Протонна регуляція процесів трансформації енергії в тилакоїдних мембранах

90 ± 8

0,5 мкМ

50 ± 5

38 ± 4

45 ± 5

60 ± 5

1 мкМ

42 ± 5

25 ± 3

20 ± 1

10 ± 1

2 мкМ

35 ± 4

20 ± 2

10 ± 1

-

Примітка: результати наведені у вигляді М у (n = 8).

При екрануванні негативного поверхневого заряду протонами доступ фериціаніду до центру його відновлення у ФСII полегшується. Показано також, що в цьому діапазоні рН зростає швидкість відновлення молекулярного кисню (Хоробрых и др., 2002).

У табл. 9 наведені дані, що показують зв'язок між величиною трансмембранного протонного градієнта в тилакоїдах і ступенем інгібування електронного перенесення від води до фериціаніду в присутності 2 мкМ DBMIB або 1 мкМ NQNO. Величину ДрН варіювали шляхом зміни інтенсивності освітлення, а також додаванням субстратів і продукту фотофосфорилування, які є фізіологічними регулювальниками величини рН (McCarty et al., 1971; Evron, Avron, 1990; Groth, Junge, 1993).

Таблиця 9 Вплив аденіннуклеотидів на величину pH і швидкість перенесення електронів від води до K₃Fe(CN)₆

Умови	pH*	Фотовідновлення FeCy, мкмоль / мг хл · год.
		Контроль	+ 2 мкM DBMIB	+ 1 мкM NQNO
Базальні умови		160 20	75 11	70 8
+ 5 мкM АТФ	+0,05	145 18	90 12	75 8
+ 10 мкМ АТФ	+0,12	130 15	90 12	80 10
+ 15 мкM АТФ	+0,15	120 15	105 13	95 12
+ 0,02 мM AДФ + 3 мM арсенату натрію	-0,03	165 18	70 13	65 8
+ 0,05 мM AДФ + 3 мM арсенату натрію	-0,08	180 30	70 12	55 8
+ 0,1 мM AДФ + 3 мM арсенату натрію	-0,12	240 35	50 10	45 8

Примітки: * - pH складав 3,4-3,5 од. за базальних умов. Результати наведені у вигляді М у (n = 6).

У наших дослідах додавання ATФ (5-15 мкМ) приводило до зростання рН на 0,05-0,15 од., уповільнення перенесення електронів і падіння ефективності інгібування DBMIB і NQNO. Так, якщо за базальних умов фотовідновлення FeCy в присутності 2 мкМ DBMIB становило 47 % від контролю, то при додаванні в середовище 15 мкМ АТФ швидкість реакції в присутності інгібітора збільшувалася до 87,5 % від контролю.

Відомо, що субстрати фотофосфорилування (AДФ і As_н) викликають зниження трансмембранного pH у тилакоїдах (Pick et al., 1973). За нашими даними (табл. 9) це зниження не перевищувало 0,12 од. рН і супроводжувалося прискоренням перенесення електронів від води до кінцевого акцептора. Ефективність інгібування фоторедукції FeCy за умов присутності DBMIB або NQNO зростала. За наявності в середовищі субстратів фотофосфорилування введення DBMIB (2 мкМ) викликало майже п'ятиразове падіння швидкості фотовідновлення FeCy. Таким чином, швидкість перенесення електронів від Н₂О до FeCy залежить від додавання ATФ або AДФ і фосфату (арсенату) і корелює зі змінами величини pH, викликаними введенням нуклеотидів.

У табл. 10 наведені результати експериментів по визначенню впливу інгібіторів цитохромного b₆f комплексу на швидкість фотовідновлення FeCy в присутності роз'єднувача NН₄Сl. За нашими даними, NН₄Сl (0,5-1 мМ - істотно, а 5 мМ - повністю) усуває рН (не показано). З табл. 10 видно, що ефективність інгібіторної дії DBMIB зростала в міру підвищення вмісту роз'єднувача і в повністю роз'єднаній системі наближалася до 100 %. Ступінь інгібування DBMIB у присутності NН₄Сl не залежав від присутності субстратів і продукту фотофосфорилування (не показано).

Таблиця 10 Вплив DBMIB і аденіннуклеотидів на швидкість перенесення електронів від води до K₃Fe(CN)₆ у присутності NH₄Cl

Умови	Фотовідновлення FeCy, % від контролю
	-	+ 15 мкМ ATФ	+ 0,2 мM AДФ + 3 мM Asн
	-	+ 2 мкM DBMIB	-	+ 2 мкМ DBMIB	-	+ 2 мкM DBMIB
-	100	47 5	75 7	64 7	156 16	34 3
+ 0,5 мМ NH4Cl	105 9	38 4	80 8	52 5	165 15	25 3
+ 1 мМ NH4Cl	110 11	25 2	86 7	40 4	178 18	18 2
+ 10 мM NH4Cl	210 19	5 1	210 20	5 1	270 24	5 1

Примітка: результати наведені у вигляді М у (n = 4).

Отже, доступність акцепторного центру фотосистеми II залежить від величини трансмембранного протонного градієнта на тилакоїдній мембрані. При підвищенні ДpH індукується альтернативний шлях перенесення електронів безпосередньо з ФСII на екзогенний високополярний акцептор, при зниженні ДpH зростає участь ФСI у відновленні екзогенного акцептора.

Термодинамічна ефективність процесів трансформації енергії в хлоропластах. Для оцінки впливу інтенсивності світла на термодинамічну ефективність перетворення енергії хлоропластами рослини гороху вирощували за різної інтенсивності світла. Фотосинтетичну ефективність у листках оцінювали за кривими модульованої флуоресценції хлорофілу а (табл. 11). Для цього розраховували максимальний квантовий вихід (F_v/F_m), величину квантового виходу фотохімічних реакцій ФСІІ в адаптованому до світла стані (F'_v/F'_m), частку відкритих РЦ ФСІІ (qP), і параметр PSII, який дозволяє оцінити квантовий вихід електронного транспорту.

