Субстратами и одновременно источниками энергии для транскрипции являются рибонуклеозидтрифосфаты (ЦТФ, ГТФ, АТФ, УТФ). Процесс осуществляется ДНК-зависимой РНК-полимеразой, которая у большинства изученных организмов представляет собой комплекс 4 и более неидентичных субъединиц, выполняющих разные роли. В ядрах эукариот обнаружены 3 специализированные РНК-полимеразы: РНК-полимераза I, синтезирующая 45 S пре-рРНК; РНК-полимераза II, ответственная за синтез пре-мРНК; РНК-полимераза III, синтезирующая пре-тРНК и 5 S рРНК.

В процессе транскрипции различают 3 стадии: инициацию, элонгацию и терминацию (Рис. 6.3). Инициация начинается с активации промотора (знак начала транскрипции). Это происходит при участии особого белка - ТАТА-фактора, называемого так потому, что он взаимодействует со специфической последовательностью нуклеотидов промотора - ТАТААА- (ТАТА-бокс). Присоединение ТАТА-фактора облегчает взаимодействие промотора с РНК-полимеразой. Факторы инициации вызывают изменение конформации фермента и раскручивание спирали ДНК с образованием транскрипционной вилки, в которой матрица ДНК доступна для инициации синтеза цепи РНК. РНК-полимераза синтезирует небольшой олигонуклеотид. После этого к ней присоединяются факторы элонгации, значительно повышающие активность фермента и облегчающие расхождение цепей ДНК. РНК-полимераза перемещается вдоль молекулы ДНК и копирует одну из её цепей, последовательно присоединяя нуклеотиды в образующейся РНК в соответствии с принципом комплементарности. Синтез цепи РНК идет от 5- к 3-концу, при этом матричная цепь ДНК всегда антипараллельна синтезируемой мРНК. По мере движения РНК-полимеразы растущая цепь РНК отходит от матрицы, а двойная спираль ДНК позади фермента восстанавливается. Когда РНК-полимераза достигает конца копируемого участка (терминатора), фермент и первичный транскрипт отделяются от матрицы. Этот этап происходит с участием факторов терминации.

Рис. 6.3 Схема процесса транскрипции

Регуляция транскрипции

Транскрипция не связана с фазами клеточного цикла; она может ускоряться и замедляться в зависимости от потребности клетки или организма в определенном белке. Такое избирательное функционирование возможно благодаря существованию механизмов регуляции генной экспрессии, которые действуют на разных уровнях. С помощью этих механизмов клетка экономит свои ресурсы и в каждый момент времени синтезирует определенный набор веществ, а не весь возможный их спектр.

Среди нескольких уровней регуляции экспрессии генов наиболее существенной и часто используемой является регуляция синтеза белков, которая осуществляется на уровне транскрипции. Суть такого типа регуляции сводится к ускорению или замедлению процессов транскрипции определенных генов, что в конечном итоге отражается на скорости синтеза их продуктов.

Наилучшим образом регуляция транскрипции генов изучена у прокариот. Их особенностью является организация генов, участвующих в одном метаболическом пути, в особые структурные единицы - опероны. Оперонами называют участки молекулы ДНК, которые содержат информацию о группе функционально связанных структурных белков, и регуляторную зону, контролирующую транскрипцию этих генов. Структурные гены оперона экспрессируются согласованно: либо все сразу, либо ни один из них. Это дает возможность прокариотам «включать» и «выключать» транскрипцию такой группы генов одновременно. Связывание РНК-полимеразы с промотором зависит от присутствия белка-репрессора на смежном с промотором участке - операторе. Белок-репрессор (продукт гена-регулятора, не входящего в оперон) синтезируется в клетке с постоянной скоростью и имеет сродство к операторному участку. Структурные участки промотора и оператора частично перекрываются, поэтому присоединение белка-репрессора к оператору создает стерическое препятствие для присоединения РНК-полимеразы и соответственно делает невозможной транскрипцию структурных генов.

