримані дані свідчать про значне зниження інтенсивності біосинтезу CoQ в тканині печінки щурів за умов А,Е-гіповітамінозу.

Відносна радіоактивність CoQ (у відсотках від радіоактивності цільного гомогенату) в перші 2 години досліду зростає на 78% в ядерній фракції, знижується на 27% в мітохондріях і практично не змінюється в постмітохондріальній фракції печінки піддослідних тварин в порівнянні із контролем. На 4 годину рівень відносної радіоактивності CoQ зростає на 32% в ядерній фракції і на 42,5% в постмітохондріальній фракції і знижується на 36% в мітохондріях печінки піддослідних тварин в порівнянні із контролем.

Таким чином, аналіз представленого експериментального матеріалу дозволяє стверджувати, що за умов виключення з раціону одночасно обох вітамінів, А і Е, спостерігається різке зниження інтенсивності біосинтезу CoQ в тканині печінки щурів і внутрішньоклітинний перерозподіл CoQ. Зниження інтенсивності включення міченого тирозину в СоQ печінки щурів за умов А,Е-гиповітамінозу може бути пов'язане саме з виключенням із експериментальної дієти вітаміну Е (Донченко Г.В., 2008).

Отримані експериментальні дані стали основою для вибору моделей (зокрема Е-гіповітамінозу як адекватної моделі недостатності CoQ) та для обґрунтованого підходу до пошуку потенційних модуляторів біосинтезу CoQ в подальших дослідженнях.

Розробка композиції БАС - активаторів та модуляторів біосинтезу CoQ. Метою наступного етапу досліджень було визначити принципову можливість корекції CoQ-статусу організму дослідних тварин біологічно активними сполуками, що можуть бути потенційними активаторами ендогенного синтезу CoQ та впливати на його функціонування в ЛТЕ мітохондрій. Для перевірки їх можливостей було обрано наступні речовини: ПОБК (як попередник синтезу бензохінонового ядра), метіонін (як донор метильної та метоксильних груп в бензохіноновому ядрі молекули CoQ), фолієва кислота (що бере участь в біосинтезі сполук, які є донорами метильних та метоксильних груп на термінальних стадіях біосинтезу CoQ, а її похідне - N5-метил-тетрагідрофолат - є одним із донорів CH3-груп при біосинтезі метіоніну із гомоцистеїну), пантотенова кислота (необхідна для біосинтезу СоА) та аскорбінова кислота (необхідна як антиоксидант для систем відновлення б-токоферолу та CoQ). Дози препаратів були підібрані згідно із їхньою максимальною біологічною ефективністю з урахуванням взаємного впливу біологічно активних речовин за даними літератури: б-T - 10 мг/кг маси тіла, ПОБК - 50 мг/кг, метіонін - 150 мг/кг, фолієва кислота - 70 мг/кг, пантотенова кислота - 10 мг/кг, аскорбінова кислота - 10 мг/кг. Препарати вводили щурам дослідних груп в наступних композиціях: вітамін Е з ПОБК (ЕП), вітамін Е з ПОБК та метіоніном (ЕПМ), вітамін Е з ПОБК, метіоніном, фолієвою кислотою (ЕПМФ), вітамін Е з ПОБК, метіоніном, фолієвою та пантотеновою кислотами (ЕПМФП), вітамін Е з ПОБК, метіоніном, фолієвою, пантотеновою та аскорбіновою кислотами (ЕПМФПА).

Згідно з отриманими даними, всі використані нами комплекси БАС виявились в цілому активними і достовірно підвищували рівень CoQ в гомогенаті та мітохондріях печінки порівняно із контролем, але дещо відрізнялись за своєю ефективністю. Так, за ступенем підвищення рівня CoQ в гомогенатах печінки найбільш ефективним виявився комплекс ЕПМФП, а також комплекси ЕПМ та ЕПМФ (зростання на 123,2%, 100,1% та 89,0%, відповідно). Достовірне в порівнянні з контролем зростання вмісту CoQ в мітохондріях печінки відбувалось у щурів усіх дослідних груп, проте найвищі рівні CoQ (на відміну від гомогенатів) встановлено у тварин, що отримували комплексний препарат ЕПМФПА (на 163,7% вищій, ніж в контрольній групі). Серед інших груп найбільш значне збільшення вмісту CoQ в мітохондріях печінки потрібно відмітити у тварин, що отримували комплекси ЕПМ та ЕПМФП (на 118,9% та 114,8% в порівнянні із контролем, відповідно). На відміну від тканини печінки в тканині серця вміст CoQ достовірно в порівнянні із контролем зростав у тварин, що отримували комплекси ЕПМ та ЕПМФ (на 150,2% та 155,8%, відповідно).