Таблиця 11 Фотохімічна і термодинамічна ефективність енерготрансформації в листках і ізольованих хлоропластах гороху, вирощеного за різної інтенсивності світла

Середня ЩПФ* при вирощуванні, мкмоль м-2 с-1	АС**, мкмоль · м-2 с-1	Fv/Fm	qP	PSII	F'v/F'm	q	зопт
1200	1500	0,778 0,001	0,601 0,051	0,268 0,020	0,438 0,018	0,933	0,471
	500	0,796 0,001	0,797 0,008	0,538 0,050	0,674 0,028	0,934	0,474
130	1500	0,744 0,001	0,412 0,041	0,143 0,030	0,331 0,031	0,878	0,353
	500	0,749 0,001	0,859 0,008	0,404 0,019	0,489 0,018	0,933	0,471

Примітки: * ЩПФ - щільність потоку фотонів; ** АС - актинічне (діюче) світло. Результати наведені у вигляді М у (n = 8).

За даними табл. 11, квантовий вихід електронного транспорту PSII є вищим у рослин, які росли при сильному освітленні. Величина цього параметра також залежала від інтенсивності актинічного світла при збудженні фотохімічної активності безпосередньо в досліді: вищі значення PSII реєструвалися при діючому світлі низької інтенсивності. Це узгоджується з літературними даними, згідно з якими максимальна ефективність фотосинтезу спостерігається в умовах низької освітленості.

Підвищення інтенсивності збуджуючого світла викликає фотоінгібування, емпіричним критерієм якого є зменшення величини qР нижче 0,6 (Horton et al., 1996), з одного боку, та зниження квантового виходу фотохімічних реакцій ФСІІ в адаптованому до світла стані (F'_v/F'_m) і реального квантового виходу електронного транспорту (?PSII), з іншого. Порівняння флуоресцентних параметрів показує, що в рослин, які виросли при низькій інтенсивності світла, за умов інтенсивності актинічного світла 1500 мкмоль м-² с-¹ qP нижче 0,6 і параметри F'_v/F'_m і ?PSII також значно знижуються. Таким чином, дані, отримані методом модульованої флуоресценції хлорофілу, свідчать про фотоінгібування в листках, які були сформовані за умов низької освітленості.

Термодинамічну ефективність перетворення енергії в хлоропластах, що були ізольовані з цих рослин, оцінювали, визначаючи коефіцієнт сполучення q (Kedem, Caplan, 1965): , якій розраховували за результатами визначення швидкостей електронного транспорту в ізольованих тилакоїдах у стані фотосинтетичного контролю (J_e)_фк (стан 4 за Чансом) (Nishimura et al., 1962) і за умов повного роз'єднування (J_e)_роз, яке створювалося шляхом додавання до реакційного середовища 10 мМ NH₄Cl. Вимірювали швидкості перенесення електронів по повному ланцюгу від води до МВ у тилакоїдах, модулюючи стан фотосинтетичного контролю додаванням 3 мМ фосфату і 50 мкМ АТФ у середовище, яке не містило АДФ.

Розраховували також оптимальну термодинамічну ефективність системи для кожного значення коефіцієнта сполучення . З даних табл. 11 видно, що термодинамічні характеристики процесів енергетичного сполучення залежать як від світлових умов вирощування рослин гороху, так і від інтенсивності світла в ході експериментів з визначення швидкостей реакції Хілла. Найвищого значення коефіцієнт сполучення набував при насичуючому освітленні (500 мкмоль м-² с-¹) препаратів, ізольованих з листя гороху, вирощеного за високої інтенсивності світла. Для цих же зразків характерна і найвища швидкість фотофосфорилування (Jp).

Величини коефіцієнта сполучення і оптимальна термодинамічна ефективність помітно знижувалися в препаратах тилакоїдів, ізольованих з рослин, що зростали за умов низької освітленості, якщо фотохімічні реакції індукували світлом високої інтенсивності.

Розрахунки оптимальної термодинамічної ефективності показали, що перетворення світлової енергії в хлоропластах, виділених зі “світлових” рослин, відбувається ефективніше в широкому діапазоні інтенсивності збуджуючого світла порівняно з “тіньовими” зразками. Можна вважати, що причиною втрати ефективності фотосинтетичного апарату, сформованого за умов низької освітленості, є фотоінгібування, яке розвивається при інтенсивності світла, що перевищує оптимальну.

Втрату термодинамічної ефективності сполучення реакції фотофосфорилування і електронного транспорту в хлоропластах, які були ізольовані з листків, що демонструють ознаки фотоінгібування, слід, очевидно, пов'язувати з порушенням електронного транспорту в ФСІІ. Зниження фотофосфорилування за цих умов відбувається через внутрішньомолекулярне роз'єднування (“сліп”) електронного перенесення в комплексі ФСІІ. Д. Пітробон і С. Каплан визначали електронний пробій (slip) як транспорт електронів без відповідного перенесення протонів і навпаки (Pietrobon, Caplan, 1985). Згідно з іншим визначенням “сліп” - це пов'язаний з білком протонний витік. К. Гарлід (Garlid et al., 1989) вважав, що шляхи витоку протонів найімовірніше розташовані поблизу інтегральних мембранних білків, оскільки поблизу білків енергія активації для перетину гідрофобної фази мембран знижена. У даній роботі було отримано докази наявності протонного “сліпу” на рівні АТФсинтази, який виникав за спеціальних умов обробки тилакоїдів ДЦКД-ом. Це явище поряд з результатами даної частини роботи дозволяє розширити уявлення про природу механізмів, що викликають втрату термодинамічного сполучення реакцій енерготрансформації в хлоропластах.

