Размещено на http://www.allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

Стороженко Володимир Олександрович

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ

Науковий керівник - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Шадчина Тамара Михайлівна, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, завідувач відділу фізіології та екології фотосинтезу

Офіційні опоненти

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Косаківська Ірина Василівна,

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, заступник директора

- кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Китаєв Олег Ігорович,

Інститут садівництва УААН, завідувач лабораторії фізіології рослин

Провідна установа - Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Вчений секретар спеціалізованої Є.Ю. Мордерер

вченої ради, д.б.н.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

антиоксидантний фермент пшениця солестійкість

Актуальність теми. Проблема стійкості культурних рослин до стресів та підвищення їхньої продуктивності є ключовою для світового аграрного комплексу. Серед стресових чинників, які призводять до значних втрат урожаїв сільськогосподарських культур, засолення ґрунту та посуха є одними з найбільш розповсюджених. Ґрунти з підвищеним вмістом солей займають на земній кулі близько 9^.10⁸ га, що становить понад 25 % площ всіх земель (Ghassemi et al., 1998). В Україні солонці та солонцюваті ґрунти займають понад 4 млн. га (Балюк та ін., 2001), і ці площі постійно збільшуються внаслідок неправильного землекористування (Окультуривание солонцевых почв, 1984). Не менш гострими є проблеми, пов'язані із глобальними змінами клімату. Однією з них є збільшення втрат врожаїв через посухи. В Україні, зокрема, загальні площі орних земель, які знаходяться в умовах непостійного та неповного зволоження, сягають 16 млн. га (близько 50 % від загальної площі орних земель) (Моргун, Григорюк, 1997). Водний дефіцит та засолення ґрунтів є взаємопов'язаними факторами, які часто діють сумісно, створюючи комбінований стрес. тому актуальним є вивчення механізмів адаптації рослин як до окремих стресових чинників, так і до їх сумісної дії, що часто має місце в реальних умовах.

Серед захисних механізмів, які існують у рослинних організмів, важливе місце належить антиоксидантній системі фотосинтетичного апарату, роль якої полягає в елімінації активних форм кисню (foyer et al., 2000). Функціонування головної ланки антиоксидантної системи за умов посухи, засолення та сумісної їх дії у рослин, що відрізняються стійкістю до цих стресів у різні фази вегетації наразі є далеким від повного розуміння.

М'яка пшениця є однією з найважливіших продовольчих культур людства, значні площі посівів якої знаходяться на засолених ґрунтах із недостатнім зволоженням. Тому дослідження дії сольового та водного стресів на фотосинтетичний апарат Triticum aestivum L. має науковий і практичний інтерес.

Розкриття механізмів стійкості рослин до засолення ґрунту та посухи дозволить розробити ефективні методи тестування стійкості рослин та способи їх захисту від негативної дії цих стресових чинників, цілеспрямовано підходити до створення нових форм рослин методами селекції, мутаційної генетики та генної інженерії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках теми відділу фізіології та екології фотосинтезу Інституту фізіології рослин і генетики НАН України 2001-2005 років “Вивчення фізіологічних механізмів та розробка способів регуляції фотосинтезу та розподілу асимілятів у донорно-акцепторній системі рослин різних генотипів за оптимальних та стресових умов” (№ держреєстрації 0101U000628).

Здобувачем підібрані перспективні об'єкти і методи досліджень; модифіковано методи визначення активності антиоксидантних ферментів у хлоропластах, вивчено вплив засолення, посухи та їх сумісної дії на фітометричні показники рослин, активність антиоксидантних ферментів у хлоропластах, а також параметри індукції флуоресценції хлорофілу та газометричні характеристики фотосинтетичного апарату на рівні цілих листків ярої пшениці. Отримані результати оброблено із застосуванням одно- та двофакторного статистичного аналізу.

Мета і завдання досліджень. Метою даної роботи є вивчення особливостей фізіологічної реакції головної ланки антиоксидантної системи хлоропластів ярої пшениці, представленої ферментами супероксиддисмутазою (СОД) та аскорбатпероксидазою (АПО) на натрійхлоридне засолення ґрунту, наростаючу ґрунтову посуху та сумісну дію цих стресових чинників у зв'язку з функціональним станом фотосинтетичного апарату в різні фази онтогенезу рослин.

Об'єкт дослідження: фотосинтетичний апарат листків ярої пшениці в різні фази онтогенезу рослин.

Предмет дослідження: ключові антиоксидантні ферменти хлоропластів у зв'язку з функціональним станом фотосинтетичного апарату.