Зростання вмісту CoQ в мітохондріях печінки тварин, які отримували досліджувані комплекси БАС, супроводжується достовірним активуванням функціонування CoQ-залежних ензиматичних систем NQR та SQR. Зокрема, найбільше зростання активності NQR було відмічено в групах, що отримували комплекси ЕПМ та ЕПМФПА (на 63,6% і 47,9% в порівнянні з контролем, відповідно). В цих же групах відбувалось найбільше зростання активності SQR (на 92,8% та 128,5% в порівнянні з контролем, відповідно). Порівняно незначне зростання активності обох ензиматичних систем в мітохондріях печінки відбувається за дії комплексу ЕПМФП, що, можливо, пояснюється зниження ефективності комплексу при додаванні пантотенової кислоти без аскорбінової кислоти як антиоксиданта.

Згідно з отриманими експериментальними даними, найбільш ефективним стабільно виявився комплекс ЕПМ, який значно підвищує вміст CoQ в гомогенатах печінки і серця, мітохондріях печінки, а також активність CoQ-залежних ензимів ЛТЕ мітохондрій печінки щурів.

Таким чином, в даній серії досліджень було продемонстровано принципову можливість корекції вмісту CoQ та його функціональної активності як коензима ензиматичних систем ЛТЕ мітохондрій за допомогою введення комплексів попередників та модулятора його біосинтезу тваринам, що утримуються на стандартному раціоні віварію. Проте отримані на цьому етапі результати не давали змогу з'ясувати, чи можливо здійснювати вплив на вміст та функціональну активність CoQ за умов його недостатності різного ґенезу та за патологічних станів. Звідси виникає необхідність експериментально визначити можливість впливу на вміст та функціональну активність CoQ комплексів попередників та модуляторів його біосинтезу за умов індукованих патологічних станів. Цей підхід нами було використано в подальших дослідженнях.

Вміст CoQ та активність CoQ-залежних оксидоредуктаз тканин щурів за умов Е-гіповітамінозу і дії комплексів попередників та модуляторів біосинтезу CoQ. Для більш повної характеристики стимуляції біосинтезу та функціонування CoQ необхідно було дослідити особливості впливу обраних БАС на вміст CoQ та CoQ-залежні біоенергетичні процеси за умов недостатності CoQ, коректною моделлю якої є Е-гіповітаміноз (Донченко Г.В., 1988). В цій серії досліджень як БАС, що можуть бути попередниками та модуляторами біосинтезу CoQ, були використані ПОБК, метіонін, фолієва кислота та пантотенова кислота, в тому ж дозуванні, що і в попередній серії досліджень. Препарати вводили щурам в таких композиціях: вітамін Е з ПОБК (ЕП); вітамін Е з ПОБК та метіоніном (ЕПМ); вітамін Е з ПОБК, метіоніном, фолієвою кислотою (ЕПМФ); вітамін Е з ПОБК, метіоніном, фолієвою та пантотеновою кислотами (ЕПМФП). Комплекси ЕП, ЕПМ, ЕПМФ, ЕПМФП вводили тваринам, що утримувались на стандартному раціоні, та тваринам з Е-гіповітамінозом протягом 10 днів перорально один раз на добу.

За умов експериментального Е-гіповітамінозу вміст вітаміну Е в печінці дослідних тварин достовірно знижувався на 60,4% в порівнянні з контрольною группою. Значне зниження вмісту вітаміну Е в печінці свідчить про коректне відтворення моделі Е-гіповітамінозу. Введення дослідним тваринам, що утримувались на Е-авітамінозному раціоні, комплексів БАС (кожний з яких містить вітамін Е) супроводжувалось зростанням вмісту вітаміну Е, достовірним в порівнянні із цим показником як у тварин групи «Е-гіповітаміноз», так і у тварин контрольної групи.

За умов Е-гіповітамінозу спостерігали значне, статистично достовірне зниження вмісту CoQ в печінці (на 23,0% в порівнянні із контролем) та в серці (на 50,8% в порівнянні із контролем) дослідних тварин, що добре узгоджується із даними літератури. Більш виражене зниження вмісту CoQ в серці, ніж в печінці ймовірно пояснюється комплексом чинників, головними з яких можна вважати більш активне функціональне використання CoQ в серцевому м'язі, який може мати вищій рівень метаболізму речовин, пов'язаних із виробленням енергії, ніж тканина печінки, а також накопичуючу здатність тканини печінки, особливо щодо жиророзчинних вітамінів та вітаміноподібних сполук.