Участь зв'язаного бікарбонату в поглинанні і транспортуванні протонів. Швидкість фотохімічних реакцій у хлоропластах залежить від присутності в середовищі неорганічного вуглецю (Сн), видалення якого приводить до уповільнення електронного транспорту навіть в ізольованих фрагментах фотосинтезуючих мембран, не здатних до фотосинтетичної асиміляції СО₂ (Stemler, 1975, 1977, 1980, 1989; Klimov et al., 1995) Загальна кількість зв'язаного бікарбонату складає біля 1 мкмоль / мг хл, але тільки одна міцно зв'язана з РЦ молекула контролює активність ФСІІ; водночас пул менш міцно зв'язаного бікарбонату (з концентрацією, близькою до концентрації хлорофілу) може бути вилучений без істотних наслідків для активності ФСІІ (Stemler, 1983). Про функціональну роль пулу слабко зв'язаного з тилакоїдами бікарбонату практично нічого не відомо. У даній роботі в першу чергу було досліджено вплив бікарбонату на поглинання протонів у слабко забуференій суспензії хлоропластів, індуковане світлом. При освітленні суспензії тилакоїдів поглинається до 0,5-0,7 мкмоль протонів, і цей процес пов'язують з формуванням трансмембранного ДрН і енергізацією тилакоїдних мембран (Abbott, Dilley, 1983; Berry, Rumberg, 1999). Величина світлоіндукованого поглинання протонів ізольованими хлоропластами (ДH⁺) визначається ступенем нативності мембран, величиною зміни рН реакційного середовища при освітленні хлоропластів (дрН), буферною ємністю і значенням рН середовища. Роз'єднувачі, так само як і інгібітори електронного транспорту, інгібують ДH⁺. Природа буферних груп, які беруть участь у формуванні ДH⁺, їхня конкретна локалізація в межах поліпептидних комплексів тилакоїдної мембрани залишаються нез'ясованими. Враховуючи те, що тилакоїди містять значну кількість зв'язаного бікарбонату - аніона з рК ~ 6,37 (Альберт, Сержент, 1964), можливо припустити, що пул НСО₃- бере участь у світлозалежному поглинанні протонів. При цьому необхідно встановити роль карбоангідрази (КА, карбонат-гідро-ліази, КФ 4.2.1.1.) (Lu, Stemler, 2002) - ферменту, який каталізує гідратацію і дегідратацію вуглекислого газу і присутній у хлоропластах у декількох формах (Lu et al., 2005; Иванов и др., 2007). У контрольних препаратах ця величина практично не змінювалася протягом 6-8 годин збереження при 4 °С. При додаванні бікарбонату в концентраціях від 0,25 до декількох мМ, величина ДH⁺ зростала в 1,2-2 рази (не показано). Інгібітори КА усували цю стимуляцію.

У зв'язку з цим було перевірено вплив 0,25-2 мМ бікарбонату, доданого екзогенно до суспензії хлоропластів, а також інгібіторів КА - АА і ЕА - на величину трансмембранного ДрН, яку визначали за світлоіндукованим гасінням рН-залежної флуоресцентної мітки 9-аміноакридину. Дані показали, що ні екзогенно доданий бікарбонат, ані інгібітори КА не впливали на величину ДрН (не наведено). У той же час, екзогенно доданий бікарбонат та інгібітори КА дуже помітно впливали на швидкості реакцій циклічного і нециклічного фотофосфорилування (табл. 12).

Таблиця 12 Вплив інгібіторів КА на швидкості фотохімічних реакцій ізольованих хлоропластів

Тривалість інкубації з інгібіторами	Швидкість перенесення електронів від Н2О до МВ, % від контролю	Швидкість фотофосфорилування
		циклічного (з ФМС), % від контролю	нециклічного (з МВ), % від контролю
20 хв. інкубації в присутності 1 мМ АА	100 ± 5	85 ± 5	60 ± 5
20 хв. в присутності 1 мМ ЕА	100 ± 5	85 ± 5	50 ± 5
1 год. в присутності 1 мМ АА	100 ± 5	40 ± 5	15 ± 3
1 год. в присутності 1 мМ ЕА	100 ± 5	30 ± 5	10 ± 2

Примітка: результати наведені у вигляді М у (n = 15).

Додавання інгібіторів КА призводило до зниження швидкості фотофосфорилування, причому швидкість лінійного перенесення електронів не змінювалася, так само як і величина ДрН. Внесення бікарбонату (2-8 мМ) викликало зростання швидкості синтезу АТФ. Отримані дані свідчать, що бікарбонатний буфер, асоційований з тилакоїдними мембранами, так само як і тилакоїдна КА, бере участь у спряженні процесів електронного і протонного транспорту, забезпечуючи, можливо, прискорення перенесення протонів від протон-генеруючих помп до АТФсинтази.

Закінчення. За рахунок протонів, які утворюються в ході фотосинтетич-

ного транспорту електронів у тилакоїдних мембранах, формується трансмембранний протонний градієнт, якій відіграє як енергетичну, так і регуляторну роль. Вихід протонів з енергізованих тилакоїдів крізь канал АТФсинтази енергетично забезпечує синтез АТФ. Дискусія відносно існування і можливої організації виділених шляхів перенесення протонів від Н⁺-генеруючих протонних помп до АТФсинтази за участю інтегральних мембранних білків або в примембранних шарах триває більш 40 років (Mitchell, 1976; Williams, 1978; Kell, 1979; Dilley, 1986, 1991; Ewy, Dilley, 2000, Cherepanov et al., 2004; Мулкиджанян и др., 2005). Згідно з Р. Діллі (Dilley, 1991; Ewy, Dilley, 2000), латеральне перенесення протонів відбувається за участю оборотного протонування-депротонування буферних груп деяких мембранних білків. У даній роботі вдалося показати, що 1) значна частина буферної ємності тилакоїдів забезпечується молекулами мембранозв'язаної вуглекислоти, вміст якої в тилакоїдах досить високий (до 1,5 мкмоль / мг хл); 2) пул мембранозв'язаного бікарбонату бере участь у поглинанні і перенесенні протонів, забезпечуючи протікання реакції фотофосфорилування; 3) залучення бікарбонату до процесів енерготрансформації відбувається за участю карбоангідрази. Очевидно, що в присутності значних кількостей буферу СО₂ / HCO₃- навіть проста дифузія протонів у люмені тилакоїдів буде пришвидшуватися за механізмом полегшеної дифузії. Внесок буферної системи СО₂ / HCO₃- у сполучення реакцій утворення і споживання протонів у тилакоїдах буде залежати від швидкості бікарбонатного обміну люмена зі стромальною фазою хлоропласта, забезпечуючи, таким чином, зворотний зв'язок і можливість фізіологічної координації систем енергетичного і вуглецевого метаболізму.