Для досягнення поставленої мети були визначені такі завдання:

1) Дослідити в модельних дослідах вплив різних рівнів засолення поживного середовища на фітометричні показники рослин ярої пшениці та активність антиоксидантних ферментів СОД та АПО в хлоропластах.

2) Порівняти реакцію антиоксидантних ферментів на засолення у двох різних за чутливістю до сольового стресу сортів пшениці.

3) Дослідити активність антиоксидантних ферментів хлоропластів ярої пшениці в різні фази вегетації рослин.

4) Вивчити вплив посухи на активність ключових антиоксидантних ферментів хлоропластів.

5) Визначити особливості функціонування антиоксидантної системи хлоропластів за умов комбінованого стресу, спричиненого сумісною дією посухи і засолення.

6) Дослідити зв'язок між фотосинтетичною функцією та активністю ключових антиоксидантних ферментів СОД та АПО у хлоропластах.

Методи досліджень - застосовані сучасні біометричні, біохімічні, спектрофотометричні, газометричні та люмінесцентні методи. Статистична обробка результатів вимірювань здійснена з використанням методу дисперсійного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вивчено особливості реакції хлоропластної СОД ярої пшениці на сольовий стрес залежно від рівня натрійхлоридного засолення поживного середовища та від сортової чутливості до цього стресу. Вперше досліджено вплив довготривалого сольового стресу на динаміку активностей СОД та АПО впродовж онтогенезу рослин. Виявлено особливості функціонування антиоксидантної системи хлоропластів за умов комбінованого стресу, зумовленого сумісною дією посухи та засолення ґрунту. Доведено, що за дії посухи на засоленому ґрунті має місце явище крос-адаптації на рівні антиоксидантної системи хлоропластів. Показано, що активність ключових антиоксидантних ферментів хлоропластів за дії сольового та водного стресів знаходиться в тісному негативному зв'язку з процесом фотосинтезу. Отримані знання поглиблюють уявлення про механізми адаптації рослин до стресових умов довкілля.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані можуть бути використані при розробці нових тестових параметрів для оцінки соле- та посухостійкості рослин ярої пшениці різних генотипів.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно опрацював літературу по темі дисертації, оволодів необхідними методами, виконав експериментальні дослідження і зробив їх статистичну обробку, брав активну участь у плануванні експериментів. За участю наукового керівника та співавторів проаналізовано отримані результати та зроблено їх узагальнення.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на наукових конференціях і симпозіумах: на засіданнях відділу фізіології та екології фотосинтезу Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (2003 - 2004 рр), VIII молодіжній конференції ботаніків у Санкт-Петербурзі (Санкт-Петербург, Росія, 17-21 травня 2004), II Міжнародній конференції “Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі” (Львів, 18-21 серпня 2004), XIV конгресі європейських товариств фізіологів рослин (Краків, Польща, 23-27 серпня 2004), IX конференції молодих дослідників “Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин і ґрунтових мікроорганізмів” (Київ, 24-25 лютого 2005).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані у 8 працях, у тому числі 4 статтях у провідних фахових виданнях.

Структура дисертації. Дисертація складається із вступу, трьох розділів, висновків, підсумків, списку використаних джерел. Робота викладена на 129 сторінках, ілюстрована 24 таблицями і 34 рисунками. Список використаних джерел містить 135 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Модельні експерименти виконані на 11-денних проростках Triticum aestivum L. сортів Рання 93 (селекції Інституту землеробства УААН) та Колективна 3, створеного сумісно Миронівським інститутом пшениці ім. В.М. Ремесла і Інститутом рослинництва ім В.Я. Юр'єва УААН. Проростки вирощували у водній культурі на Ѕ середовища Хогланда при контрольованих температурі (20-25 ⁰С) і освітленості (4000 лк) в умовах 14-годинного фотоперіоду.

у вегетаційному експерименті вирощували рослини ярої пшениці сорту Рання 93 у посудинах Вагнера на сірому лісовому опідзоленому ґрунті при вологості ґрунту 60 % від повної вологоємкості (ПВ) із внесенням поживної суміші NPK у кількості 1 г кожного елемента на 8 кг ґрунту у контрольному та дослідному варіантах. В дослідний варіант окрім цієї суміші додавали NaCl у кількості 1,875 г/кг ґрунту. Посуху створювали шляхом припинення поливу обох варіантів у фазі колосіння. Вологість ґрунту в посудинах контролювали ваговим методом (Юдин, 1971).

Активність СОД визначали фотохімічним методом за Гіанополітісом (Giannopolitis, 1977), аскорбатпероксидази - за методом Чена (Сhen, 1989).