Введення комплексів БАС тваринам, що утримувались на Е-авітамінозному раціоні, супроводжувалось зростанням вмісту CoQ як в тканині печінки, так і в тканині серця. Зростання цього показника в печінці відбувалось у тварин усіх дослідних груп, вміст CoQ достовірно перевищував як рівень його у тварин групи «Е-гіповітаміноз», так і у тварин контрольної групи. В гомогенатах серця збільшення вмісту CoQ в групах, що отримували додатково до Е-авітамінозного раціону комплекси БАС, складало від 127,0% (група ЕПМФ) до 265,4% (група ЕПМФПаА) в порівнянні із групою з експериментальним Е-гіповітамінозом. В останньому випадку вміст CoQ в тканині серця також достовірно перевищував цей показник у контрольній групі. В решті експериментальних груп за дії комплексів БАС спостерігали статистично достовірну корекцію цього показника до рівня контролю.

За умов Е-гіповітамінозу спостерігали значне пригнічення активності CoQ-залежних ензиматичних систем ЛТЕ. Активність NQR в мітохондріях печінки складала лише 29,7%, а активність SQR - 16,4% від рівня цих показників в контрольній групі (рис. 1). У тварин груп, які утримувались на Е-авітамінозному раціоні та додатково отримували комплекси попередників та модуляторів біосинтезу CoQ, спостерігали суттєве зростання активностей NQR та SQR в порівнянні із цими показниками у тварин з Е-гіповітамінозом.

Значне зниження вмісту CoQ в органах тварин групи «Е-гіповітаміноз» супроводжувалось зростанням активності процесів ПОЛ в тканинах цих органів, про що свідчить зокрема зростання вмісту ТБК-активних продуктів в печінці на 135,0% в порівнянні із контрольною групою за умов спонтанного ПОЛ. За введення тваринам, які утримуються на Е-авітамінозному раціоні, комплексів БАС відбувається певної міри відновлення про- та антиоксидантного балансу в тканині печінки, проте вміст ТБК-активних продуктів залишається достовірно вищим, ніж в контрольній групі.

Отримані результати щодо активності CoQ-залежних ензиматичних комплексів ЛТЕ мітохондрій свідчать, що зниження вмісту CoQ в тканині печінки дослідних тварин за умов експериментального Е-гіповітамінозу супроводжується значним зниженням його функціональної активності в складі ЛТЕ. На користь зниження функціональної активності CoQ як антиоксиданта свідчать і результати визначення вмісту ТБК-активних продуктів в печінці тварин за умов спонтанного та індукованого залізом (III) ПОЛ. За введення дослідним тваринам, що утримуються на Е-авітамінозному раціоні, комплексів попередників та модуляторів біосинтезу CoQ спостерігається не тільки збільшення його пулу в печінці та серці, але і корекція функціональної активності CoQ в цих органах.

За більшістю оцінюваних показників як в дослідженнях на щурах, які утримувались на стандартному раціоні віварію, так і в дослідженнях на тваринах із експериментальним Е-гіповітамінозом різниця між ефектом комплексів ЕПМ, ЕПМФ, ЕПМФП та ЕПМФПА була порівняно незначною, часто статистично недостовірною. Крім того, сам по собі вміст CoQ не визначає рівня його функціональної активності, зокрема участі у функціонуванні оксидо-редуктазних ензиматичних систем ЛТЕ. Значна складність та багатокомпонентність вказаних комплексів ЕПМФП і ЕПМФПА та порівняно незначне перевищення отримуваних при їх введенні показників над показниками простіших комплексів стали причинами, за якими ці комплекси нами було визнано менш перспективними для подальших досліджень. В подальшому наші дослідження були зосереджені на комплексі вітаміну Е, ПОБК та метіоніну (ЕПМ), який виявився за багатьма характеристиками не менш ефективним, ніж інші, складніші комплекси. Метою наступної серії досліджень було з'ясування співвідношення дозування компонентів в рамках такого комплексу, за якого можна очікувати досягнення оптимальної ефективності за більшістю визначених параметрів.

Дослідження із підбору оптимального дозування та співвідношення компонентів композиції БАС - попередників та модуляторів біосинтезу CoQ. З метою додаткової інтенсифікації процесів біосинтезу CoQ, спираючись на отримані результати, на цьому етапі досліджень було вирішено підібрати найбільш ефективне співвідношення компонентів в обраній на попередньому етапі композиції вітаміну Е з ПОБК та метіоніном в умовах моделі експериментального Е-гіповітамінозу.

Експеримент проводили на моделі Е-гіповітамінозу. Тварин за принципом аналогів було розподілено по експериментальних групах, які додатково до Е-авітамінозного раціону отримували наступні речовини:

· Контроль: дистильовану воду та олійний розчин вітаміну Е в розрахунку 0,1 мг б-токоферолацетату фармакопейного на 1 тварину за добу.

· Е-гіповітаміноз: оливкову олію та дистильовану воду.

· І група: 10 мг/кг E, 50 мг/кг ПОБК, 150 мг/кг метіоніну.