ВИСНОВКИ

1. Запропоновано механізм сполучення електронного транспорту і фотофосфорилування за участю мембранозв'язаного бікарбонату, роль якого полягає в забезпеченні перенесення протонів від мембранних протонних помп до АТФсинтази.

2. Доведено, що для вивчення шляхів перенесення протонів по інтегральним мембранним комплексам тилакоїдної мембрани може бути використаний метод протон-тритієвого обміну, за допомогою якого вдалося показати, що а) за умов фотофосфорилування перенесення тритію з мембранного пулу в АТФсинтазу не включає стадії виходу радіоактивної мітки у водну фазу; б) світлозбиральний комплекс ФСІІ бере участь у захопленні й перенесенні протонів.

3. У залежності від функціонального стану хлоропластів перенесення протонів відбувається двома різними шляхами - фосфорилуючим і нефосфорилуючим, що пов'язано з конформаційним переходом в АТФсинтазі, який відбувається внаслідок зв'язування субстратів фотофосфорилування.

4. Протонна буферна ємність тилакоїдних мембран хлоропластів у фізіологічному діапазоні рН забезпечена головним чином за рахунок мембранозв'язаного бікарбонату, фонд якого підтримується за участю карбоангідрази тилакоїдів.

5. Величина світлоіндукованого поглинання протонів хлоропластами визначається кількістю мембранозв'язаного бікарбонату й активністю карбоангідрази. Від активності карбоангідрази і заповненості пулу зв'язаного бікарбонату залежить швидкість фотофосфорилування в хлоропластах.

6. Рівень ДрН контролює внесок фотосистем І і ІІ у перенесення електронів до екзогенного акцептора (кисню або фередоксину). При підвищенні ДрН відкривається альтернативний шлях перенесення електронів безпосередньо на зовнішній акцептор, оскільки лінійний транспорт електронів між фотосистемами блокований через повне відновлення пластохінону.

7. На підставі аналізу швидкостей роз'єднаного транспорту електронів і перенесення електронів у стані фотосинтетичного контролю зроблено оцінку термодинамічної ефективності фотосинтетичного перетворення енергії за різних умов формування фотосинтетичного апарату рослин.

8. Визначені умови специфічної модифікації протонного каналу АТФсинтази хлоропластів гідрофобним конденсуючим агентом - N,N'- дициклогексилкарбодіімідом (ДЦКД). Показано, що ДЦКД каталізує алкілування функціональних груп компонентів електронтранспортного ланцюга у присутності спиртів і через це інгібує процеси роз'єднаного електронного транспорту в хлоропластах.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Опанасенко В.К., Золотарёва Е.К., Макаров А.Д. Протонная ёмкость сопрягающих мембран хлоропластов в связи с процессами энерготрансформации // Физиол. раст. - 1983. - Т. 30, № 1. - С. 14-22. (Особистий внесок здобувача - виконання біохімічної частини роботи, виготовлення препаратів, визначення залежності швидкості електронного транспорту від рН).

2. Сухоруков Б.И., Монтрель М.М., Опанасенко В.К., Золотарёва Е.К. Изучение взаимодействия ДНК с протонами среды методом буферной ёмкости // Молекулярная биология. - 1983. - Т. 17, № 5. - С. 1009-1018. (Особистий внесок здобувача - отримання кривих титрування та буферної ємності, аналіз впливу умов титрування на буферний спектр поліамфолітів).

3. Музафаров E.Н., Золотарёва Е.К., Назарова Г.Н. и др. Эффект (-) эпигаллокатехингаллатов в фотохимических реакциях хлоропластов // Физиол. и биохим. культ. раст. - 1984. - Т. 16, № 5. - С. 476-482. (Особистий внесок здобувача - отримання кривих титрування поліфенолів та визначення їх протолітичних властивостей, написання статті).

4. Золотарёва Е.К., Опанасенко В.К. Сравнительное исследование протонирования полифенольных соединений с систематической вариацией структуры // В кн. “Свойства флавоноидов и их функции в метаболизме растительной клетки”. - Пущино, 1986. - С. 22-38. (Особистий внесок здобувача - визначення кислотно-основних властивостей багатьох представників рослинних фенолів, систематизація даних по впливу хімічної структури поліфенолів на їх протолітичні характеристики, написання статті).

5. Опанасенко В.К., Казанцев А.П., Золотарева Е.К. Автоматизированная установка для определения буферной емкости // Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии. - Пущино, 1986. - С. 62-66. (Особистий внесок здобувача - розробка установки для потенціометричного титрування, визначення буферної ємності різних біологічно-активних речовин та аналіз впливу конформаційних перебудов їх структури на протолітичні характеристики).

6. Muzafarov E.N., Ivanov B.N., Mal'yan A.N., Zolotareva E.K. Dependence of flavonol function on their chemical structure in chloroplast energy reactions // Biochem. Physiol. Pflanz. - 1986. - Vol. 181, № 3. - P. 381-390. (Здобувачем особисто отримані криві титрування деяких рослинних фенолів та проаналізовано зв'язок між кислотно-лужними характеристиками фенолів та їх біологічною дією).

7. Zolotareva E.K., Opanasenko V.K., Zakharov S.D., Kuz'mina V.P. Correlation between energy-dependent tritium incorporation into CF₁ and light-induced protonation of thylakoid membranes // FEBS Lett. - 1986. - Vol. 197, № 1-2. - P. 125-128. (Здобувачем особисто проведено введення тритієвої мітки в поліпептиди фактору спряження хлоропластів, виділений, очищений і охарактеризований препарат міченого CF₁, визначений рівень зв'язаної радіоактивності, отримані і проаналізовані дані по впливу інгібіторів на криві титрування хлоропластів, написана стаття).

8. Гаспарян М.Э., Золотарева Е.К., Ягужинский Л.С. Исследование тритий- протонного обмена в тилакоидных мембранах // Биологич. мембраны. - 1989. - Т. 6, № 8. - С. 814-818. (Особистий внесок здобувача - формулювання ідеї, яка покладена в основу роботи, опрацювання робочої схеми експерименту, проведення дослідів, написання статті).