Гипотеза оперона была предложена Ф.Жакобом и Ж.Моно на основании данных, полученных при изучении свойств лактозного оперона E.coli, т.е. оперона, в котором закодированы белки, участвующие в усвоении лактозы. Клетки кишечной палочки обычно используют в качестве источника углерода глюкозу. Но, если в среде культивирования глюкозу заменить на лактозу, клетки в течение нескольких минут перестраиваются и начинают утилизировать лактозу. Теория оперона объясняет это явление следующим образом. В отсутствие индуктора (лактозы) белок-репрессор связан с оператором, блокируя таким образом транскрипцию структурных генов. Когда в среде появляется индуктор, т.е. лактоза, то он присоединяется к белку-репрессору, изменяет его конформацию, снижает сродство к оператору и способствует отделению репрессора от оператора. РНК-полимераза связывается со ставшим доступным промотором и транскрибирует структурные гены. Это явление называется индукцией синтеза белков.

Регуляция транскрипции генов высших организмов сходна с регуляцией экспрессии генов прокариот. Основное различие состоит в значительно большем количестве участков ДНК и регуляторных факторов, контролирующих этот процесс. Скорость транскрипции в основном определяется скоростью формирования инициаторного комплекса. В настоящее время идентифицировано более 100 белков, способных взаимодействовать со специфическими регуляторными последовательностями ДНК, влияя тем самым на процесс сборки транскрипционного комплекса. Эти белки имеют один или несколько доменов, обеспечивающих выполнение регуляторных функций:

ДНК-связывающие домены, ответственные за узнавание и связывание регуляторных факторов со специфическими участками на молекуле ДНК;

домены, активирующие транскрипцию за счет связывания с транскрипционными факторами, коактиваторами или РНК-полимеразой;

антирепрессорные домены, благодаря которым белки способны взаимодействовать с гистонами нуклеосом и освобождать участки ДНК для транскрипции;

домены, связывающие лиганды. Присоединение лиганда способствует формированию ДНК-связывающего участка, узнающего специфическую последовательность в регуляторной зоне ДНК и индуцирующего/подавляющего транскрипцию определенных генов. К лигандам-индукторам транскрипции относятся стероидные гормоны, ретиноевая кислота, кальцитриол и гормоны щитовидной железы. Репрессорами могут быть конечные продукты метаболических путей.

На молекуле ДНК на небольшом расстоянии до стартовой точки транскрипции имеются короткие специфические последовательности: ЦААТ-элемент, ЦГ-бокс и октамерный бокс, узнающие факторы транскрипции. Эти элементы есть во всех клетках, и постоянно транскрибируемые гены нуждаются только в них. В то же время для генов, подвергающихся адаптивной регуляции, обнаружены участки молекулы ДНК, более удаленные от промотора, но тоже участвующие в транскрипции. Эти нуклеотидные последовательности бывают двух типов. Энхансеры - участки ДНК, присоединение к которым регуляторных белков увеличивает скорость транскрипции. Если же участки ДНК, связываясь с белками, обеспечивают замедление транскрипции, то их называют сайленсерами (Рис. 6.4).

Рис. 6.4 Организация регуляторных блоков транскрипции

Процессинг РНК

Все виды РНК синтезируются в виде предшественников и нуждаются в процессинге (созревании).

Процессинг мРНК начинается с кэпирования. Фермент гуанилилтрансфераза гидролизует макроэргическую связь в молекуле ГТФ и присоединяет нуклеозиддифосфатный остаток 5-фосфатной группой к 5-концу пре-мРНК с образованием 5,5-фосфодиэфирной связи. Последующее метилирование остатка гуанина в составе ГТФ с образованием N₇-метилгуанозина завершает образование кэпа. Модифицированный 5-конец удлиняет время жизни мРНК, защищая её от действия 5-экзонуклеаз в цитоплазме. Кэпирование важно для обеспечения инициации трансляции, так как инициирующие кодоны распознаются рибосомой только если присутствует кэп. Наличие кэпа необходимо для работы ферментной системы, обеспечивающей удаление интронов.

3-конец пре-мРНК также подвергается модификации, при которой специальным ферментом полиА-полимеразой формируется полиА-последовательность, состоящая из 100-200 остатков адениловой кислоты. Наличие полиА-«хвоста» облегчает выход мРНК из ядра и замедляет её гидролиз в цитоплазме. Ферменты, осуществляющие кэпирование и полиаденилирование, избирательно связываются с РНК-полимеразой II, и в отсутствие полимеразы неактивны.