· ІІ група: 10 мг/кг E, 100 мг/кг ПОБК, 100 мг/кг метіоніну.

· ІІІ група: 25 мг/кг E, 100 мг/кг ПОБК, 100 мг/кг метіоніну.

· ІV група: 10 мг/кг E, 50 мг/кг ПОБК, 150 мг/кг метіоніну, 75 мг/кг ДМСО.

· V група: 10 мг/кг E, 100 мг/кг ПОБК, 100 мг/кг метіоніну, 75 мг/кг ДМСО.

· VI група: 25 мг/кг E, 100 мг/кг ПОБК, 100 мг/кг метіоніну, 75 мг/кг ДМСО.

Вказані речовини вводили per os один раз на добу протягом 10 днів.

Як і на попередньому етапі досліджень, за умов утримування щурів на Е-авітамінозному раціоні спостерігали достовірне зниження вмісту CoQ в гомогенатах печінки (на 41,3%) та серця (на 32,1%) в порівнянні із цими ж показниками контрольної групи. У щурів усіх експериментальних груп крім груп III та V спостерігали достовірне в порівнянні з тваринами групи «Е-гіповітаміноз» зростання вмісту CoQ в гомогенатах печінки. Найбільш вираженим зростання було в групах II (на 52,0%) та VI (на 127,8%). В гомогенатах серця всіх дослідних груп вміст CoQ достовірно зростав в порівнянні із групою «Е-гіповітаміноз». Особливо вираженим зростання було в групах, тварини яких отримували ДМСО в складі комплексу БАС: в цих групах, а також в групі III вміст CoQ в гомогенатах серця достовірно перевищував цей показник навіть у контрольній групі.

Вміст CoQ в мітохондріях печінки та серця щурів групи «Е-гіповітаміноз» знижувався на 63,6% та 32,1% відповідно (рис. 2). Таке зниження є пропорційним до зменшення загального вмісту CoQ в тканинах цих органів. Вміст CoQ в мітохондріях печінки щурів усіх груп, тварини яких отримували комплекси попередників та модуляторів його біосинтезу, був достовірно вищим не тільки в порівнянні з цим показником для тварин групи «Е-гіповітаміноз», але і (крім групи VI) в порівнянні із цим показником у тварин контрольної групи.

В мітохондріях серця тварин дослідних груп, крім групи II, вміст CoQ достовірно не змінювався в порівнянні з цим показником для щурів групи «Е-гіповітаміноз». Можна передбачити, що за умов достатньо ефективного біосинтезу CoQ в цьому органі при отримуванні тваринами комплексів попередників та модуляторів біосинтезу CoQ не відбувається внутрішньоклітинний перерозподіл CoQ саме в мітохондріальні мембрани.

Зниження вмісту CoQ в мітохондріях печінки тварин групи «Е-гіповітаміноз» супроводжувалось достовірним в порівнянні з контролем зниженням активності CoQ-залежних ензиматичних комплексів ЛТЕ мітохондрій. Активність NQR зменшувалась на 36,1%, активність SQR - на 39,4%. У тварин експериментальних груп спостерігали зростання активності NQR та SQR до рівня, що не відрізнявся від рівня активності цих комплексів в контролі.

В мітохондріях серця спостерігали значне зниження активності SQR у тварин групи «Е-гіповітаміноз» в порівнянні з контролем (на 68,3%). В усіх експериментальних групах цей показник зростав, а у випадку групи II достовірно не відрізнявся і від рівня контролю. Достовірного зростання активності NQR в мітохондріях в порівнянні із цим показником у щурів групи «Е-гіповітаміноз» не відбувалось в жодній дослідній групі, що, ймовірно, пояснюється низьким вмістом CoQ в мітохондріях серця всіх дослідних груп.

Потрібно відзначити, що обраний на попередньому етапі комплекс вітаміну Е, ПОБК та метіоніну виявився ефективним щодо корекції вмісту CoQ в тканині та мітохондріях печінки та серця та корекції активності CoQ-залежних ензиматичних систем ЛТЕ мітохондрій цих органів у тварин за умов експериментального Е-гіповітамінозу.

Необхідно було також продемонструвати можливість корекції вмісту та функціональної активності CoQ за введення попередників та активаторів його біосинтезу за умов інших патологічних станів, що призводять до порушення синтезу CoQ. Ці міркування були взяті до уваги при плануванні наступного етапу досліджень.