9. Золотарева Е.К., Гаспарян М.Э., Ягужинский Л.С. Перенос мембранносвязанного трития в хлоропластах в условиях фотофосфорилирования // Биологич. мембраны. - 1989. - Т. 6, № 8. - С. 819-825. (Особистий внесок здобувача - формулювання ідеї, яка покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, підготовка зразків для аналізу, аналіз результатів та написання статті).

10. Музафаров E.Н., Золотарёва Е.К., Назарова Г.Н., Байрамов Х.Б. Разобщающий эффект оксикоричных кислот в хлоропластах гороха // Физиол. раст. - 1989. - Т. 36, № 6. - С. 1060-1065. (Особистий внесок здобувача - особисто отримала всі наведені в статті експериментальні дані щодо протолітичних характеристик флавоноїдів, брала участь в аналізі даних та написанні статті).

11. Muzafarov E.N., Zolotareva E.K. Uncoupling effect of hydroxycinnamic acid derivatives on pea chloroplasts // Biochem. Physiol. Pflanz. - 1989. - Vol. 184, № 5-6. - P. 363-369. (Особистий внесок здобувача - виконання експериментальних робіт, участь в аналізі результатів, формулюванні висновків та написанні статті).

12. Zolotareva E.K., Gasparjan M.E., Yaguzhinsky L.S. Transfer of tightly-bound tritium from the chloroplast membranes to CF₁ is activated by photophosphorylation process // FEBS Lett. - 1990. - Vol. 272, № 2. - P. 184-186. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, виконання експериментальних робіт, аналіз результатів та написання статті).

13. Золотарёва Е.К. Влияние субстратов и продукта фотофосфорилирования на скорость переноса электронов в ДЦКД-обработанных хлоропластах // Доп. НАН України. - 1994. - № 6. - C. 154-157.

14. Золотарьова О.К. Зв'язування тритiю фотосинтетичними мембранами вищих рослин // Укр. бот. журн. - 1994. - Т. 51, № 6. - С. 98-102.

15. Золотарёва Е.К. Роль фотопоглощения кислорода в энергетическом обмене синезелёных водорослей // В кн. “Ботаника и микология на пути в третье тысячелетие, Международный сб. научных работ”. - К., 1996. - С. 238-244.

16. Золотарёва Е.К., Подорванов В.В. Структура и функции АТФсинтазы синезеленых водорослей // Альгология. - 1997. - Т. 7, № 3. - С. 317-329. (Особистий внесок здобувача - зібрано дані щодо АТФсинтази синьозелених водоростей та написано статтю).

17. Золотарёва Е.К., Терещенко А.Ф., Довбыш Е.Ф., Онойко Е.Б. Влияние спиртов на ингибирование N,N'-дициклогексилкарбодиимидом фотофосфорилирования и электронного транспорта в хлоропластах гороха // Биохимия. - 1997. - Т. 62, № 6. - С. 738-743. (Здобувачем особисто сформульовано завдання роботи, напрацьований план досліджень, проведено досліди і написано статтю).

18. Zolotareva E.K., Dovbysh E.F., Tereshchenko A.F., Onoiko E.B. Synergetic inhibition of photophosphorylation and uncoupled electron transport by N,N'-dicyclohexylcarbodiimide and alcohols in pea chloroplasts // FEBS Lett. - 1997. - Vol. 412, № 2. - P. 375-378. (Здобувачем особисто сформульовано план та завдання досліджень, проведено досліди і написано статтю).

19. Zolotareva E.K., Onoiko E.B., Podorvanov V.V. Effects of adenine nucleotides on the accessibility of the acceptor site of Рhotosystem II // In: Photosynthesis: mechanisms and effects. - G. Garab (ed.). - London: Kluwer Acad. Publ., 1998. - Vol. III. - P. 1747-1750. (Особистий внесок здобувача - розроблений план і сформульована мета дослідження, виконані експерименти, написана стаття).

20. Золотарева Е.К., Подорванов В.В., Терещенко А.Ф. и др. Энергозависимое включение трития в белки светособирающего комплекса хлоропластов ССКІІ // Доп. НАН України. - 1999. - № 11. - С. 152-156. (Особистий внесок здобувача - запропонована ідея дослідження, виконана частина експериментів, оброблені дані, написана стаття).

21. Zolotareva E.K., Onoiko E.B., Podorvanov V.V. Sytnik S.K The effect of microgravity on proton permeability of thylakoid membranes and contribution of II and I photosystems in photosynthetic electron transport in pea chloroplasts // J. Gravitat. Physiol. - 1999. - Vol. 6, № 1. - P. 147-148. (Дисертанту належать ідея дослідження, створення схеми експерименту, обробка результатів та формулювання висновків роботи).

22. Золотарева Е.К., Довбыш Е.Ф., Онойко Е.Б. Сравнительное исследование ингибирования N,N'-дициклогексилкарбодиимидом фотофосфорилирования и светоактивируемого гидролиза АТР в хлоропластах гороха // Укр. біохім. журн. - 2001. - Т. 73, № 5. - С.61-68. (Особистий внесок здобувача - запропонована ідея дослідження, виконана частина експериментів, оброблені дані, написана стаття).

23. Золотарьова О.К., Онойко О.Б., Подорванов В.В. Механiзми регуляцiї вкладу фотосистем II та I у транспорт електронiв в тилакоїдних мембранах хлоропластiв // Фізіологія рослин в Україні на межі тисячоліть. - К.: Видавництво Українського фітосоціологічного центру, 2001. - Т. 1. - С. 87-93. (Особистий внесок здобувача - проаналізовані власні і літературні дані, зроблені висновки, написана стаття).

24. Mikhaylenko N.F., Sytnik S.K., Zolotareva E.K. Effects of slow clinorotation on lipid contents and proton permeability of thylakoid membranes of pea chloroplasts // Adv. Space Res. - 2001. - Vol. 27, № 5. - P. 1007-1010. (Особистий внесок здобувача - виконано дослідження протонної проникності тилакоїдів, написана стаття).

25. Tereshchenko A.F., Podorvanov V.V., Zolotareva E.K. Active transport of inorganic carbon into cells of blue-green algae (Cyanophyta) // Int. J. Algae. - 2002. - Vol. 4, № 4. - P. 29-40. (Особистий внесок здобувача - запропонована ідея дослідження, оброблені дані, написана стаття).

