Роль кальцієвих каналів у функціонуванні нервових та нейроендокринних клітин в нормі та патології

Підсумовуючи ці дослідження можна заключити, що ми детально проаналізували локалізацію кальцинейрину в нейрональних елементах за допомогою використання конфокальної мікроскопії і імуноцитохімічних підходів для вимірювання експресії РР2В в культивованих щурячих нейронах спинних корінців дорзальних гангліїв. Ми встановили, що що імунореактивність кальцинейрину надзвичайно виражена в DRG нейронах і що він локалізований переважно біля внутрішньої поверхні плазматичної мембрани. Імунопокрашення цих клітин антитілами anti- субодиниці потенціал-керованих Ca²⁺ каналів показало, що розподілення -субодиниці Ca²⁺ каналу і кальцинейрину дуже подібні. Отримані нами дані підтримують припущення, що функція кальцинейрину може бути безпосередньо пов'язана з активністю потенціалокерованих Ca²⁺ каналів.

Активність Ca²⁺ каналів в клітинах що оверекспресують РР2В

Ріст цитоплазматичної концентрації Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i ) являється одним із факторів, що запускає та сприяє процесу спаду (run-down) високо-порогових Ca²⁺ струмів, який спостерігається в петч-клемп дослідженнях. Проте, мало відомо про точний механізм дії Ca²⁺ на цей процес. Електрофізіологічні дослідження вже повідомляли, що один з шляхів, яким потенціалокеровані Ca²⁺ канали пригнічуються (down-регулюються) може відбуватися шляхом дефосфорилювання Ca²⁺ каналів. Декілька протеїн фосфатаз можуть бути задіяні в цей процес. Так, участь Ca²⁺/кальмодулін залежної фосфатази-2B (Chad & Eckert, 1986; Armstrong, 1989b; Kostyuk & Lukyanetz, 1993) та протеїн фосфатази типу 1 і 2A в down-регуляції Ca²⁺ були показані. Серед серін-треонінових фосфатаз, тільки PP2B є Ca²⁺-активованим ферментом і таким чином, може виключно відповідати за Ca²⁺-залежний компонент канального дефосфорилювання. Як було показано вище, після диференціації, NG108-15 клітини проявляють електрофізіологічні властивості дуже подібні до таких у симпатичних нейронів. Головна перевага цієї клітинної лініі - це ії здатність до гетерогенної експресії чужеродного генетичного матеріалу. Тому ми використовували NG108-15 клітини для оверекспресії в них PP2B і тестували результати змін в активності різних типів Ca²⁺ каналів представлених у цих клітинах.

Підсумовуючи результати цих досліджень можна зазначити, що в наших експериментах експресія PP2B в NG108-15 клітинах була змінена трансфекцією за допомогою конструкції плазмід, які містили повну довжину cDNA людської PP2B3 в сенс (CN15) та антисенс (CN21) оріентаціях. Конфокальна іммуноцітохімічна локалізація анти-РР2В показала, що в нативному типі клітин, PP2B іммунореактивність однорідно розподілена в не диференційованих клітинах і розміщується на внутрішній поверхні мембрани і нейрітах в диференційованих клітинах. Щоб тестувати Ca²⁺-залежність Ca²⁺ каналів, ми використовували високо-частотну стимуляцію (HFS) клітин, і встановили, що амплітуда L-типу і N-типу Ca²⁺ струмів зменшувалась на 37% і 52% відповідно, тоді як T-тип був тільки незначно чутливий до цієї процедури. FK-506 (2M), специфічний блокатор PP2B, зменшував пригнічення L- і N- типів Ca²⁺ каналів індуковане HFS на 30% і 33% відповідно. В трансфектних CN-15 клітинах оверекспрепресуючих PP2B, сумарні високопорогові (HVA) Ca²⁺ струми були пригнічені близько на 60% при тестовому потенціалі +20mV. Внутрішньоклітинне додавання EGTA або FK-506 в CN-15 трансфековані клітини індукувало 5 разове збільшення амплітуди HVA Ca²⁺ струмів. Отримані дані показали, що активність PP2B не впливає на експресію HVA Ca²⁺ каналів, але модулює їх функцію Ca²⁺-залежним дефосфорилюванням і що головною мішенню РР2В є Ca²⁺ канали N-типу. Наші результати також засвідчують, що HVA Ca²⁺ канали знаходяться в фосфорильованому стані в контрольних умовах і що РР2В залучена в негатитвну регуляцію Ca²⁺ каналів.

Участь Ca²⁺ каналів в регуляції Ca²⁺-залежного екзоцитозу

Морфологічні особливості секреторних везикул хромафінних клітин

Не дивлячись на численні дослідження, присв'ячені процесу екзоцитозу або секреції катехоламінів із надниркових хромафінних клітин, в яких використовувалися різні експериментальні підходи (Gillis, 1995) існує дуже небагато детальних морфологічних аналізів їх секреторних гранул і везикул. Проте, очевидно, що походження і поведінка різних типів секреторних органел досить складні і залучають численні біохімічні процеси для синтезу різних субстанцій, що вивільняються із хромафінних клітин. Дослідження показали, що ці нейроендокринні клітини вивільняють моноаміни і ацетілхолін (ACh) із різних секреторних везикул, припускаючи, що транспортні протеїну, відповідальні за упаковку цих нейромедіаторів, розподілені серед різних везикулярних компартментів. Дійсно, не кажучи про головні секреторні везикули - великі щільні везикули (LDCVs) та синаптично-подібні мікровезикули (SLMV) які були знайдені в перероджених пухлинних хромафінних клітинах (PC12 клітини) та в SIF клітинах (клітини малої інтенсивності флуоресцентні). Різні синтезовані матеріали розподіляються між цими двома видами везикул різними способами. Так, катехоламіни, нуклеотиди, ліпіди і пептіди знаходяться в LDCVs тоді як ацетилхолін (ACh) присутній в SLMV. Більше того, спеціалізовані везикулярні системи, для синтезу катехоламінів і ACh і їх трансортування присутні в різних везикулах. Тому, метою цього розділу було дослідити за допомогою електронної мікроскопії морфологічні особливості секреторних везикул в хромафінних клітинах бика та їх поведінку під час екзоцитозу індукованого деполяризацією.

Дані, представлені в цьому розділі пов”язані з вивченням типів секреторних везикул за допомогою електронної мікроскопії.