Дослідження ефективності комплексу попередників та активаторів біосинтезу CoQ на моделі адріаміцин-індукованої кардіоміопатії. Адріаміцин (доксорубіцин) є відомим антибіотиком антрациклінового ряду і одним із найбільш ефективних засобів в онкотерапії. Проте досить часто при застосуванні цього лікарсього препарату розвивається кардіоміопатія і серцева недостатність (Quiles J.L., 2002). Пошкоджуючий вплив адріаміцину на серцевий м'яз пов'язують із активуванням процесів вільнорадикального окислення і розвитком оксидативного стресу, порушенням процесу транскрипції в ядрах, окислювального фосфорилування в ЛТЕ мітохондрій внаслідок зв'язування адріаміцину з кардіоліпіном внутрішньої мембрани мітохондрій (Li T., 2000). Як показано в інших роботах, застосування адріаміцину супроводжується достовірним зниженням вмісту CoQ. Дефіцит CoQ призводить до порушення біоенергетичного обміну, що може стати однією із причин розвитку адріаміцин-індукованої кардіоміопатії (Quiles J.L., 1999). Отже, метою даного етапу роботи було дослідження дії комплексів активаторів і модуляторів біосинтезу CoQ на біоенергетичні процеси в клітинах печінки та серця щурів за умов дії адріаміцину.

Тварин було розділено на 4 групи: 1 група - контрольні тварини, що отримували ін'єкцію фізіологічного розчину; 2 група (А) - тварини, яким вводили розчин адріаміцину; 3 група (А+ЕПМ) - тварини, які разом з адріаміцином отримували вітамін Е, ПОБК та метіонін; 4 група (А+ЕПМД) - тварини, які разом з адріаміцином отримували Е, ПОБК, метіонін і ДМСО.

Одним із маркерів ушкодження серцевого м'язу за умов модельної адріаміцин-індукованої кардіоміопатії у гризунів є атрофія серця (Zhu W., 2008). В умовах наших досліджень введення адріаміцину в дозі 2,2 мг/кг маси тіла призводило до атрофії серцевого м'язу, вирахуваної як достовірне зниження відношення маси серця до маси тіла експериментальних тварин в порівнянні із цим показником у щурів контрольної групи (з 2,770,14 г/кг у інтактних тварин до 2,380,14 г/кг у тварин за умов введення адріаміцину, p<0,05). Введення комплексів БАС не призводило до зростання цього показника (в групах «А+ЕПМ» та «А+ЕПМД» відповідно 2,460,11 і 2,230,10 г/кг, p<0,05).

За розвитку адріаміцинової кардіоміопатії відбувається інтенсифікація вільнорадикальних процесів в тканинах печінки та серця, що супроводжується зростанням вмісту вторинних продуктів ПОЛ в цих органах у тварин групи «А» в порівнянні із цим показником у тварин контрольної групи (рис. 3). За умов введення тваринам комплексів ЕПМ і ЕПМД відбувається нормалізація вмісту сполук, які реагують з ТБК (групи «А+ЕПМ» та «А+ЕПМД»).

Вміст первинних продуктів ПОЛ - дієнових кон'югатів - в гомогенатах печінки і серця дослідних тварин достовірно зростає за розвитку адріаміцин-індукованої кардіоміопатії (група «А») в порівнянні з цим показником у тварин контрольної групи. За введення щурам комплексів ЕПМ і ЕПМД додатково до адріаміцину спостерігається достовірне зниження вмісту дієнових кон'югатів в тканині цих органів в порівнянні із таким показником у тварин групи «А» до рівня цього показника у тварин контрольної групи (дані не наводяться).

Спостерігали збільшення вмісту продуктів вільнорадікальні оксилення протеїнів (у вигляді сполук, що реагують із 2,4-динітрофенілгідразином) в гомогенатах печінки та серця щурів за введення їм адріаміцину (група «А») в порівнянні із цим показником у тварин контрольної групи. За введення тваринам досліджуваних комплексів відбувалось достовірне зменшення вмісту продуктів вільнорадикального оксилення протеїнів в порівнянні із рівнем цих показників у тварин групи «А (дані не наводяться).

Таким чином, за введення тваринам адріаміцину спостерігається зростання активності прооксидантних процесів в тканині печінки та особливо серця. Отримані результати підтверджують уявлення про те, що в основі адріаміцин-індукованого ураження серця значною мірою знаходяться саме зміни про- та антиоксидантного балансу та активація прооксиданитних процесів в метаболічно активних тканинах з високим рівнем енергозалежності, що особливо характерно для серцевого м'язу. Зменшення вмісту продуктів перекисного оксилення ліпідів та окисної модифікації протеїнів в печінці та серці дослідних тварин за введення їм комплексів БАС відбиває зниження інтенсивності прооксидантних процесів в цих органах в порівнянні із такими у тварин, що отримували тільки ін'єкції адріаміцину без корекції.