26. Онойко О.Б., Золотарева Е.К. Участие АТФ-синтазы в регуляции распределения световой энергии между ФС II и ФС I // Физиол. и биохим. культ. раст. - 2003. - Т. 35, № 5. - C. 416-421. (Здобувачем особисто сформульовано план та завдання досліджень, проведено досліди і написано статтю).

27. Онойко Е.Б., Золотарева Е.К. Участие пальмитиновой кислоты в регуляции процессов энерготрансформации в хлоропластах // Материалы международной научно-практической конференции “Приемы повышения урожайности растений: от продуктивности фотосинтеза к современным биотехнологиям”. - К.: НАУ, 2003. - С. 12-16. (Здобувачем особисто сформульовано план та завдання досліджень, проведено досліди і написано статтю).

28. Онойко Е.Б., Подорванов В.В., Золотарева Е.К. Роль трансмембранного протонного градиента в регуляции распределения энергии света между фотосистемами II и I в изолированных хлоропластах // Доп. НАН України. - 2004. - № 10. - С. 198-202. (Особистий внесок здобувача - розробка схеми експериментів, написання статті).

29. Подорванов В.В., Золотарева Е.К. Сравнительное исследование буферной емкости хлоропластов различной степени целостности // Физиол. и биохим. культ. раст. - 2004. - Т. 36, № 4. - С. 342-348. (Особистий внесок здобувача - розробка плану і схеми експериментів, обробка даних титрування, написання статті).

30. Zolotareva E.K., Podorvanov V.V. Clinorotation effect on thermodynamic efficiency of energy transformation in chloroplasts of higher plants // J. Gravitat. Physiol. - 2004. - Vol. 11, № 2. - Р. 221-222. (Особистий внесок здобувача - розробка плану експериментів, обробка даних, написання статті).

31. Онойко Е.Б., Золотарева Е.К., Сытник К.М. Регуляция протонной проводимости мембранной части АТР-синтазного комплекса хлоропластов адениннуклеотидами // Доп. НАН України. - 2005. - № 2. - С. 157-162. (Дисертанту належать ідея дослідження протонної провідності мембранної частини АТР-синтази, схема експерименту, обробка результатів та формулювання висновків роботи).

32. Подорванов В.В., Черноштан A.А., Золотарева Е.К. Роль бикарбоната в светозависимом поглощении протонов изолированными хлоропластами // Физиол. и биохим. культ. раст. - 2005. - Т. 37, № 4. - С. 326-332. (Особистий внесок здобувача - складання плану роботи, проведення експериментів, написання статті).

33. Polishchuk A.V., Podorvanov V.V., Zolotareva Е.К. pH-dependent regulation of oxygen evolution in isolated spinach chloroplasts // Актуальні проблеми ботаніки та екології. Збірник наукових праць. Вип. 1. - К.: Фітосоціоцентр, 2005. - С. 254 - 261. (Здобувачеві належить розробка схеми експериментів і написання статті).

34. Topchiy N.M., Sytnik S.K., Syvash O.O., Zolotareva E.K. The effect of additional red irradiation on the photosynthetic apparatus of Pisum sativum // Photosynthetica. - 2005. - Vol. 43, № 3. - P. 451-456. (Дисертанту належать ідея дослідження фотосинтетичних характеристик рослин, сформованих за різних умов освітлення, обговорення результатів, написання статті).

35. Поліщук О.В., Подорванов В.В., Золотарьова О.К. рН-залежна регуляція фотосинтетичного виділення кисню ізольованими хлоропластами шпинату // Доп. НАН України. - 2006. - № 3. - С. 167-172. (Особистий внесок здобувача - розробка схеми експериментів, обробка експериментальних даних, написання статті).

36. Захаров С.Д. Золотарева Е.К., Опанасенко В.К. Зависимость протонной проводимости Н⁺-канала АТФ-синтетазного комплекса от степени протонирования протеолипида // І Всесоюзный биофизический съезд. Тезисы докладов стендовых сообщений. Москва, 1982. - Т. 1. - С. 265.

37. Опанасенко В.К., Макаров А.Д., Золотарева Е.К. Участие сопрягающего фактора CF₁ тилакоидных мембран хлоропластов в регуляции переноса электронов // І Всесоюзный биофизический съезд. Тезисы докладов стендовых сообщений. Москва, 1982. - Т. 1. - С. 255.

38. Золотарева Е.К., Кузьмина В.П., Захаров С.Д. Отражает ли светозависимое включение трития конформационный переход в АТФ-синтетазе? // 16-я конференция ФЕБО, 1984. Тезисы докладов. - С. 289.

39. Золотарева Е.К., Кузьмина В.П., Гаспарян М.Э. Исследование связывания протонов с тилакоидными мембранами методом тритиевого обмена // В cб. “Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена”. Пущино, 1986. - С. 30.

40. Gasparjan M.E., Zolotareva E.K., Yaguzhinsky L.S. The exchange of tightly bound tritium in chloroplast membrane // Abstr. Int. Symposium “Molecular organization of biological structures”. Moscow, June 19-24, 1989. - P. 36.

41. Золотарьова О.К., Довбиш К.П., Онойко О.Б. Кiнетика інгiбування фотофосфорилювання N,N'-дициклогексилкарбодиiмiдом в хлоропластах гороху // I Український бiофізичний з'їзд (Матерiали з'їзду). Київ, 1994. - С. 87-88.

42. Золотарьова О.К., Подорванов В.В. Дослiдження конформацiйной динамiки АТФ-синтетази хлоропластiв методом протон-тритiєвого обмiну // I Український бiофізичний з'їзд (Матерiали з'їзду). - Київ, 1994. - С. 109-110.

43. Золотарева Е.К., Онойко Е.Б., Довбыш Е.Ф. Внутримолекулярное разобщение АТФсинтазы хлоропластов в присутствии дициклогексилкарбодиимида и протонофоров // “Биоэнергетика фотосинтеза” Тезисы международной конференции. - Пущино, 1996. - С. 20.

44. Золотарева Е.К., Подорванов В.В., Рубан А.В. Исследование энергозависимого включения трития в светособирающий комплекс ФС-2 // “Биоэнергетика фотосинтеза” Тезисы международной конференции. Пущино, 1996. - С. 32.