Підсумовуючи описані дані в цьому розділі можна сказати, що морфометричний аналіз виявив п'ять видів електроннощільних секреторних везикул в хромафінних клітинах. Ними виявилися: елементарні великі катехоламін-вміщуючі хромафінні гранули округлої форми (LDCG), великі щільні везикули овальної і палочковидної форм (LDCVo і LDCVr), малі щільні везикули (SDCV) і рибосомо-вкриті везикули (RCV) проміжної густини. Серед електронно-світлих везикул виявилися малі синаптично-подібні мікровезикули (SLMV), клатрин-вкриті ендоцитотичні везикули (ECCV), везикули конуса росту (GCV) і великі світлі спорожнені везикули (LLCV). Деполяризація мембрани та збільшення внутрішньоклітинного Ca²⁺ викликали переміщення везикул SLMV, SDCV та LDCVo до мембрани для участі у екзоцитозі. Мікровезикули (SLMV) короткочасно зливалися з мембраною (kiss-and-run механізм) під час індукованого екзоцитозу, тоді як електронно-щільні везикули SDCV та LDCVo малого розміру зливалися із мембраною формуючи омега-подібні вп'ячування. У розділі описана структура і функціональна основа різних типів секреторних везикул концентруючись на їх формуванні і потенційній ролі.

Секреторні відповіді вимірювані амперометричним методом

Наступна серія експериментів була присвячена дослідженню динаміки процесу вивільнення від окремої хромафінної клітини. Для цього застосовувалось два способи ініціації процесу екзоцитозу: активація AСh рецепторів за допомогою аплікації їх агоніста ацетилхоліну (ACh) в концентрації 1 mM та деполяризація клітини розчином, що містив підвищену концентрацію КС1 (50 mM). В останньому випадку відбувалася активація Ca²⁺ потенціалозалежних каналів.

Представлені в роботі амперометричні експерименти показали, що активація Ca²⁺ каналів шляхом деполяризації мембрани дійсно спричиняє вивільнення катехоламінів. Порівняння секреторних відповідей викликаних деполяризацією та активацією ACh рецепторів показало, що у випадку короткочасової та довготривалої стимуляції, середня частота появи квантових процесів вивільнення катехоламінів при стимуляції ACh є достовірно вища, ніж у випадку деполяризації клітини підвищеною концентрацією КСl. Порівнюючи загальний рівень процесу секреції ми зробили висновок, що обидва типи стимуляції можуть відігравати суттєву роль в ініціації процесу вивільнення катехоламінів хромафінними клітинами. Причому, у випадку тривалої стимуляції - умови, що може досягатись при різного роду важких патофізіологічних порушеннях, активація ацетилхолінових рецепторів буде відігравати більш суттєву роль в підтриманні відносно постійного рівня екзоцитозу від хромафінних клітин ніж деполяризація мембрани.

Участь Сa²⁺ каналів в регуляції Сa²⁺-залежного екзоцитозу

Деталі, що відносяться до механізмів Ca²⁺-залежного ексоцитозу зараз вивчаються із збільшенним інтересом. Одним з важливих питань - є значення того факту, що окремі підтипи Ca²⁺ каналів існують в багатьох секреторних клітинах. Давно вже відомо, що збільшення внутрішньоклітинноі концентрації ([Ca²⁺]_i ) біля плазматичної мембрани завдяки входу Ca²⁺ через Ca²⁺ канали мембрани є головним механізмом, що індукує екзоцитоз ((Katz, 1969; Burgoyne, 1995; Neher, 1998) для огляду). Проте існують значні, варіації в думках, щодо того, які типи Ca²⁺ каналів експресуються в секреторних клітинах, і в якій мірі вони беруть участь у індукції секреції. Також залишається не ясним, чи залучення даного типу Ca²⁺ каналу в секрецію залежить від специфічного характеру стимулювання, яке використовується.

Як уже вказувалося, внаслідок багатьох схожих властивостей і загального походження з нейронами, хромаффінні клітини дуже інтенсивно використовуються для дослідження фундаментальних механізмів Ca²⁺-залежного екзоцитозу. Хромафінні клітини секретують катехоламіни і супроводжуючі субстанції (VIP, субстанція P, опіоіди) у відповідь на активність вісцеральних (спланхнічних) нервових закінчень. Декілька типів високо-порогових Ca²⁺ каналів (N-, L- Q- та P-типи) були ідентифіковані в хромаффінних клітинах за допомогою селективних блокаторів Ca²⁺ каналів (Albillos et al., 1994; Kitamura et al., 1997), проте значення індивідуального внеску всіх ідентифікованих субтипів каналів в вивільненні катехоламінів залишається суперечливим. Завдяки існуванню такої відмінної інформації щодо ролі субтипів Ca²⁺ каналів в секреції, ми зробили зусилля, щоб оцінити залучення різних типів Ca²⁺ каналів у Ca²⁺-залежний екзоцитоз у хромофінних клітин бика в добре контрольованих умовах.

Підсумовуючи отримані дані можна констатувати, що бичачі хромафінні клітини експресують декілька типів Ca²⁺ каналів, які завдяки втоку через них Ca²⁺, запускають екзоцитоз катехоламінів. Використовуючи петч-клемп whole cell вимірювання на ізольованих клітинах культури, в поєднанні з Fura-2 мікрофлуориметрією і фармакологічним маніпулюванням, для того, щоб визначити залежність секреції від різних типів Ca²⁺ каналів. Ми встановили, що екзоцитоз лінійно залежить величини амплітуди Ca²⁺ струму, а кількість секреції переважно визначається двома параметрами: Ca²⁺ зарядом, оціненим як інтеграл Ca²⁺ струму протягом стимулу і базальним рівнем [Ca²⁺]_i,^,який передує даному стимулу. Ми не спостерігали переважаючу роль будь-якого із Ca²⁺ канальних субтипів, крім того, підвищений базальний рівень [Ca²⁺]_i збільшував секреторну відповідь на Ca²⁺ струм, що протікав по будь-якому типу Ca²⁺ каналу. Таким чином, фармакологічне виключення різних типів Ca²⁺ каналів від участі в секреції не виявило їх специфічні ролі в секреції в наших експериментах, в яких використовувалися відносно довгі імпульси деполяризації (50 200 msec). Ми зробили висновок, що для стимулів довгої тривалості, які вивільняють велику частину готового до вивільнення везикул не так важливо через який тип Ca²⁺ каналів Ca²⁺ входить в клітину. Вивільнення визначається загальною кількістю входячого Ca²⁺ і станом наповнення динамічного пулу, який залежить від базального [Ca²⁺]_i передуючому стимулу. Цей результат не виключає, що інші види стимулювання клітини можуть привести до відповідей, в яких специфічність типу Ca²⁺ каналів має значення.