Інтенсивність фотосинтезу визначали оптико-акустичним інфрачервоним газоаналізатором (Гуляєв та ін., 1983), вміст фотосинтетичних пігментів визначали фотометрично за Вельбурном (Welburn, 1994). параметри індукції флуоресценції хлорофілу вимірювали згідно зі Шрайбером (Schreiber, 1986). на їх основі визначали параметри функціонального стану фотосинтетичного апарату рослин за Корнєєвим (Корнеев, 2002). Експериментальні дані оброблені статистично за допомогою електронних таблиць “Microsoft Excel” згідно з (Доспехов, 1985).

Активність антиоксидантних ферментів хлоропластів СОД і АПО та СТАН фотосинтетичного апаРату рослин ярої пшениці за дії сольового та водного стресів

Вплив натрійхлоридного засолення ґрунту на фітометричні характеристики ярої пшениці

Ростові показники ярої пшениці залежно від рівня засоленості поживного середовища та сорту вивчали на проростках, вирощених у модельних дослідах у водній культурі. Ці дослідження показали, що як швидкість проростання насіння, так і наступний ріст проростків зменшується із збільшенням концентрації хлориду натрію в поживному середовищі.

За даними фітометричних досліджень було виявлено, що сорт Рання 93 є менш солестійким, аніж сорт Колективна 3. сира та суха маса 11-денних проростків сорту Колективна 3 знижувалася менше порівняно із сортом Рання 93 при збільшенні концентрації хлориду натрію у поживному середовищі (табл. 1).

З метою визначення зв'язку між стійкістю рослин до сольового стресу і активністю антиоксидантної системи хлоропластів досліджували активність ключових антиоксидантних ферментів хлоропластів у різних за солестійкістю сортів ярої пшениці у відповідь на сольовий стрес.

Таблиця 1

Вплив натрійхлоридного засолення поживного середовища на фітометричні показники 11-денних проростків ярої пшениці сортів Рання 93 та Колективна 3

Активність антиоксидантних ферментів хлоропластів СОД та АПО за умов довготривалої дії сольового стресу

Реакція антиоксидантної системи хлоропластів проростків двох різних за чутливістю до засолення сортів ярої пшениці на сольовий стрес.

Результати досліджень активностей супероксиддисмутази та аскорбатпероксидази у хлоропластах проростків ярої пшениці сорту Рання 93, які вирощували у водній культурі з різним вмістом хлориду натрію у поживному середовищі, показали, що активність ферментів залежить від концентрації солі у поживному розчині. В діапазоні концентрацій хлориду натрію 30-90 мМ із збільшенням концентрації солі активність ферментів зменшувалася (табл. 2).

Таблиця 2

Активність СОД та АПО у хлоропластах ярої пшениці сорту Рання 93 при різній концентрації хлориду натрію в середовищі

Реакція антиоксидантних ферментів на засолення у сортів, що відрізнялися за солестійкістю, була різною. за умов однакового рівня стресового навантаження, яке становило 50мМ NaCl, у сорту Рання 93 активності обох ферментів знижувалися, тоді як у сорту Колективна 3 - суттєво підвищувалися.

Дослідження реакції хлоропластної СОД сорту Рання 93 на засолення поживного середовища у діапазоні більш низьких концентрацій солі дозволило виявити підвищення активності супероксиддисмутази також і у цього сорту (Рис. 4).

Таким чином, досліджувані сорти за реакцією антиоксидантної системи відрізнялися між собою діапазоном концентрацій хлориду натрію, в якому спостерігалося підвищення активності ферменту СОД у хлоропластах, та рівнем концентрації солі, починаючи з якої активність ферментів знижувалася. У менш солестійкого сорту Рання 93 такий критичний рівень засолення поживного середовища знаходився в діапазоні більш низьких концентрацій солі.

Активність хлоропластної СОД та АПО в різні фази онтогенезу

Літературні дані щодо реакції антиоксидантної системи на сольовий стрес частіше за все стосуються ранніх фаз вегетативного розвитку рослин у модельних експериментах на водній культурі. Відомості щодо функціонування антиоксидантної системи хлоропластів пшениці впродовж її онтогенезу в умовах засолення ґрунту практично відсутні. Зокрема це стосується періоду закладання генеративних органів у пшениці, який дуже тісно пов'язаний з її продуктивністю.

Дослідження активностей антиоксидантних ферментів хлоропластів пшениці у різні фази вегетації рослин показали, що стан антиоксидантної системи змінюється в процесі вегетації рослин. У початкові періоди онтогенезу, зокрема, у фазі кущіння, спостерігали зниження активності ферментів СОД та АПО, а починаючи з фази стеблування відбувалося повільне підвищення активності ферментів як у контрольному варіанті, так і варіанті з натрійхлоридним засоленням ґрунту.