Введення тваринам адріаміцину супроводжувалось також змінами активності ензимів системи антиоксидантного захисту в тканинах. Зокрема, рівень активності каталази в гомогенаті печінки щурів групи «А» був достовірно нижчим за такий в гомогенаті печінки тварин контрольної групи. Введення тваринам досліджуваних комплексів на фоні ін'єкцій адріаміцину приводило до достовірного зростання активності каталази в цьому органі в порівнянні із тваринами групи «А». Зміни активності каталази в тканині серця тварин мали протилежний характер: спостерігали достовірне зростання активності цього ензиму в гомогенаті серця тварин, які отримували адріаміцин (група «А»), в порівнянні з цим показником у щурів контрольної групи. Натомість введення тваринам комплексів БАС приводило до достовірного зниження активності каталази в гомогенаті серця тварин груп «А+ЕПМ» і «А+ЕПМД» в порівнянні із цим показником у тварин групи «А»; рівень активності каталази в тканині серця тварин даних дослідних груп був близьким до цього показника у тварин контрольної групи (дані не наводяться).

Активність супероксиддисмутази зростала в гомогенаті як печінки, так і серця тварин, що отримували ін'єкції адріаміцину (група «А») в порівнянні із активністю цього ензима в тканинах щурів контрольної групи. Введення тваринам досліджуваних комплексів БАС приводило в більшості випадків до достовірного зниження активності супероксиддисмутази як в гомогенатах печінки, так і в гомогенатах серця в порівнянні із тими ж показниками у тварин групи «А». Часто таке зниження відбувалось до рівня, аналогічного такому у тварин контрольної групи (дані не наводяться).

Потрібно зауважити, що саме лише зниження активності каталази в печінці дослідних тварин не веде до зростання активності прооксидантних процесів, на користь чого свідчать і отримані нами дані про відносно менше, ніж в тканині серця, зростання вмісту продуктів вільнорадикального окислення протеїнів в тканині печінки тварин групи «А». Це добре узгоджується і з даними інших авторів (Ho Y.S., 2004). В серцевому м'язі ж збільшення активності обох зазначених антиоксидантних ензимів не здатне компенсувати значне підвищення рівня прооксидантної активності, що спостерігається за введення дослідним тваринам адріаміцину.

Пригнічення супероксиддисмутази та каталази в тканині печінки та серця тварин, які отримували комплексні препарати БАС на фоні введення адріаміцину (групи «А+ЕПМ» і «А+ЕПМД»), добре корелює зі зниженням активності прооксидантних процесів у тварин експериментальних груп в порівнянні із групою «А». Зростання вмісту та функціональної активності CoQ, яке - як буде показано нижче - відбувається в тканинах та субклітинних фракціях органів тварин за введення комплексів БАС, також може справляти значний вплив на вказані процеси. Крім того, як було показано в інших роботах (Ronchi V.P., 2010), метіонін (який входить до складу обох використаних комплексів БАС) може істотно впливати на стан про- та антиоксидантного балансу за умов оксидативного стресу, і зокрема на активність каталази.

За умов введення дослідним тваринам адріаміцину (група «А») спостерігається статистично достовірне зниження вмісту CoQ в гомогенаті та мітохондріях, але не в ядрах печінки в порівнянні із цими ж показниками у тварин контрольної групи. В субклітинних фракціях серця тварин групи «А» такого зниження не відбувалось. За введення щурам комплексів БАС (групи «А+ЕПМ» та А+ЕПМД») відбувається зростання вмісту СоQ в гомогенаті та мітохондріальній фракції печінки щурів в більшості випадків до рівня що достовірно не відрізнявся від такого у тварин контрольної групи.

Високий вміст СоQ в субклітинних фракціях серця тварин з адріаміцин-індукованою кардіоміопатією добре корелює із підвищеною активністю ензимів антиоксидантного захисту в цьому ж органі. Вірогідно, основною причиною зростання вмісту СоQ в мітохондріях серця тварин групи «А» в порівнянні із цими показниками у тварин контрольної групи є необхідність компенсувати зростання активності прооксидантних процесів в цьому органі. Зниження інтенсивності прооксидантних процесів та збільшення активності систем антиоксидантного захисту за введення тваринам досліджуваних комплексів зменшують потребу в CoQ в якості антиоксиданта, що ймовірно пояснює той факт, що вміст його в гомогенаті печінки та мітохондріальних фракціях печінки і серця тварин груп «А+ЕПМ» і «А+ЕПМД» залишається загалом близьким до таких показників у тварин контрольної групи. Проте в ядерній фракції обох органів вміст CoQ у тварин групи «А+ЕПМ» залишається високим, близьким до цього показника у тварин групи «А», що також може свідчити на користь припущення про роль CoQ в корекції ефекту адріаміцину на функціонування ядерного апарату, що не пов'язане напряму із прооксидантною дією.