Двоступенева модель Ca²⁺-залежності секреції у хромафінних клітинах

Екзоцитоз є одним з головних клітинних процесів, які надають можливість клітині впливати на її оточення. Цей механізм лежить в основі міжклітинної комунікації в нервовій системі через виділення нейромедіаторів в синапсах і тому є основою для інтеграційної функції мозку. Добре відомо про залучення багаточисельних внутрішньоклітинних молекул в секреторний шлях. Проте, головний внутрішньоклітинний стимул для протікання екзоцитозу в збудливих клітинах є підвищення концентрації внутрішньоклітинного Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i ). Було показано, що Ca²⁺-залежність секреції має двоступінчастий характер, який може бути пояснений окремими моделями, такими як модель “пулів” в хромафінних клітинах (Neher & Zucker, 1993; Heinemann et al., 1993) або модель секреції “підготовчої стадії” в нервових терміналях (Seward et al., 1995). Недавно було запропоновано участь протеінкінази С в біфазному феномені (Smith et al., 1998). Модель “пулів” передбачає існування трьох везикулярних пулів і везикулярну “міграцію” від великого резервного до готового до вивільнення пулу, а потім до секреторних пулів. Було припущено існування великого резервного і готового до вивільнення пулів визначає двоступеневу секрецію із кубічною Ca²⁺-залежністю кінцевої секреторної відповіді. Модель “підготовчої стадії” описує два ступені - одна з них фаза, яка є “підготовчою стадією” для секреції і секреторна порогова фаза безпосередньо. “Підготовча стадія” служить Ca²⁺-залежною “ініціюючою ступінню секреції. “PKC модель” пояснює дві фази секреції PKC-залежними і незалежними процесами залежність від [Ca²⁺]_i. В цьому розділі ми пропонуємо “везикулярний” механізм, який описує експериментальні дані, і показує значення цього феномену у функції секреторних клітин.

Підсумовуючи отримані дані можна заключити, що викликаний деполяризацією екзоцитоз проходить через дві ступені, обидві з яких лінійно залежать від [Ca²⁺]_i. При [Ca²⁺]_i, що лежить нижче критичної точки (200 300 nM) нахил взаємовідношення (Cm(Ca_i)) складав 4.43 і при [Ca²⁺]_i, що перевищує критичну точку нахил був рівний 31.63. Ми запропонували везикулярний механізм, що описує експериментальну двоступеневу залежність екзоцитозу від внутрішньоклітинного Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). Згідно моделі при рівнях [Ca²⁺]_i нижчим критичної точки, тільки везикули малого розміру зливалися з плазматичною мембраною, тоді як при вищому [Ca²⁺]_i, везикули більшого розміру починають зливатися з мембраною. Цей процес може забезпечити дуже важливий фізіологічний процес - запуск та вивільнення різних нейротрансміторів, які можуть бути диференційовано розподілені серед різних секреторних везикул. Наприклад, класичні нейротрансмітери, розташовані в синаптично-подібних мікровезикулах а пептидні, медіатори можуть бути локалізовані у великих везикулах з щільним вмістом.

Участь кальцієвих каналів в патологічних станах

Зміни Ca²⁺ гомеостазу при гіпоксії

Зниження парціального рівня кисню в позаклітинному середовищі (гіпоксія) є одним з основних ушкоджувальних чинників при мозковій патології, пов'язаній з порушенням мозкового кровооббігу (ішемією). Таке зниження супроводиться комплексом системних процесів, одним з найістотніших з яких являється масоване вивільненняя збудливого синаптичного медіатору (глутамату) і відповідно викликана їм глибока деполяризація нервових клітин, що приводить до практичного виключення їх активності (“эксцитотоксичность”). Механізмам цієї системної реакції присвячена значна кількість експериментальних досліджень. Найістотнішим компонентом її є масований вхід іонів Ca²⁺ в нейрони через активовані лиганд-керовані канали. Разом з тим, природа безпосередньої дії гіпоксії на нейрон представляється значно менш вивченою, хоча її з'ясування має першорядне значення для розуміння основ ушкоджувальної дії гіпоксії. Мабуть, в самому нейроні є механізми, безпосередньо реагуючі на зниження парціального рівня кисню біля його поверхні, які можна було б позначити як первинні сенсори гіпоксії; їх включення приводить до більш глибоких системних порушень функції клітини і можливо до її загибелі.

Тому нами був проведений докладний розгляд тих первинних змін, які безпосередньо виникають в нейроні при зміні нормоксичного зовнішнього середовища на гіпоксичне (1040 mmHg); для виключення можливих міжклітинних взаємодій дослідження проводилися на ізольованих сенсорних нейронах (DRG нейрони) із заднєкорінцевих гангліїв щурів. Оскільки порушення кальцієвого гомеостазу є найвірогіднішим компонентом таких змін, було використано пряме визначення змін рівня вільних іонів Ca²⁺ в нейроні за допомогою введення в нього флуоресцентного кальцієвого індикатора Фура-2АМ; рівень pO₂ біля зовнішньої поверхні клітини безперервно вимірювався полярографично за допомогою платинового мікроелектроду.

Підсумовуючи отримані результати можна констатувати, що гіпоксія викликала істотне підвищення внутріклітинного рівня Ca²⁺ вже через декілька секунд після початку її дії. Викликаний гіпоксією ефект майже повністю усувався блокуванням потенціал-керованих кальцієвих каналів L-типу або усуненням іонів Ca²⁺ з позаклітинного середовища. Отримані дані дозволяють припустити, що початковими сенсорами гіпоксичної дії на досліджені нейрони є потенціалокеровані кальцієві іонні канали плазматичної мембрани, зміни активності яких вторинно викликають порушення функції іонообмінних механізмів плазматичної мембрани. Ці зміни можна розглядати як сигнальні процеси, за якими при тривалій дії гіпоксії слідують більш глибокі зміни клітинних функцій, пов'язані з порушенням енергетичного балансу клітини.

Ефект гіпоксії на Ca²⁺ канали залежить від внутрішньоклітинного Ca²⁺

Одна з проблем яка має важливе значення, в цьому контексті є природа гіпоксичних сенсорів в нейронах. Молекулярні принципи таких “сенсорів” залишається в значній мірі невідомою. Вірогідно, що плазматично - іонні канали мембрани можуть відігравати певну роль в O₂-регульованих процесах (Mironov & Richter, 2000). Існує думка, що індуковані гіпоксією ефекти в нейронах можуть бути опосередковані переважно відкриттям ATP-регульованих K⁺ каналів (K_ATP), як результат зменшення внутрішньоклітинного ATP, обумовленого зниженням pO₂ (Dart & Standen, 1995). Як результат, може виникати мембранна деполяризація і вхід кальцію в клітину під час гіпоксії (Haddad & Liu, 2000). Проте, здається малоймовірним, що тільки ці процеси є механізмами, які лежать в основі гіпоксичних ефектів, тому що чутливість до гіпоксії в більшості тканин відбувається в діапазоні що перевищує фізіологічний рівень pO₂ без змін енергетичного метаболізму. Таким чином, можна припустити, що інші мембранні механізми можуть бути гіпоксіє-чутливим у збудливих клітинах (Haddad & Jiang, 1997).

В наших дослідженнях, ми показали, що високопорогові Ca²⁺ канали в гіпокампальних нейронах позбавлені чутливості до помірної та глибокої гіпоксії, в умовах коли внутрішньоклітинний розчин містив 10mM EGTA, що абсорбує вільний Ca²⁺ і, таким чином, запобігає взаємодії цитоплазматичного Ca²⁺ з молекулою каналу. Тому, в представленій главі ми шукали відповідь на питання як Ca²⁺ канал відповідає на вплив гіпоксії при наявності зворотного зв'язку з вільним Ca²⁺ в цитоплазмі у свіжоізольованих гіпокампальних нейронах СА1.