Первичный транскрипт представляет собой строго комплементарную матрице нуклеиновую кислоту, содержащую как кодирующие участки - экзоны, так и некодирующие - интроны. В ходе дальнейших стадий процессинга последовательности интронов «вырезаются» из первичного транскрипта, концы экзонов соединяются друг с другом. Такая модификация РНК называется сплайсингом. В результате сплайсинга из первичных транскриптов образуются молекулы «зрелой» мРНК.

Для некоторых генов описаны альтернативные пути сплайсинга и полиаденилирования одного и того же первичного транскрипта. Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованию разных изоформ одного и того же белка. Например, ген тропонина состоит из 18 экзонов и кодирует многочисленные изоформы этого мышечного белка, которые образуются в тканях на разных стадиях их развития.

Процессинг тРНК заключается в формировании 3-конца, удалении единственного интрона и модификациях азотистых оснований. Формирование акцепторного конца катализирует РНК-аза, представляющая собой 3-экзонуклеазу, поочередно удаляющую нуклеотиды до достижения последовательности ЦЦА, одинаковой для всех тРНК. Для некоторых тРНК формирование последовательности ЦЦА происходит в результате присоединения этих нуклеотидов.

Процессинг рРНК. Гены рРНК транскрибируются РНК-полимеразой I с образованием идентичных первичных транскриптов (45S рРНК). В результате процессинга из этого предшественника образуются 3 типа рРНК: 18S, входящая в состав малой субъединицы рибосом, а также 28S и 5,8S, локализующиеся в большой субъединице. Остальная часть транскрипта разрушается в ядре. 5S рРНК большой субъединицы транскрибируется отдельно.

Обратная транскрипция

Некоторые РНК-содержащие вирусы (вирус саркомы Рауса, ВИЧ) обладают уникальным ферментом - РНК-зависимой ДНК-полимеразой, часто называемой обратной транскриптазой или ревертазой. Этот фермент обладает время активностями. Первая из них - РНК-зависимая ДНК-полимеразная. Она обеспечивает синтез одноцепочечной комплементарной ДНК на матрице РНК. Вторая - рибонуклеазная активность, обеспечивающая удаление цепи РНК. Третья активность - ДНК-зависимая ДНК-полимеразная, обеспечивающая синтез второй цепи ДНК.

В результате образуется ДНК которая содержит гены, обуславливающие развитие рака (онкогены). Эта ДНК встраивается в геном эукариотической клетки, где может в течение многих поколений оставаться в скрытом состоянии. При определенных условиях такие гены могут активироваться и вызвать репликацию вируса, при других же условиях они могут способствовать перерождению такой клетки в раковую. Вирусы с таким механизмом размножения индуцируют развитие опухолей у животных и человека, поэтому их еще называют онкогенными вирусами (Рис. 6.5.).

Рис. 6.5 Обратная транскипция

7. Биосинтез белка

Завершающий этап реализации генетической информации, заключающийся в синтезе полипептидных цепей на матрице мРНК, называется трансляцией. В результате этого процесса генетическая информация с языка последовательности нуклеотидов в мРНК переводится (транслируется) на язык последовательности аминокислот в молекуле белка. Роль своеобразного «словаря» при этом переводе выполняет генетический код. Это свойственная всем живым организмам единая система записи наследственной информации в виде нуклеотидной последовательности, которая определяет порядок включения аминокислот в синтезирующуюся полипептидную цепь. Для генетического кода характерны следующие свойства:

· триплетность - каждая аминокислота кодируется тремя нуклеотидами;

· универсальность - код одинаков для всех организмов;

· однозначность (специфичность) - каждому кодону соответствует только одна определенная аминокислота;

· вырожденность - возможность кодирования одной и той же аминокислоты несколькими кодонами;

· неперекрываемость - кодоны считываются последовательно, один за другим, не перекрываясь;

· однонаправленность - декодирование мРНК осуществляется в направлении 53;

· колинеарность - соответствие последовательности аминокислот в белке последовательности нуклеотидов в зрелой мРНК;

· существование нескольких типов кодонов - инициирующего (АУГ), смысловых и терминирующих (УАА, УАГ, УГА).