45. Рубан О.В., Подорванов В.В., Терещенко О.Ф., Золотарьова О.К. Вивчення конформаційної динаміки світлозбирального комплексу хлоропластів методом протон-тритієвого обміну // VII Український біохімічний з'ізд. (Тези доповідей). Ч. II. - Київ, 1997. - С. 114-115.

46. Подорванов В.В., Терещенко О.Ф., Золотарьова О.К. Вплив iонiв мiдi Cu (II) та залiза Fe (II) на фотохiмiчнi реакцiї в хлоропластах гороху // I Всеукраїнська наукова конференцiя “Екологiчний стрес i адаптацiя у бiологiчних системах”. - Тернопiль, 1998. - С. 88.

47. Podorvanov V.V., Tereshchenko A.F., Zolotareva E.K. Investigation of conformational dynamics of ATP-synthase by tritium mapping // Book of abstracts of XIth International Congress on Photosynthesis. - Budapest, 1998. - P. 92.

48. Золотарева Е.К., Подорванов В.В., Онойко Е.Б. рН-Зависимая регуляция распределения энергии между фотосистемами I и II в хлоропластах гороха // IV Съезд общества физиологов растений России, Москва, 4-9 октября 1999. Тезисы докл. Т.І. - С. 45.

49. Подорванов В.В., Онойко О.Б., Золотарьова О.К. Роль трансмембранного протонного градієнта в регуляції розподілу енергії світла між фотосистемами в хлоропластах вищих рослин // Матеріали ХІ з'їзду Українського ботанічного товариства. - Харків, 2001. - С. 301-302.

50. Золотарева Е.К., Онойко Е.Б. Участие АТР-синтазы хлоропластов в регуляции распределения световой энергии между ФС II и ФС I // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, № 4б (додаток 2). - С. 164.

51. Золотарева Е.К., Подорванов В.В. Активация Н⁺-АТРсинтазы цианобактерий Nostoc linkia и Oscillatoria formosa // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, № 4б (додаток 2). - С. 157.

52. Zolotareva E.K., Onoiko E.B., Podorvanov V.V. ?pH-dependent regulation of the accessibility of the acceptor site of photosystem II // Programme and abstracts of International Conference “Photosynthesis and crop production” (7-11 October, 2002, Kyiv, Ukraine). - P. 112.

53. Онойко Е.Б., Подорванов В.В., Золотарева Е.К. Трансформация энергии при фотосинтезе в условиях микрогравитации // Материалы V съезда об-ва физиологов растений России. - Пенза, 2003. - С. 60-61.

54. Золотарьова О.К., Подорванов В.В., Чoрноштан O.А. Роль бікарбонату в процесах протонного транспорту в хлоропластах // Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти, Львів, 18-21 серпня, 2004. - С. 152.

55. Onoiko E.B., Podorvanov V.V., Zolotareva E.K. Contribution of photosystem II and photosystem I to ferricyanide photoreduction in pea chloroplasts // Установчий з`їзд Українського товариства клітинної біології, Львів, 25-28 травня 2004. Тези доповідей. - С. 334.

56. Polishchuk O.V., Podorvanov V.V., Zolotаreva E.K. The effect of Cu²⁺ ions on photosynthetic process // Aсta Physiol. Plant. - 2005. - Vol. 27, № 4 suppl. - P. 24.

57. Polishchuk A., Podorvanov V., Zolotаreva E. The light dependent carbon dioxide uptake by isolated (class II) chloroplasts // Международная конференция “Фотосинтез в пост-геномную эру: структура и функции фотосистем” / Под ред. И.И. Проскурякова. - М.: НИА-Природа, 2006. - С. 70.

58. Золотарева Е.К. Эффективность энергопреобразования в тилакоидных мембранах высших растений // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду. - Харків, 2006. - Т. 1. - С. 124-125.

59. Polishchuk A., Podorvanov V., Zolotareva E. pH-dependence of exogenic acceptor by uptake by isolated class (II) chloroplasts // Program and abstracts of International meeting “Photosynthesis in the post-genomic era. II: Structure and function of photosystems”. - Pushchino, 2006. - P. 260.

60. Topchiy N.M., Zolotareva E.K. The threshold of photoinhibition as indicator of stress state of plants // The VIIth International conference “Eco-physiological aspects of plant responses to stress factors” (Cracow, Poland, 19-22 September, 2007). - P. 29.

АНОТАЦІЯ

Золотарьова О.К. Протонна регуляція процесів трансформації енергії в тилакоїдних мембранах. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - Біохімія. - Харківській національній університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2008.

Робота присвячена вивченню протонного спряження фотосинтетичного електронного транспорту і фотофосфорилування. Участь компонентів тилакоїдних мембран у світлозалежному зв'язуванні і перенесенні протонів визначалася за розподілом тритієвої мітки. Показано, що АДФ і фосфат викликають конформаційні зміни каталітичної частини АТФсинтази в темряві, а світлозалежне включення тритієвої мітки у фактор CF₁ відбувається двома функціонально різними шляхами - тим, що веде до фосфорилування, і тим, що не веде до нього. Освітлення викликає зв'язування тритію також з білками світлозбирального комплексу ФСІІ, яке блокується інгібітором протонних каналів ДЦКД.

Показано, що зростання трансмембранного ДрН індукує альтернативний шлях перенесення електронів у ФСІІ безпосередньо на екзогенній акцептор. Проаналізована термодинамічна ефективність фотосинтетичного перетворення енергії.

Отримані докази, що мембранозв'язаний бікарбонат є компонентом буферної системи тилакоїдів, бере участь у процесах трансформації енергії, і його вміст у мембрані контролюється активністю карбоангідрази. Запропонована нова схема спряженості процесів електронного транспорту і фотофосфорилування, яка включає етап переносу протонів від помп, що генерують Н⁺, до АТФсинтази за участю мембранозв'язаного бікарбонату.

Ключові слова: фотосинтез, фотофосфорилування, спряження, фактор спряження CF_1, протон-тритієвий обмін, електронний транспорт, перенесення протонів, протонний градієнт, світлозбиральний комплекс, бікарбонат.