Ще однією причиною зростання вмісту CoQ в мітохондріях серця тварин за введення їм адріаміцину, імовірно, є функціональна необхідність компенсувати негативний вплив зростання активності прооксидантних процесів за цих умов на функціонування ЛТЕ мітохондрій, адже пригнічення генерації ATP в кардіоміоцитах може мати суттєві негативні наслідки для роботи серцевого м'язу. Проте саме по собі зростання вмісту CoQ не веде до збільшення його функціональної активності і до зростання ефективності функціонування ЛТЕ, особливо у випадку, коли активність ензиматичних систем в ланцюзі залишається невисокою.

Активність NQR в мітохондріях печінки щурів усіх експериментальних груп достовірно не відрізнялась від такої у щурів контрольної групи. На відміну від активності NQR активність SQR в мітохондріях печінки щурів з адріаміцин-індукованою кардіоміопатією була достовірно нижчою, ніж цей же показник у тварин контрольної групи. Введення комплексів попередників та модулятора біосинтезу CoQ на фоні ін'єкцій адріаміцину приводило до зростання активності SQR в мітохондріях печінки щурів груп «А+ЕПМ» і «А+ЕПМД» до рівня, який достовірно не відрізнявся від такого у тварин контрольної групи.

Зміни цитохромоксидазної активності в мітохондріях печінки щурів дослідних груп були подібними до змін активності SQR. Пригнічення активності цитохромоксидази у щурів за введення адріаміцину (група «А») в порівнянні із цим показником у тварин контрольної групи було відносно більш вираженим, ніж пригнічення активності SQR в цій субклітинній фракції у щурів даної групи. У тварин груп, які отримували комплекси попередників та модулятора біосинтезу CoQ, рівень активності цитохромоксидази не відрізнявся достовірно від цього показника у контрольних тварин.

Потрібно зауважити значну подібність відповіді ензиматичних комплексів ЛТЕ мітохондрій серця і печінки на вказані чинники, що узгоджується із даними інших дослідників (Valls-Belles V., 2010). Як в мітохондріях серця, так і в мітохондріях печінки не відбувалось значних змін активності комплексу I ЛТЕ при введені дослідним тваринам адріаміцину (група «А»). Проте негативний ефект цього антибіотика на функціонування комплексів II та IV був достатньо вираженим, достовірним в порівнянні із контролем як в мітохондріях печінки, так і в мітохондріях серця. Це може бути пов'язаним із активацією вільнорадикальних процесів, зокрема процесів ПОЛ та оксилення протеїнів (яка була показана в досліді), що можуть, з одного боку, порушувати структурну цілісність внутрішньої мітохондріальної мембрани, викликаючи у свою чергу порушення в роботі даних ензиматичних систем, а з іншого боку прямо приводити до ушкодження власне молекул цих протеїноівих комплексів. Ще одним механізмом впливу адріаміцину на функціонування ЛТЕ мітохондрій може бути пригнічення біосинтезу протеїнових молекул, які входять до складу даних ензиматичних систем - що веде до зниження кількості активних молекул ензимів і, відповідно, зменшення загальної активності досліджуваних ензиматичних систем.

В інших роботах було показано захисний ефект екзогенного CoQ проти адріаміцин-індукованого ушкодження в печінці щурів (Lenaz G., 1993). В наших дослідженнях продемонстровано можливість корекції за допомогою комплексів попередників та модуляторів біосинтезу CoQ негативних наслідків введення дослідним тваринам адріаміцину в тканині та субклітинних фракціях печінки та серця, зокрема зростання інтенсивності процесів вільнорадикального оксилення ліпідів та протеїнів, зниження вмісту CoQ та активності ензиматичних комплексів ЛТЕ мітохондрій, змін активності ензимів антиоксидантного захисту.

Висновки

убіхінон антиоксидантний ензим адріаміцин

В дисертаційному досліджені показано, що за умов експериментальних патологічних станів в тканині та мітохондріях печінки та серця щурів відбуваються зміни вмісту та функціональної активності убіхінону і доведено можливість корекції таких змін шляхом введення дослідним тваринам комплексів попередників та модуляторів біосинтезу убіхінону.

1. За умов експериментального А,Е-гіповітамінозу із використанням радіоактивно міченого тирозину - попередника убіхінону - спостерігаються зниження включення радіоактивної мітки до убіхінону субклітинних фракцій та зміни в пропорціях такого включення між фракціями, що свідчить про різко виражене пригнічення біосинтезу убіхінону та перерозподіл новосинтезованого убіхінону між субклітинними фракціями в тканині печінки піддослідних тварин.