Підсумовуючи описані в розділі результати можна заключити, що зниження pO₂ індукувало потенціацію HVA Ca²⁺ канальної активності на ~25.7 % при [Ca²⁺]_i =75 nM в порівнянні з безкальцієвим розчином. Збільшення [Ca²⁺]_i до 410 nM злегка збільшувало ефект і значно уповільнювало спад (run-down) Ca²⁺ струму. З другого боку, гіпоксія збільшувала стаціонарну інактивацію і прискорювала кінетику спаду Ca²⁺ струму приблизно на 30%. Ми встановили, що залежність величини гіпоксичного ефекту від pO₂ не лінійна і гіпоксичний ефект суттєво збільшується про pO₂ що лижать нижче значень 40 мм Рт.ст. Ми прийшли до висновку, що помірна гіпоксія спричиняє подвійну дію на Ca²⁺ канали - на внутрішньоклітинно опосередкований приріст кальцієвого входу через Ca²⁺ канали і їх Ca²⁺-залежну інактивацію.

Ефект гіпоксії на Ca²⁺ канали залежить від зовнішньоклітинного Ca²⁺

Таким чином, ми встановили, що гіпоксія індукує збільшення активності HVA Ca²⁺ каналів, і цей ефект істотно залежить від концентрації внутрішньоклітинного Ca²⁺. В експериментах, описаних в цьому розділі, ми тестували роль концентрації зовнішньоклітинного Ca²⁺ ([Ca²⁺]_e ) у відповідях CA1 нейронів гіпокампу на гіпоксичний вплив. Підсумовуючи дані отримані в цьому розділі щоб з'ясувати, чи гіпоксична чутливість обмежується специфічністю до іонів Ca²⁺ ми використали петч-клемп вимірювання в конфігурації whole-cell на ізольованих нейронах CA1 гіпокампу щурів. Також використовувався полярографічний метод для парціального вимірюваня тиску O_2.. Ми встановили, що в 2mM [Ca²⁺]_e гіпоксичний ефект в 2mM розчині складав ~94%, тоді як підвищення [Ca²⁺]_e до 5 mM і 15 mM привело до поступового зменшення ефекту. Ми встановили, що повний заряд Ca²⁺, що переноситься в клітину під час гіпоксії, був подібний для всіх тестуємих [Ca²⁺]_e, тоді як заряд Ca²⁺, що переносився при нормоксії, відрізнявся для різних [Ca²⁺]_e, будучи більшим при вищому [Ca²⁺]_e. Ці дані вказали на насичення гіпоксичного ефекту внаслідок обмеженню провідності каналу. Таким чином, ми припустили, що гіпоксичний ефект міг бути пов”язаний із зростанням провідності каналу, причому рівень провідності каналу при нормоксії може визначити амплітуду гіпоксичного ефекту.

Дія гіпоксії на різні типи Ca²⁺ каналів

В наших попередніх дослідженнях, ми показали, що HVA Ca²⁺ струми CA1 гіпокампальних нейронах були чутливі до гіпоксії в певних експериментальних умовах (Shkryl et al., 2001c). Ми знайшли, що ступінь чутливості Ca²⁺ каналів до гіпоксії залежить від концентрації Ca²⁺ в середині клітини та зовні клітини. Проте, в тих експериментах ми тестували чутливість загального HVA Ca²⁺ струму до гіпоксії без розділення струму на його специфічні компоненти. В цьому розділі ми дослідили, як підтипи Ca²⁺ каналів із ізольованих гіпокампальних CA1 нейронів відповідають на гіпоксичні впливи.

Підсумовуючи результати розділу можна заключити, що використовуючи методи фіксації мембранного потенціалу в конфігурації whole-cell та полярографічний метод для вимірювання парціального тиску кисню (pO₂) ми встановили, що зменшення pO₂ до 1530 mmHg індукувало потенціацію HVA Ca²⁺ струму на 94%. Використання селективних блокаторів N- і L-типів Ca²⁺ каналів, показало, що блокування Ca²⁺ каналів L-типу зменшувало гіпоксичний ефект на 54%, тоді як блокатор N-типу зменшував ефект на 30%. Враховуючи співвідношення струмів, що створюються підтипами Ca²⁺ каналів в CA1 гіпокампальних нейронах, ми заключили, що обидва типи HVA Ca²⁺ каналів чутливі до гіпоксії, проте L-тип був в 3.5 разів більш чутливим до зниження рівню кисню.

Участь CA²⁺ каналів в розвитку епілепсії

Леветірацетам (LEV) є новим антиепілептичним препаратом (AED) з унікальним фармакологічним профілем, яке спричиняє потужне пригнічення нападів, викликаних в кідлінг моделях епілепсії (Loscher et al., 1998; Klitgaard et al., 1998). Ця сполука суттєво пригнічує нейрональну гіперсинхронність в гіпокампі, індуковану додаванням розчину, що містить високий рівень калію та низький рівень кальцію, без будь-яких суттєвих ефектів на нормальні електрофізіологічні відповіді нейронів (Margineanu & Klitgaard, 2000). Таким чином, представлялось дуже важливим, оцінити можливі клітинні механізми антиепілептичної дії сполуки LEV, які можуть бути пов'язані з його специфічною взаємодією з молекулярними структурами, відповідальними за генерацію електричної активності нейронів мозку.

Попередні дослідження не показали будь-яку модуляторну активність леветірацетаму на потенціал-залежні Na⁺ та низькопорогові Ca²⁺ струми у щурячих неокортикальних нейронах (Niespodziany et al., 2000a; Zona et al., 2001). Тому, в даних дослідженнях особлива увага була приділена високопороговим Ca²⁺ струмам, які також можуть відповідати за зміни характерів генерації потенціалів дії у відповідних нейронах. Особливий інтерес викликало можливість, оцінити здатність LEV специфічно взаємодіяти з різними підтипами цих каналів, експресованих в різних типах нервових клітин. В представлених у цьому розділі експериментах, ми проаналізували результат дії LEV на HVA Ca²⁺ в ізольованих нейронах CA1 зони гіпокампа щура, розділених на головні підтипи каналів (L, N, P, Q і R) шляхом застосування стандартних селективних канальних блокаторів.