Для осуществления синтеза белка необходимо согласованное взаимодействие большого числа компонентов (Табл. 7.1.).

Таблица 7.1

Компоненты белок-синтезирующей системы

Синтез белка происходит в несколько стадий:

· подготовка к синтезу, заключающаяся в активации аминокислот и образовании аминоацил-тРНК;

· собственно трансляция, состоящая из этапов инициации, элонгации и терминации;

· посттрансляционная модификация белка.

Активация аминокислот

На стадии подготовки к синтезу каждая из 20 протеиногенных аминокислот присоединяется б-карбоксильной группой к 2- или 3-гидроксильному радикалу акцепторного конца соответствующей тРНК с образованием сложноэфирной связи. Эти реакции, происходящие в цитозоле, катализирует семейство аминоацил-тРНК-синтетаз (аа-тРНК-синтетаз). Каждый фермент этого семейства узнаёт только одну определенную аминокислоту и те тРНК, которые способны связаться с этой аминокислотой. Аминоацил-тРНК-синтетазы активируют аминокислоты в 2 стадии. В ходе первой аминокислота присоединяется к ферменту и реагирует с АТФ с образованием богатого энергией промежуточного соединения - аденилата. На второй стадии аминокислотный остаток аминоациладенилата, оставаясь связанным с ферментом, взаимодействует с молекулой соответствующей тРНК с образованием аминоацил-тРНК. Энергия, заключенная в макроэргической связи аминоацил~тРНК, впоследствии используется на образование пептидной связи в ходе синтеза белка.

Высокая специфичность аа-тРНК-синтетаз в связывании аминокислоты с соответствующими тРНК лежит в основе точности трансляции генетической информации. В активном центре этих ферментов есть 4 специфических участка для узнавания: аминокислоты, тРНК, АТФ и четвертый - для присоединения молекулы Н₂О, которая участвует в гидролизе неправильных аминоациладенилатов. То есть, в активном центре этих ферментов существует корректирующий механизм, обеспечивающий немедленное удаление ошибочно присоединенного аминокислотного остатка.

Аминокислота, присоединяясь к тРНК, в дальнейшем не определяет специфических свойств аа-тРНК, её структуру не узнает ни рибосома, ни мРНК. И участие конкретной аминокислоты в синтезе белка зависит только от структуры тРНК, а точнее, от комплементарного взаимодействия антикодона аминоацил-тРНК с кодоном мРНК. Иными словами, молекулы тРНК в синтезе белка играют роль адапторов, т.е. приспособлений, при помощи которых аминокислоты включаются в определенном порядке в растущую полипептидную цепь.

Синтез белка у эукариот

В ходе синтеза белка считывание информации с мРНК идет в направлении от 5- к 3-концу, обеспечивая синтез пептида от N- к C-концу. События на рибосоме включают этапы инициации, элонгации и терминации (Рис.7.1.).

Инициация трансляции представляет собой процесс, в ходе которого происходит образование комплекса, включающего инициирующую метионил-тРНК (мет-тРНК_i), мРНК и рибосому. В этом процессе участвуют не менее 10 факторов инициации (eIF). Первоначально 40S субъединица рибосомы соединяется с фактором инициации, который препятствует её связыванию с 60 S субъединицей, но стимулирует объединение с мет-тРНК_i, ГТФ и другим фактором инициации. Этот сложный комплекс связывается с 5-концом мРНК при участии нескольких eIF, один из которых присоединяется к кэп-участку. Прикрепившись к мРНК, 40S субъединица начинает скользить по некодирующей части мРНК до тех пор, пока не достигнет инициирующего кодона АУГ кодирующей нуклеотидной последовательности. Скольжение 40S субъединицы по мРНК сопровождается гидролизом АТФ, энергия которого затрачивается на преодоление участков спирализации в нетранслируемой части мРНК.

Достигнув начала кодирующей последовательности мРНК, 40S субъединица останавливается и связывается с другими факторами инициации, ускоряющими присоединение 60S субъединицы и образование 80S рибосомы за счет гидролиза ГТФ. При этом формируются А (аминоацильный) и Р (пептидильный) центры рибосомы, причем в Р-центре оказывается кодон АУГ с присоединенной к нему мет-тРНК_i.