Однак, на відміну від контролю, у дослідному варіанті активності обох ферментів на ранній стадії розвитку рослин (фазі кущіння) були нижчими. Починаючи з фази стеблування, ситуація змінювалася - активності як СОД, так і АПО в хлоропластах рослин засоленого варіанта, перевищували контроль. Крім цих досить повільних змін активності ферментів спостерігалися також зміни, спричинені коливаннями середньодобової температури за досліджуваний період (Рис. 4 та 5). Це пов'язано з більшою лабільністю антиоксидантних ферментів у хлоропластах рослин, вирощених в умовах засолення ґрунту.

Реакція антиоксидантних ферментів хлоропластів ярої пшениці на наростаючу посуху та сумісну дію засолення та посухи

В літературі дані щодо реакції антиоксидантної системи на ґрунтову посуху, подібно до сольового стресу, стосувалися, головним чином, ранніх фаз розвитку рослин (Sgherri et al., 2000). В той же час рослини у період закладання генеративних органів є дуже вразливими до посухи. нами були виконані дослідження реакції антиоксидантних ферментів хлоропластів на наростаючу ґрунтову посуху починаючи з фази колосіння. Зниження вологості ґрунту призводило до істотного підвищення активності ферментів СОД та АПО (Рис. 7 та 8), яке було більш суттєвим, аніж за дії сольового стресу. Отже, дефіцит води, як і засолення ґрунту, були стресовими чинниками, дія яких проявилася в активації антиоксидантної системи хлоропластів, причому ступінь активізації ферментів антиоксидантної системи характеризувала силу стресового навантаження.

Створення посухи на засоленому ґрунті призводило до менш суттєвого підвищення активності як СОД, так і АПО, ніж під впливом лише однієї посухи, хоча і більш значного порівняно з варіантом із засоленням (Рис. 6 та 7). Отримані результати можна розглядати як свідчення того, що в умовах водного дефіциту на засоленому ґрунті на рівні ферментативної елімінації активних форм кисню в хлоропластах ярої пшениці має місце явище так званої “крос-адаптації” (Gong et al., 2001).

Вплив засолення ґрунту та посухи на характеристики фотосинтетичного апарату

Засолення ґрунту не спричиняло суттєвих змін швидкості електронного транспорту в ФС II, визначеного за даними вимірювання індукції флуоресценції хлорофілу (Ф_рqp). Водночас, цей стресовий чинник індукував збільшення нефотохімічного гасіння люмінесценції (NPQ), що є свідченням невеликого зростання втрат поглинутої фотосинтетичним апаратом енергії у вигляді тепла на рівні світлозбиральних комплексів. Підвищення теплової дисипації енергії спостерігали і за умов водного дефіциту. При жорсткій ґрунтовій посусі (вологість ґрунту близько 30 % від ПВ), крім значного підвищення нефотохімічного гасіння люмінесценції хлорофілу, відбувалося також зниження швидкості електронного транспорту. Про це свідчить зменшення параметра Ф_рqp (Табл. 2).

Таблиця 2

Параметри флуоресценції листків ярої пшениці сорту Рання 93 в умовах сольового та водного стресів

Умовні позначення: К - контроль, З - засолення грунту, П - посуха, З+П - комбінований стрес

засолення ґрунту не спричиняло достовірних змін інтенсивності фотосинтезу на початку фази колосіння (17.06.03). однак уже всередині цієї фази даний показник мав тенденцію до зниження і в кінці фази колосіння (23.06.03) був достовірно нижчим від контролю. Як і флуоресцентні параметри, фотосинтез був чутливим до забезпечення рослин вологою. В умовах наростаючої посухи він різко знижувався. Цьому відповідало значне підвищення листкового та мезофільного опорів дифузії СО₂, що супроводжує зменшення концентрації СО₂ у міжклітинниках (табл. 3). Листковий опір був дещо вищим за сумісного впливу стресових чинників, тоді як мезофільний - в умовах посухи. при засоленні ґрунту всі вищезгадані параметри змінювалися менш суттєво. Отже, зниження інтенсивності фотосинтезу в умовах дослідженого рівня натрійхлоридного засолення не пов'язане з порушеннями електронного транспорту на рівні ФС II, а обумовлене станом продихового апарату, який впливає на листкову провідність СО₂, що разом із подібною реакцією рослин на дефіцит вологи, пояснює більш суттєве зниження фотосинтезу за сумісної дії сольового та водного стресів.

Таблиця 3

Параметри газообміну листків ярої пшениці сорту Рання 93 в умовах водного та сольового стресів