Підсумовуючи результати можна констатувати, що ефект нового антиепілептичного препарату левотерацитаму (LEV) на різні типи високопорогових Ca²⁺ каналів (HVA) був досліджений на ізольованих нейронах гіпокампу щурів. Блокатори Ca²⁺ каналу використовувалися для виділення підтипів Ca²⁺ каналів. Струми були заміряні в контролі і після аплікації 1-200 М LEV. Ми встановили, що LEV не зворотно пригнічував HVA кальцієвий струм в середньому на 18%. Визначена концентрація половинного пригнічення Ca²⁺ струму (IC₅₀) блокатором становила 14.7 М, що відповідає концентраціям при клінічних застосуваннях. Використовуючи преімпульсний протокол стимулювання, ми показали, що G-білки не були залучені в шляхи що лежать в основі ефекту LEV, припускаючи, що ефект полягає в прямій дії LEV на молекулу каналу. Механізм блокування LEV не був пов'язаний з стаціонарною активацією або інактивацією Ca²⁺ каналів. LEV не впливав на спад HVA Ca²⁺ протягом експериментальних протоколів, що продовжувалися близько 10 min. Нарешті, LEV при найвищій концентрації, що використовувалися (200 M) не впливав на активність Ca²⁺ каналів L-, P- або Q-типу в СА1 нейронах щурів гіпокампа, тоді як він селективно впливав на активність Ca²⁺ каналів N-типу із гіпокампу. Максимальний ефект на ці канали, фармакологічно відокремлені від інших, був близько 37%. Отримані результати підтверджують факт, що LEV селективно пригнічує N-тип Ca²⁺ каналів СА1 пірамідальних нейронів гіпокампу. Ці дані також дозволяють припустити існування підтипу N-типу кальцієвих каналів, чутливих до LEV, які можуть бути залучені в молекулярну основу його антиепілептичноі дії.

Висновки

У дисертаційній роботі наведені дослідження потенціалокерованих Ca²⁺ каналів, пов?'язані з регуляцією, функцією та роллю в патологічних станах нервової системи, які вивчалися за допомогою ряду електрофізіологічних, мікрофлуоресцентних, імуноцитохімічних, молекулярнобіологічних та інших методів.

За допомогою реєстрації активності поодиноких Ca²⁺ каналів встановлено, що РК-А-залежне фосфорилування Ca²⁺ каналів, котре викликає збільшення Ca²⁺ макроструму, змінює кінетику поодиноких каналів, збільшує число активних каналів і вірогідність їх знаходження у відкритому стані. В той же час фосфорилування не впливає на провідність поодинокого каналу.

За допомогою імуноцитохімічних досліджень, встановлено, що Ca²⁺-залежна фосфатаза кальцинейрин у великій кількості експресується в DRG нейронах, де він локалізований переважно біля внутрішньої поверхні плазматичної мембрани і його локалізація співпадає з локалізацією -субодиниці Ca²⁺ каналів. Це може свідчити про те, що функція кальцинейрину мабуть безпосередньо пов'язана з активністю потенціалокерованих Ca²⁺ каналів.

Досліджено взаємодію між кальцинейрином (PP2B) і Ca²⁺ каналами в NG108-15 клітинах, які оверекспресують PP2B, і встановили, що в таких клітинах сумарні високопорогові Ca²⁺ струми пригнічуються майже на 60% по відношенню до контролю. Внутрішньоклітинне додавання блокаторів кальцинейрину індукувало 5-ти разове збільшення амплітуди цих Ca²⁺ каналів, що свідчить, що активність PP2B не впливає на експресію каналів, але модулює їх функцію Ca²⁺-залежним дефосфорилуванням каналів, котрі знаходяться в фосфорильованому стані, і що РР2В, головним чином, впливає на активність N-типу Ca²⁺ каналів в NG108-15 клітинах.

Досліджено роль різних типів Ca²⁺ каналів у секреції (екзоцитозі) катехоламінів в хромафінних клітинах і встановлено, що секреція, виміряна змінами ємності мембрани, переважно визначається загальним кумулятивним зарядом Ca²⁺ струму і базальним рівнем [Ca²⁺]_i, котрий передує стимулу і не залежить від типу Ca²⁺ каналів.

Встановдено, що викликаний деполяризацією екзоцитоз проходить через два ступені, обидва з яких лінійно залежать від [Ca²⁺]_i і від порогової “критичної” концентрації Ca²⁺ (200 300 nM). Запропоновано везикулярний механізм, що описує двоступеневу залежність екзоцитозу від внутрішньоклітинного Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). Згідно моделі, при рівні [Ca²⁺]_i, нижчому порогової точки, везикули малого розміру зливаються з плазматичною мембраною, тоді як при вищому, починають зливатися з мембраною і везикули більшого розміру.

Зроблено морфологічний аналіз та досліджено склад везикул в хромафінних клітинах. Встановлено, що в цих клітинах існує велика кількість везикул, які відрізняються за своєю морфологією та функцією. Показано, що при деполяризації хромафінних клітин деполяризацією, підвищенням внутрішнього Ca²⁺ або агоністом ацетилхолінових рецепторів у секреції приймають участь два типи везикул, малі або середні електронно-щільні та синаптично-подібні світлі, які залучені у процес екзоцитозу різними механізмами - темні везикули шляхом повного злиття з мембраною, тоді як світлі - через формування ніжки та тимчасового злиття.

За допомогою флуоресцентного методу з використанням зонду Fura-2 показано, що зменшення парціального тиску кисню до 25ч35 мм рт.ст. у зовнішньоклітинному середовищі ізольованих сенсорних нейронів щурів спричиняє збільшення внутрішньоклітинної концентрації вільних іонів кальцію на 120 % і основним шляхом цього збільшення є потенціалокеровані кальцієві канали L-типу в DRG нейронах.

Досліджено роль Ca²⁺ каналів в перебігу гіпоксичного ефекту в нейронах гіпокампу. Встановлено, що помірна гіпоксія (20-30 mm Hg) спричиняє подвійну дію на Ca²⁺ канали - з одного боку, вона викликає внутрішньоклітинно опосередкований приріст кальцієвого входу через Ca²⁺ канали, і з другого боку - їх Ca²⁺ -залежну інактивацію.

Встановлено, що зниження pO₂ до 1530 mm Hg індукує потенціацію HVA Ca²⁺ струму на 94% в нейронах гіпокампу. Використання селективних блокаторів Ca²⁺ каналів показало, що блокування каналів L-типу зменшує гіпоксичний ефект на 54%, тоді як блокатор N-типу на 30%. Враховуючи співвідношення струмів, що створюються підтипами Ca²⁺ каналів в цих клітинах, знайдено, що обидва типи HVA Ca²⁺ каналів чутливі до гіпоксії, проте L-тип майже в 3.5 разів більш чутливий до зниження рівню кисню.

Вперше встановлено, що антиепілептична сполука леветірацетам селективно блокує N-тип Ca²⁺ каналів в нейронах гіпокампу, що може лежати в основі її анти-епілептичної дії.

Зроблено висновок щодо ролі і принципів регуляції активності Ca²⁺ каналів, як однієї з основних функцій нейронів і ендокринних клітин, а також основних причин патологічних станів мозку (ішемії/гіпоксії та епілепсії), а також особливостей фармакологічного впливу на такого роду зміни, що складає основу для вивчення можливостей корекції ряду клінічних захворювань.