2. За умов Е-гіповітамінозу відбувається зниження вмісту убіхінону, активності убіхінон-залежних ензиматичних систем ланцюга транспорту електронів мітохондрій, зростання вмісту продуктів пероксидного окислення ліпідів в тканині та субклітинних фракціях печінки та серця дослідних тварин, що свідчить про зниження функціональної активності убіхінону в печінці дослідних тварин за Е-гіповітамінозу.

3. За введення щурам комплексів попередників (4-гідроксибензойна кислота, метіонін) та модуляторів (вітамін Е, пантотенова кислота, фолієва кислота, аскорбінова кислота) біосинтезу убіхінону за умов утримання їх на стандартному раціоні віварію та за Е-гіповітамінозу відбувається зростання вмісту убіхінону в гомогенатах та мітохондріях печінки та серця, підвищення активності убіхінон-залежних оксидо-редуктаз ланцюга транспорту електронів мітохондрій печінки та серця дослідних тварин. Отримані дані свідчать про ефективність вказаних комплексів щодо корекції вмісту та функціональної активності убіхінону за умов його недостатності.

4. Введення дослідним тваринам адріаміцину внутрішньом'язево в дозі
2,2 мг/кг маси тіла супроводжується розвитком атрофії серцевого м'язу, зниження вмісту убіхінону в тканині печінки та субклітинних фракціях печінки та серця, пригніченням активності ензиматичних систем ланцюга транспорту електронів в мітохондріях печінки і серця, зростанням вмісту продуктів вільнорадикального окислення ліпідів та протеїнів в гомогенатах печінки та серця, змінами активності ензимів антиоксидантного захисту. Виявлені порушення можуть бути однією з важливих причин кардіотоксичних та гепатотоксичних ефектів адріаміцину.

5. За введення дослідним тваринам на тлі застосування адріаміцину комплексів модулятора та попередників біосинтезу убіхінону відбувається корекція порушень вмісту убіхінону, активності ензиматичних систем ланцюга транспорту електронів мітохондрій, вмісту продуктів вільнорадикального окислення ліпідів та протеїнів.

6. Отримані експериментальні дані вперше дозволили розробити ефективні підходи для корекції кардіотоксичного впливу адріаміцину шляхом застосування комплексів попередників та модуляторів біосинтезу убіхінону.

7. Результати дисертаційного дослідження свідчать про широкий спектр дії комплексів попередників та модуляторів біосинтезу убіхінону і можуть бути науково-експериментальним обґрунтуванням для розробки препаратів, спрямованих на корекцію порушень обміну та функціональної активності убіхінону, які спостерігаються за умов пригнічення його біосинтезу за патологічних станів різного генезу, зокрема Е-гіповітамінозу та адріаміцин-індукованої кардіоміопатії.

Література

1. Петухов Д.М. Комплексний вплив попередників та медіаторів біосинтезу убіхінону на його вміст та функціонування убіхінон-залежних ферментних систем / Д.М. Петухов, Г.В. Донченко, І.В. Кузьменко, О.Б. Кучменко // Наукові записки НаУКМА. - 2004. - Т.29. - С. 23 - 27.

2. Кучменко О.Б. Показники біоенергетичного обміну клітин інтактних тварин при введенні попередників і медіаторів біосинтезу убіхінону / О.Б. Кучменко, Д.М. Петухов, Г.В. Донченко // Медична хімія. - 2004. - Т. 6, № 3. - С. 88-90.

3. Донченко Г.В. Біохімічні властивості і функціональна роль убіхінону (CoQ). Практичні аспекти застосування / Г.В. Донченко, О.Б. Кучменко, Д.М. Петухов // Український біохімічний журнал. - 2005. - Т. 77, № 5. - С. 24 - 36.

4. Кучменко О.Б. Регуляція вмісту убіхінону й активності убіхінонзалежних оксидоредуктазних систем ланцюга транспорту електронів за умов вітамін Е-гіповітамінозу / О.Б. Кучменко, Д.М. Петухов, Г.В. Донченко // Медична хімія.- 2006. - Т. 8, №3. - С. 38 - 40.

5. Тімощук С.В. Вплив попередників біосинтезу убіхінону in vivo на чутливість відкривання мітохондріальної пори у серці старих щурів / С.В. Тімощук, Г.Л. Вавілова, Н.А. Струтинська, О.Б. Кучменко, Д.М. Петухов, Г.В. Донченко, В.Ф. Сагач // Фізіологічний журнал. - 2008. - Т.54, № 3. - С. 3 - 9.

6. Донченко Г.В. Інтенсивність обмінних процесів та вміст убіхінону та убіхроменолу в печінці щурів за умов А,Е-гіповітамінозу / Г.В. Донченко, О.Б. Кучменко, Д.М. Петухов, О.М. Паливода, Л.О. Чернухіна // Укр. біохім. журнал. - 2008. - Т.80, №4. - С. 99 - 107.

Размещено на Allbest.ru