Элонгация. На данном этапе полипептидная цепь удлиняется за счет ковалентного присоединения последующих аминокислот, каждая из которых доставляется к рибосоме и встраивается в определенное положение с помощью соответствующей тРНК.

Это самый продолжительный этап белкового синтеза. В начале данного этапа в Р-центре находится инициирующий кодон с присоединенной к нему мет-тРНК_i, а в А-центре - триплет, кодирующий включение следующей аминокислоты синтезируемого белка. Включение каждой аминокислоты происходит в 3 стадии.

аа-тРНК следующей входящей в белок аминокислоты связывается с А-центром рибосомы. Включение аа-тРНК в рибосому происходит за счет энергии гидролиза ГТФ при участии белкового фактора элонгации.

Метионин от инициаторной метионил-тРНК, находящейся в Р-центре, присоединяется к б-NH₂-группе аминоацильного остатка аа-тРНК А-центра с образованием пептидной связи. Эта реакция называется реакцией транспептидации и катализируется 28S рРНК большой субъединицы. Это один из примеров РНК, обладающих свойствами ферментов (рибозимов).

Удлиненная на один аминокислотный остаток дипептидил-тРНК перемещается из А-центра в Р-центр в результате транслокации рибосомы. Процесс происходит за счет энергии гидролиза ГТФ и с участием ещё одного фактора элонгации. Свободная от метионина тРНК_i^Met покидает рибосому, а в область А-центра попадает следующий кодон.

По завершении третьей стадии элонгации рибосома в Р-центре имеет дипептидил-тРНК, а в А-центр попадает триплет, кодирующий включение в полипептидную цепь новой аминокислоты. Начинается следующий цикл элонгации, в ходе которого на рибосоме снова проходят описанные выше события. Повторение этих циклов по числу смысловых кодонов мРНК завершает весь этап элонгации.

Терминация трансляции наступает в том случае, когда в А-центр рибосомы попадает один из стоп-кодонов (УАГ, УАА, УГА). Для этих кодонов нет соответствующих тРНК. Вместо них к рибосоме присоединяются 2 белковых фактора терминации (рилизинг-фактора). Один из них катализирует отщепление синтезированного пептида от тРНК, другой за счет энергии гидролиза ГТФ вызывает диссоциацию рибосомы на субъединицы.

Все освободившиеся компоненты белоксинтезирующей системы используются вновь в очередном цикле. Реакции белкового синтеза протекают по конвейерному типу, они синхронизированы, что обеспечивает максимальную скорость и эффективность процесса.

Почти всегда на одной молекуле мРНК трансляцию осуществляют несколько рибосом, образуя полирибосомы или полисомы. Каждая рибосома в полисоме способна синтезировать полную полипептидную цепь. Образование групп рибосом повыщает эффективность использования мРНК, поскольку на ней может одновременно синтезироваться несколько идентичных полипептидных цепей. Полисомы находятся или в свободном состояни, или в тесной связи с мембранами эндоплазматической сети. мРНК, кодирующие внутриклеточные белки, содержатся преимущественно в свободных полисомах, а мРНК, кодирующие секреторные белки, - в мембраносвязанных.

Посттрансляционные изменения белков

Многие белки синтезируются в неактивном виде (предшественники) и после схождения с рибосом подвергаются постсинтетическим структурным модификациям. Эти конформационные и структурные изменения полипептидных цепей получили название посттрансляционных изменений. Они включают удаление части полипептидной цепи (частичный протеолиз), ковалентное присоединение одного или нескольких низкомолекулярных лигандов, связывание между собой субъединиц олигомерного белка, приобретение белком нативной конформации (фолдинг).

При частичном протеолизе, например, неактивные предшественники секретируемых ферментов - зимогены - образуют активный фермент после расщепления по определенным участкам молекулы. Наглядным примером последовательного протеолиза служит и образование активных форм инсулина или глюкагона из препрогормонов.

В ходе ковалентных модификаций структурные белки и ферменты могут активироваться или инактивироваться в результате присоединения различных химических групп: фосфатных, ацильных, метильных, олигосахаридных и др. Многочисленным модификациям подвергаются боковые радикалы некоторых аминокислот: в тиреоглобулине йодируются остатки тирозина, в факторах свертывания крови карбоксилируются остатки глутамата, в цепях тропоколлагена гидроксилируются остатки пролина и лизина.