Перелік опублікованих праць за темою дисертації

1. Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A. Intracellular mechanisms of calcium channel modulation by serotonin in identified Helix Pomatia neurones // Netherlands Journal of Zoology, 1994, 44, 513-523.

2. Lukyanetz E.A., Kostyuk P.G. Two distinct receptors operate the cAMP cascade to up-regulate L-type Ca channels // Pflьgers Arch. 1996, 432, P. 174-181.

3. Lukyanetz E.A., Sotkis A.V. Serotonin-induced changes in the activity of single Ca²⁺ channels in Helix pomatia neurones. Neurophysiology (Kiev), 1996, 28, N2/3, 132-140.

4. Lukyanetz E.A., Sotkis A.V. Characterization of single K⁺ channels in Helix pomatia neurones. Neurophysiology (Kiev), 1996, 28, N6, 250-259.

5. Lukyanetz E.A. Evidence for colocalization of calcineurin and calcium channels in dorsal root ganglion neurones. 1997, Neuroscience, 78, N3, 625-628.

6. Lukyanetz E.A. Development of view about the voltage-operated calcium channels of membrane. 1997, Neurophysiology (Kiev), 29, N1, p. 56-69.

7. Lukyanetz E.A., Sotkis A.V. The investigation of modulating mechanism of calcium and potassium channels by serotonine in Helix pomatia neurons., 1997, Fiziologicheskii zhurnal, (Kiev) 44, N5/6, p. 100-107.

8. Yavorsky V.A., Lukyanetz E.A. Pilocarpine-induced epileptoform activity of isolated CA1 hippocampal neurones. 1997, Neurophysiology (Kiev), 29, N3, p. 205-2.

9. Lukyanetz E.A. Role of calcineurin in regulation of high voltage-activated calcium channel activity. 1997, Neurophysiology (Kiev), 29, No 6, 442-447.

10. Lukyanetz E.A. Calcium channel activity in NG108-15 cells overexpressing protein phosphatase-2B. 1997, Neurophysiology (Kiev), 29, No 4/5, 330-333.

11. Sotkis A.V., Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A. Diversity of single potassium channels in isolated snail neurones. 1998, NeuroReport, 9, N 7 p. 1413-1417.

12. Lukyanetz E.A. Diversity and properties of Ca channel types in NG108-15 cells. 1998, Neuroscience, Vol. 87, Issue 1, pp. 265-274.

13. Lukyanetz E.A., Piper T., Sihra T.S. Calcineurin involvement in the regulation of high-threshold Ca²⁺ channels in NG108-15 (rodent neuroblastoma x glioma hybrid) cells. 1998, J.Physiology, 510 (2), pp. 371-385.

14. Shkryl V.M., Lukyanetz E.A. Properties of oxygen-sensitive electrods using in patch-clamp experiments on nerve cells. Neurophysiology, 1998, 30, 4/5, 279-283.

15. Pochynyuk O.M., Zaika O.L., Lukyanetz E.A. Determination of the released neurotransmitter type by using carbon fiber amperometry. Neurophysiology, 1998, 30, 4/5, 284-287.

16. Konovalov A.A., Lukyanetz E.A. Activity of sodium voltage-operated currents of cortical neurones during hypoxia. Neurophysiology, 1998, 30, 4/5, 312-315.

17. Lukyanetz E.A., Neher E. Different types of calcium channels and secretion from bovine chromaffin cells. 1999. Eur.J.Neurosci., 11 (8) 2865-2873.

18. Shkryl V.M, Nikolaenko L.M., Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A. High-threshold calcium channel activity in rat hippocampal neurones during hypoxia. Brain Res., 1999, 833/2, p. 319-328.

19. Lukyanetz E.A., Yavorsky V.A. 1999, Investigation of pilocarpine action on properties of accommodation in isolated phasic neurones of rat hippocampus. Fiziol Zh. 45, 4, p. 35-40.

20. Lukyanetz E.A., Yavorsky V.A., Kostyuk P.G. Electrical properties of tonic hippocampal neurones can underlie epileptogenesis in brain. 2000. Fiziol Zh. 46(2), p.141-142.

21. Yavorsky V.A., Lukyanetz E.A. 2000. Influence of Li⁺ ions on properties of accommodation in CA1 hippocampal neurones. Neurophysiology (Kiev). 32 (3), 256-258.

22. Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Lukyanetz E.A. 2000. Comparative characteristics of secretory responses of chromaffin cells and pheochromocytoma cells (PC12) during their activation by acetylcholine. Neurophysiology (Kiev). 32 (3), 215-217.

23. Koval L.M., Yavorskaya E.N., Tokar S.L, Lukyanetz E.A. 2000. Ultrastructural properties of steroid vesicles and mitochondria in bovine adrenocortical cells. Neurophysiology (Kiev). 32 (3), 272-274.

24. Lukyanetz E.A. 2001. Intracellular events during depolarization-induced exocytosis in chromaffin cells. In: Calcium Signalling, Morad M., Kostyuk P. eds. NATO Science Series, Series I: Life and Behavioural Sciences. V. 331, IOS Press Ohmsha, Amsterdam, The Netherlands. p. 174-182.

25. Koval L.M., Yavorskaya E.N., Lukyanetz E.A. 2001. Electron microscopic evidence for multiple types of secretory vesicles in bovine chromaffin cells. General. Compar. Endocrynol. 121, (3), 261-277.

26. Lukyanetz E.A.. Different secretory vesicles can be involved in depolarization-evoked exocytosis. 2001. Biochem.Biophys.Res.Com. 288 (4), p. 844-848.

27. Shkryl V.M., Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A Dual action of cytosolic calcium on calcium channel activity during hypoxia in hippocampal neurones. 2001 NeuroRep, 12(18), p. 4035-4039.

28. Zaika O.L., Pochynyuk O.M. Lukyanetz E.A. 2001. Electrochemical studies of induced secretion of catecholamines from single vesicles of rat chromaffin cells. Ukr. Biochem J. Vol. 73(4) pp. 69-72.

29. Yavorsky V.A., Lukyanetz E.A. 2001. The role of ca ions in frequency accommodation in rat hippocampal neurons. Ukr. Biochem J. Vol. 73(5) pp. 123-127.

30. Lukyanetz E.A., Shkryl V.M., Kostyuk P.G. Selective blocking of N-type calcium channels by levetiracetam. 2002. Epilepsia. 43(1), p. 9-18.

31. Lukyanetz E.A., Pochynyuk O.M., Zaika O.L., 2002. Amperometric evidence about participation of several types of vesicles in exocytosis from chromaffin cells. J. Physiology (Paris), 96, p. 147-148.

32. Lukyanetz E.A., Sotkis A.V., Kostyuk P.G. 2002. Mechanisms of up-regulation of single calcium channels by serotonin in Helix pomatia neurons. Biochem.Biophys.Res.Com. 2002 Apr 26; 293(1):132-8.