АННОТАЦИЯ

Золотарёва Е.К. Протонная регуляция процессов трансформации энергии в тилакоидных мембранах. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 - Биохимия. - Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2008.

Диссертация посвящена изучению сопряжения электронного транспорта, трансмембранного переноса протонов и фотофосфорилирования при фотосинтезе.

Объектами исследования были хлоропласты класса II, изолированные из 14-дневных листьев гороха (Pisum sativum L.) или 30-40 дневных листьев шпината (Spinaceа oleracea L.) и их белковые компоненты - сопрягающий фактор CF₁ и светособирающий комплекс ФСII (ССКII).

Для выяснения участия компонентов фотосинтезирующих мембран в светозависимом связывании и переносе протонов, а также путей миграции протонов в ходе энерготрансформации предложены новые методические подходы, основанные на исследовании связывания и распределения радиоактивного изотопа водорода - трития. После инкубации изолированных хлоропластов в среде, содержащей ³Н₂О, в течение 14-16 ч в тилакоидах формировалась фракция, ассоциированная с мембраной и не находящаяся в равновесии с водной фазой. Выход трития из мембранного пула резко ускорялся при световой энергизации хлоропластов или при добавлении каналообразующих антибиотиков, при этом было отмечено возрастание содержания тритиевой метки в каталитической части АТФсинтазы (CF₁) и белках светособирающего комплекса. Включение трития в эти белки блокировалось ингибитором протонных каналов дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД).

Данные показали, что перенос трития из мембранного пула в CF₁ происходит различными путями в зависимости от функционального состояния хлоропластов. В отсутствие субстрата фотофосфорилирования (АДФ) энергизация хлоропластов сопровождалась включением трития из водной фазы в CF₁, тогда как в условиях фотофосфорилирования становилось возможным поступление трития из мембранного пула, не включающее стадию выхода метки в водную фазу. Наличие двух различных в функциональном отношении путей переноса протонов - фосфорилирующего и нефосфорилирующего - подтверждено также кинетическими данными и может быть объяснено обнаруженным в работе АДФ, фосфат-индуцируемым конформационным переходом в АТФсинтазе хлоропластов в темноте.

Вопрос о природе групп, участвующих в переносе протонов (трития) по компонентам мембраны, решался в ходе определения функциональной роли мембранносвязанного бикарбоната. Было показано, что светозависимое поглощение протонов изолированными хлоропластами (ДН⁺) стимулируется в присутствии в реакционной среде ионов бикарбоната и подавляется ингибиторами карбоангидразы (КА) - фермента, катализирующего гидратацию и дегидратацию углекислого газа, - ацетазоламидом и этоксизоламидом. Было установлено также, что удаление из среды углекислого газа в присутствии ингибиторов КА приводит к резкому падению количества протон-акцепторных групп в тилакоидах и подавлению фотофосфорилирования. В то же время, величина ДpH не зависела ни от концентрации бикарбоната, ни от присутствия ингибиторов карбоангидразы. Сделан вывод, что прочно связанный бикарбонат является компонентом буферной системы тилакоидов, принимает участие в процессах энергозависимого связывания протонов, и его содержание в мембране контролируется активностью КА.

Таким образом, в работе на основании экспериментальных данных предложена новая схема сопряжения процессов электронного транспорта и фотофосфорилирования, включающая этап латерального переноса протонов от генерирующих помп к АТФсинтазе с участием мембранносвязанного бикарбоната.

Получены данные, свидетельствующие в пользу того, что в условиях возрастания величины трансмембранного протонного градиента в состоянии 4 тилакоидов на уровне фотосистемы II (ФСII) индуцируется альтернативный путь переноса электронов непосредственно на экзогенный акцептор. Результаты позволили предположить, что при высоком значении ДрН ингибируется окисление пластохинола и, как следствие, линейный перенос электронов между фотосистемами, что приводит к электронному “пробою” ФСII и возникновению альтернативного пути переноса электронов, который защищает ФСII от перевозбуждения.

Определены условия специфического блокирования ДЦКД протонного канала АТФсинтазы и показано, что в присутствии спиртов ДЦКД ингибирует не только синтез АТФ, но и разобщенный перенос электронов вследствие алкилирования функциональных групп переносчиков электрон-транспортной цепи, катализируемого ДЦКД. С помощью аппарата линейной термодинамики неравновесных процессов проанализированы механизмы, вызывающие потерю эффективности фотосинтетического преобразования энергии.

Ключевые слова: фотосинтез, фотофосфорилирование, сопряжение, сопрягающий фактор CF_1, протон-тритиевый обмен, транспорт электронов, перенос протонов, протонный градиент, светособирающий комплекс, бикарбонат.

SUMMARY

Zolotareva E.K. Proton regulation of energy transformation processes in thylakoid membranes. - Manuscript.

Dissertation for the doctor of biological science degree in speciality 03.00.04 - Biochemistry. - V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, 2008.

The dissertation deals with the investigation of proton coupling of photosynthetic electron transport and photophosphorylation. Participation of the components of thylakoid membranes in the light-dependent proton binding and translocation was determined by tritium label distribution. It was shown that ADP and phosphate induced conformational change of the catalytic part of ATPsynthase in the dark and the tritium label incorporated into CF₁ in the light by two functionally distinct pathways. Illumination caused the binding of tritium also by the proteins of the light-harvesting complex of PSII, which was blocked by DCCD, the inhibitor of proton channels.

It was shown that the increase in transmembrane ДрН induces in PSII the alternative electron transfer directly on exogenous electron acceptor. Thermodynamic efficiency of energy transformation in chloroplasts was analyzed.

It was concluded that carbonic anhydrase activity controls the content of tightly bound bicarbonate in thylakoid membranes which is a component of a buffer system of thylakoids and participates in the processes of energy transformation. The new scheme of the coupling of electron transport and photophosphorylation processes, which includes the stage of proton transfer from Н⁺-generating pumps to ATPsynthase with the participation of membrane bound bicarbonate was proposed.

Key words: photosynthesis, photophosphorylation, coupling, coupling factor CF_1, proton-tritium exchange, electron transport, proton transfer, transmembrane proton gradient, light-harvesting complex, bicarbonate.

Размещено на Allbest.ru