У некоторых белков на N-конце имеются короткие последовательности гидрофобных аминокислотных остатков, которые называют сигнальными последовательностями. Эти участки играют важную роль в транспорте белков через мембраны. В процессе переноса через мембрану сигнальная последовательность отщепляется сигнальной пептидазой. В итоге белок приобретает функциональную активность, оказавшись в соответствующей органелле или вне клетки.

Существование посттрансляционной модификации расширяет возможности клеток в регуляции метаболизма. Изменения количества или активности ферментов, участвующих в модификации белков, приводят к снижению или увеличению концентрации последних, что отражается на скорости соответствующих процессов.

Регуляция синтеза белка

Соматические клетки всех тканей и органов многоклеточного организма содержат одинаковую генетическую информацию, но отличаются друг от друга по содержанию тех или иных белков. Для эритроцитов, например, характерно высокое содержание гемоглобина, для клеток соединительной ткани - коллагена, клетки поджелудочной железы вырабатывают много ферментов. В отдельных клетках, тканях и органах содержание разных белков меняется онтогенез. Все это свидетельствует о том, что в живых организмах существуют механизмы, регулирующие белковый синтез. Они функционируют под действием внутренних и внешних факторов на каждой из стадий сложного процесса синтеза белка. Количество протеинов может изменяться в результате увеличения числа некоторых генов, регуляции на стадии транскрипции, процессинга мРНК. Скорость белкового синтеза определяется также и временем жизни мРНК, регуляцией синтеза на уровне трансляции и посттрансляционной модификации белков.

Регуляция на самых ранних этапах (на уровне экспрессии генов) является наиболее выгодной и поэтому широко встречается у эукариотических организмов. На экспрессию генов у эукариот влияет целый ряд факторов.

Организация хроматина и доступность генов: в ядрах дифференцированных клеток хроматин имеет такую укладку, что только небольшое число генов доступно для транскрипции. Различают участки гетерохроматина, в которых ДНК упакована очень компактно и для транскрипции недоступна, и участки эухроматина, имеющие более рыхлую укладку и способные связывать РНК-полимеразу. В разных типах клеток в область эухроматина попадают разные гены. Это ведет к тому, что в разных тканях транскрибируются разные участки хроматина.

Изменение количества генов: амплификация (увеличение числа) генов при необходимости увеличения синтеза определенного генного продукта; утрата генетического материала (процесс, происходящий при созревании некоторых типов клеток, например, эритроцитов).

Перестройка генов или генетичесая рекомбинация: перемещение генов между хромосомами или внутри одной хромосомы, объединение генов с образованием измененной хромосомы, которая после таких изменений способна к репликации и транскрипции.

Регуляция транскрипции (см. лекцию № 6).

Существенное значение в обеспечении разнообразия белков играет посттранскрипционный процессинг РНК. Основные способы такой регуляции - альтернативный сплайсинг и изменение стабильности РНК.

Известны и некоторые случаи регуляции количества и разнообразия белков путем изменения скорости процесса их трансляции. Наиболее изученный пример - синтез белков в ретикулоцитах. Известно, что на этом уровне дифференцировки кроветворные клетки лишены ядра, а следовательно и ДНК. Регуляция синтеза белка-глобина осуществляется только на уровне трансляции и зависит от содержания гема в клетке.

Ингибиторы матричных биосинтезов

Существует большая группа веществ, ингибирующих синтез ДНК, РНК или белков. Некоторые из них нашли применение в медицине для лечения инфекционных болезней и опухолевых заболеваний, а другие являются для человека сильнейшими токсинами. К последним можно отнести токсин бледной поганки б-аманитин, который является ингибитором эукариотических РНК-полимераз.

Действие ингибиторов матричных биосинтезов как лекарственных препаратов основано на:

· модификации матриц (ДНК или РНК);

· белоксинтезирующего аппарата (рибосом);

· инактивации ферментов.

Центральное место среди них принадлежит антибиотикам - разнообразным по химическому строению органическим соединениям, синтезируемым микроорганизмами. Краткие сведения об антибиотиках, ингибирующих матричные синтезы, приведены в таблице 7.2.

Таблица 7.2