33. Stanika R.I., Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A. 2002. Studies of action of hypoxia on calcium homeostasis in sensory neurons of rats. Fiziol Zh. 48(2), p. 15-16.

34. Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Lukyanetz E.A. 2002. Investigation of calcium transients induced by acetylcholine in isolated chromaffin cells of rat. Fiziol Zh., 48(2), p. 5-6.

35. Koval L., Tokar S., Yavorskaya E., Lukyanetz E. (2002) Calcium-induced ultrastructural interactions in adrenocorticocytes. Neurophysiology, 34, No 2/3, 2002, p. 177-178.

36. Lukyanetz I., Yavorskaya E., Tokar S., Lukyanetz E. (2002). Role of mitochondria and endoplasmic reticulum in calcium elevation during Osmotic shock in adrenocortical cells. Neurophysiology, 34, No 2/3, 2002, p. 192-194.

37. Pochynyuk O., Zaika O., Lukyanetz E. (2002) The role of mitochondria in generation of acetylcholine-induced calcium transients in rat chromaffin cells. Neurophysiology, 34, No 2/3, 2002, p. 217-219.

38. Tokar S., Koval L., Yavorskaya E., Lukyanetz E. (2002) Changes in the ultrastructure of adrenocortical cells induced by cholinergic agonists. Neurophysiology, 34, No 2/3, 2002, p. 257-259.

39. Zaika O., Pochynyuk O., Lukyanetz E. (2002) Comparative studies of calcium transients induced by acetylcholine in rat chromaffin cells. Neurophysiology, 34, No 2/3, 2002, p. 270-272.

40. Lukyanetz E. (2002) Vesicular mechanisms of calcium-dependent exocytosis of neurotransmitters. Архив клинической и экспериментальной медицины, т. 11, № 1, 2002, с. 10-14.

41. Kostyuk P., Lukyanetz E., Shuba Y. (2002) Molecular physiology of the calcium channels. Neurophysiology, 34, No 2/3, 2002, p. 117-120.

42. Lukyanetz E.A., Shkryl V.M. Scientific and technological aspects of oxygen-sensitive electrodes for measurements of oxygen partial pressure in patch-clamp experiments. 2003, Biochem. Biophys. Methods. 55(1), p. 37-52.

43. Lukyanetz E.A., Stanika R.I., Koval L.M., Kostyuk P.G. 2003. Intracellular mechanisms of hypoxia-induced calcium increase in rat sensory neurons, Arch.Biochem.Biophys, 410(2), p. 212-221.

44. Kostyuk P.G., Stanika R.I., Koval L.M., Lukyanetz E.A. 2003. Intracellular calcium homeostasis of sensory neurons at hypoxic influences. Fiziol. Zh.(Kiev) 49(3), p. 3-10.

45. Lukyanetz E.A., Shkryl V.M., Kravchuk O.V., Kostyuk P.G. Hypoxic effect on calcium channels depends on extracellular calcium in hippocampal neurons. 2003. Br. Res, 980(1), p. 128-134.

46. Kostyuk P.G., Pochynyuk O.M., Zaika O.L., Lukyanetz E.A. 2003. Role of nicotinic and muscarinic receptors in calcium signalling and neurotransmitter release. 2003, Neurophysiology, 35, p. 229-235.

47. Lukyanetz E.A., Shkryl V.M., Kravchuk O.V., Kostyuk P.G. 2003. Action of hypoxia on different types of calcium channels in hippocampal neurones. BBA, 1618/1 pp. 33-38.

48. Zaika O.L, Pochynyuk O.M., Kostyuk P.G., Lukyanetz E.A. 2004. Acetylcholine-induced calcium signalling in adrenaline and noradrenaline containing adrenal chromaffin cells. ABB 424/1 pp. 23-32.

49. Lukyanetz E.A., Stanika R.I., Koval L.M., Yavorskaya E.N., Kostyuk P.G. 2004. Studies of mechanisms of intracellular calcium oscillations caused by hypoxia in chromaffin cells of rat. Clinical and experimental pathology. 3(2/2), p. 94-96.

50. Tokar S.L., Koval L.M., Yavorska E.M., Lukyanetz E.A., Ultrastructural characteristics of rat adrenal cortex cultured cells in the norm and after calcium ionophore A23187 and adrenocorticotropic hormone application. Fiziol Zh. 2004;50(2):105-10.

51. Ultrastructural characteristics of lipid droplets in rat adrenocortical cells from zona fasciculata-reticularis. Fiziol Zh. 2004;50(6):107-13.

52. Kostyuk P.G., Stanika R.I., Lukyanetz E.A. 2004. Intracellular mechanisms of hypoxic disorders in nerve cell function. In: Problems of hypoxia: molecular, physiological and medical. Lukyanova L.D., Ushakov I.B. Eds. Moskow, Voronezh. “Istoki”, p. 84-95.

53. Bacova Z, Benicky J, Lukyanetz E, Lukyanetz I, Strbak V. Different signaling pathways involved in glucose- and cell swelling-induced insulin secretion by rat pancreatic islets in vitro. Cell Physiol Biochem. 2005;16(1-3):59-68.

54. Kostyuk P.G., Veselovsky M.S., Kostyuk O.P., Kravchenko M.O., Lukyanetz E.A., Moskalyuk A.O., Pochynyuk O.M., Fedulova S.A. 2005. Pathways of regulation of synaptic transmission via effects on submicroscopic structure synapses. In: “Fundamental guide of Sciences“, (Biology and sciences about Earth and environmental) Academperiodyka” Kiev, p. 119-129.

55. Kostyuk P.G., Kostyuk E.P., Lukyanetz E.A. 2005 Calcium ions - from physiology to pathology. Naukova Dumka, Kiev, pp. 197.

56. Lukyanetz E.A. Intracellular components of regulated exocytosis in chromaffin cells. New Jersey, CRDF Meeting, USA 12-19 March, 2000.

57. Lukyanetz E.A. Intracellular events during regulated exocytosis in chromaffin cells. NATO Workshop, Ca²⁺ Signaling and Cross-talk, IlCiocco, Italy 26-30 April, 2000.

58. Lukyanetz E.A., Yavorsky V.A., Kostyuk P.G. Electrical properties of tonic hippocampal neurones can underlie epileptogenesis in brain. 2000. Fiziol Zh. III National congress of Pathophysiologists, 24-27 May, Odessa.

59. Lukyanetz E.A. 2000. Ca-dependent exocytosis in neuroendocrine cells, Autumn Workshop "Membranes and Signalling", Kiev, September 4-8, 2000. (lecture, not published).

60. Yavorsky V.A., Lukyanetz E.A. 2000. Influence of Li⁺ ions on properties of accommodation in CA1 hippocampal neurones. Neurophysiology (Kiev). Autumn Workshop "Membranes and Signalling", Kiev, September 4-8, 2000.

61. Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Lukyanetz E.A. 2000. Comparative characteristics of secretory responses of chromaffin cells and pheochromocytoma cells (PC12) during their activation by acetylcholine. Neurophysiology (Kiev). Autumn Workshop "Membranes and Signalling", Kiev, September 4-8.

62. Koval L.M., Yavorskaya E.N., Tokar S.L, Lukyanetz E.A. 2000. Ultrastructural properties of steroid vesicles and mitochondria in bovine adrenocortical cells. Neurophysiology (Kiev). Autumn Workshop "Membranes and Signalling", Kiev, September 4-8, 2000.

63. Lukyanetz E.A., Pochynyuk O.M., Zaika O.L. 2000. Amperometric evidence about participation of several types of vesicles in exocytosis from chromaffin cells. Confйrence en Neurobiologie Ladislav Tauc 2000, Gif-sur-Yvette, France, December14-15 2000.

64. Lukyanetz E.A., Zaika O.L., Pochynyuk O.M., Kostyuk P.G. 2000. Two classes of vesicles participate in induced exocytosis from isolated rat chromaffin cells. J. Physiol., Physiological Society Meeting, King's College London, UK, December 18-20.

65. Lukyanetz E.A. 2001. Intracellular mechanism of calcium-dependent neurotransmitter release. Bogomoetz-Nencki Meeting, Sulejow, Poland, 2001, p. L4.

66. Lukyanetz E.A. Vesicular mechanisms of calcium-dependent exocytosis of neurotransmitters II Conference of Ukrainian Society for Neurosciences with international participation. Dedicated to 70-aniversary of Physiology Dept. Donetsk State Medical University. Donetsk, 23-27 May 2001.

67. Lukyanetz, EA, Pochynyuk, OM, Zaika OM. 2001. Evidence for participation of different types of vesicles in stimulus-induced exocytosis in chromaffin cells. XXXIV International Congress of Physiological Sciences, New Zeland, August 26-31, 2001, IUPS.

68. Lukyanetz E.A., Shkryl V.M., Kostyuk P.G. Antiepileptic drug levetiracetam selectively blocks N-type calcium channels isolated CA1 hippocampal neurons. 2001, Joint Meeting of American Epilepsy Society and the American clinical Neurophysiology Society, Philadelphia, Nov30-.Dec5.

69. Kostyuk P.G., Shkryl V.M., Lukyanetz E.A.. 2002. Analysis of levetiracetam action on calcium channel subtypes of hippocampal neurons. Europ. J. Neurol. 9, (Suppl.2), p. 175. 6^th Congress of the European Federation of Neurological Societies, Vienna, October 26-29, 2002.

70. Lukyanetz E.A., Shkryl V.M., Pochynyuk O.M., Zaika O.L., Kostyuk P.G.. 2002. Molecular mechanisms of levetiracetam action on calcium channels in ca1 hippocampal neurons. Europ. J. Neurol. 9, (Suppl.2), p. 178. 6^th Congress of the European Federation of Neurological Societies, Vienna, October 26-29, 2002.

71. Lukyanetz E.A. Vesicular mechanisms of calcium-dependent exocytosis of neurotransmitters. 2002. Arch. Clin.Exper.Med. v.11(1), p.10-14. II Conference of Ukrainian Society for Neurosciences. Donetsk.

72. Tokar S., Koval L., Yavorskaya E., Lukyanetz E. Role of calcium ions in ultrastructure changes evoked by adrenocorticotropic hormone in rat adrenocortical cells. 2002. Second Bogomoletz-Nencki Symposium “Intracellular Signalling in Excitable Cells”, Kiev, Ukraine, September 1-3, Abstract Book, p. 17.

73. Pochynyuk O., Zaika O., Lukyanetz E. Comparative characteristics of time course of secretion during different type of stimulation from rat chromaffin cells. 2002. Second Bogomoletz-Nencki Symposium “Intracellular Signalling in Excitable Cells”, Kiev, September 1-3, Abs. Book, p. 14.

74. Lukyanetz E., Stanika R., Shkryl V., Koval L., Kostyuk P. Hypoxia-induced changes in neuronal activity: role of Ca²⁺ ions and mitochondria. 2002. Second Bogomoletz-Nencki Symposium “Intracellular Signalling in Excitable Cells”, Kiev, Ukraine, September 1-3, Abstract Book, p. 11.

75. Lukyanetz E., Shkryl V., Kostyuk P. Role of external calcium ions in the development of hypoxic response in hippocampal neurons. 2002, Intern. Symp. “ASTROECO-2002”, Abstr Book, p. 65.

76. Kostyuk P., Stanika R., Koval L., Lukyanetz E. Intracellular mechanisms of hypoxia-induced changes in calcium homeostasis in neurons. 2002. International Symposium “ASTROECO-2002”, Abstract Book, p. 53.

77. Zaika O., Pochynyuk O., Lukyanetz E.A., Comparative studies of calcium transients induced by acetylcholine in rat chromaffin cells. 2002. Neurophysiology, 34(2/3), p. 270-272. International Summer Workshop “Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System” June, Kiev.

78. Tokar S., Koval L., Yavorskaya E., Lukyanetz E.A., 2002, Neurophysiology, 34(2/3), p.257-259. International Summer Workshop “Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System”, 16-18 June, Kiev.

79. Pochynyuk O., Zaika O., Lukyanetz E.A., The role of mitochondria in generation of acetylcholine-induced calcium transients in rat chromaffin cells. 2002, Neurophysiology, 34(2/3), P.217-219. International Summer Workshop “Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System”, 16-18 June, Kiev.

80. Lukyanets I., Yavorskaya E., Tokar S., Lukyanetz E. Role of mitochondria and endoplasmic reticulum in calcium elevation during osmotic shock in adrenocortical cells. 2002, Neurophysiology, 34(2/3), P. 192-194. International Summer Workshop “Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System”, 16-18 June, Kiev.

81. Koval L., Tokar S., Yavorskaya E., Lukyanetz E. Calcium-induced interactions in adrenocorticocytes. 2002, Neurophysiology, 34(2/3), P. 177-178. International Summer Workshop “Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System”, 16-18 June, Kiev.

82. Kostyuk P., Lukyanetz E., Shuba Y. 2002, Neurophysiology, 34, P. 117-120. International Summer Workshop “Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System”, 16-18 June, Kiev.

83. Tokar S., Lukyanets I.A., Yavorskaya E., Lukyanetz E.A., Changes of intracellular calcium homeostasis evoked by steroidogenic factors. 2002, Abstract Book, P. 17. XVI Congress of Ukrainian Physiological Society. 28-30 May, Vinnitsya.

84. Stanika R., Kostyuk P., Lukyanetz E. Studies of hypoxic effect on calcium homeostasis in sensory neurons of rats. 2002, Abstract Book, P.15. XVI Congress of Ukrainian Physiological Society. 28-30 May, Vinnitsya.