Агрегація клітин в онтогенезі спороутворюючих мікроорганізмів

Рентгеноспектральний аналіз іонного складу бактеріальних клітин у різні фази розвитку періодичної культури

Дослідження вмісту окремих елементів в клітинах спороутворюючих бактерій на різних фазах розвитку періодичної культури здійснювали за допомогою рентгеноспектрального аналізатора в комплексі РЕМ-РМА, де РЕМ - растровий електронний мікроскоп фірми YEOL YSM 845, а РМА - система Link Analytical M-2000. Спектри якісного хімічного складу об'єкта дослідження реєстрували в двох точках: в скупченні однорідних клітин (метод “площі”) і в поодинокій клітині (метод “точки”). Про вміст окремих елементів судили на основі порівняння відношення висоти піків, які відповідають числу одиниць імпульсів, генерованих пучком електронів, що попадають на детектор рентгенівського випромінювання з даного зразка дослідження.

Встановлено, що в процесі періодичного культивування В. cereus 24, B.mesentericus AB-56, B.megaterium H вміст хімічних елементів суттєво змінювався в залежності від фази їх розвитку. Так, у фазі проростання спор досліджуваних видів бактерій відбувалася значна втрата клітинами катіонів кальцію (табл. 6), хлору, фосфору.

Таблиця 6 Зміна вмісту кальцію в окремих клітинах В. mesentericus АБ-56 у процесі розвитку періодичної макрокультури від спори до спори через фазу агрегації вегетативних клітин

В експоненціальній фазі розвитку В. cereus 24 відзначено зниження показників вмісту натрію та інтенсивне поглинання бактеріальними клітинами катіонів калію (рис.8) фосфору та кисню, які необхідні для підтримання обмінних, окислювально-відновлювальних процесів та утворення енергетичних сполук. Вказані тенденції змін спектрів вмісту даних елементів в експоненціальній фазі розвитку спостерігали і при дослідженні інших штамів спороутворюючих бактерій.

Процес агрегації вегетативних клітин спороутворюючих бактерій В. cereus 24 супроводжувався підвищенням показників вмісту фосфору (рис.9) калію, хлору, сірки, що беруть участь у синтетичних та енергетичних процесах клітин. Такі закономірності змін спектрів вмісту названих елементів спостерігали і при дослідженні періодичних культур В. megaterium H та B.mesentericus AB-56. У фазі спороутворення періодичної культури бактерій роду Bacillus відзначено зниження спектрів вмісту калію, сірки та значного підвищення показників вмісту кальцію, натрію та хлору. Тенденція інтенсивного накопичення катіонів кальцію на етапі спороутворення простежувалася на прикладі всіх досліджених представників бактерій із роду Bacillus. Встановлений факт підтверджував важливе значення катіонів кальцію у формуванні високої резистентності спорових форм бактерій та в підтриманні стану анабіозу.

Таким чином, завдяки застосуванню сучасного високочутливого методу рентгеноспектрального мікроаналізу вдалось встановити суттєві зміни хімічного складу спороутворюючих бактерій на різних фазах розвитку періодичної культури. Характерним було і те, що коливання рівнів певних іонів для одних видів мали схожі показники, а для інших - індивідуальні. Найбільше співпадання динаміки змін іонного складу було характерне для фази агрегації бактеріальних клітин.

Управління розвитком спороутворюючих мікроорганізмів

У зв'язку з тим, що після агрегації бактеріальні клітини періодичної культури приступають до якісно нового етапу розвитку - спороутворення, важливим було, на наш погляд, дослідити такі взаємовідношення між клітинами, які мають регуляторні функції. Простіше кажучи, як впливають одні клітини на інших, який результат цих впливів на подальший розвиток та диференціацію клітин.

Для цього нами була розроблена мікробіологічна модель для дослідження впливу одних клітин на інші, суть якої полягала в тому, що окремі бактеріальні клітини, будучи певним чином іммобілізовані на блоках камери для мікрокультивування бактерій, ізольовані від контакту з іншими клітинами популяції, яка вводиться в міжблочний простір камери і, таким чином знаходиться в їх безпосередньому оточенні. В такій системі взаємодія між одиничними ізольова-ними бактеріями та гомологічною культурою певної фази розвитку могла здійснюватись завдяки екзогенним факторам, які виділяються клітинами культури в середовище.

Принципова схема цієї серії експериментів полягала в тому, що ізольовані в камері спори пророщували в поживному середовищі, доводячи їх до різних стадій розвитку клітин, - активації, ініціації, набухання, елонгації, утворення первинної вегетативної клітини та її поділу. На різних стадіях розвитку ізольованих клітин здійснювали заміну поживного середовища (умовно - індуктор вегетації) в камері на гомологічну культуру (умовно - індуктор споруляції), що знаходилася в фазі максимальної агрегації клітин та переходу до споруляції.

В результаті, на різних видах бацил було встановлено, що гомологічна культура у фазі агрегації (індуктор споруляції) зупиняє вегетацію ізольованих клітин і підпорядковує їх диференціацію в такому напрямку, в якому відбувається її розвиток, тобто в напрямку активної споруляції. Характер життєвого циклу “від спори до спори” визначався конкретною стадією проростання первинної спори, під час якої відбувалася заміна “сигнала” вегетації на “сигнал” споруляції. Сприймаючи “сигнал” гомологічної культури, досліджувані клітини, в залежності від стадії проростання, в якій вони перебували на час введення індуктора споруляції, продовжували свій розвиток або по типу мікроциклу (від спори до спори, без поділу первинної вегетативної клітини), або за типом макроциклу з різною інтенсивністю розмноження первинних вегетативних клітин та їх подальшим спороутворенням.

Таким чином, в результаті досліджень на різних видах спороутворюючих мікроорганізмів було встановлено, що бактеріальна культура у фазі агрегації, підпорядковує диференціацію інших клітин саме в такому напрямку, в якому відбувається її розвиток. Найбільше вірогідно, що факторами регуляції розвитком в даному випадку виступають розчинні полімери, а саме: специфічні (як було показано вище для цієї фази глікопротеїди з ММ 41,0 та 33,5 кДа). В таких умовах напрямок розвитку бактеріальної клітини та його результат буде залежати від того, на якій стадії її онтогенезу подавати “сигнал” на диференціацію. Проведені дослідження показали також і те, що в циклі розвитку бактеріальної клітини існують певні стадії, коли її геном здатний чи не здатний сприймати “сигнали” на вегетацію або на споруляцію. Такі стадії нами були визначені, завдяки чому стало можливим управляти розвитком бактеріальної клітини в тому чи іншому напрямку. І ще одна важлива, на наш погляд, закономірність, яка стосується гетерогенності властивостей бактеріальних клітин. Так, в умовах регулюємого розвитку характерним для мікроорганізмів є синхронність у відповіді на регулюючі “сигнали”, а значить і синхронність в подальшому розвитку. І навпаки, якщо популяція мікроорганізмів залишається без зовнішніх втручань, то процеси розвитку в ній характеризуються виключною асинхронністю та гетерогенністю. Вершина гетерогенності властивостей бактерій щодо їх розвитку, проявляється в тому, що процеси вегетації та спороутворення в мікропопуляціях клітин, які знаходяться в абсолютно однакових умовах, можуть здійснюватися одночасно.

В роботі вирішено актуальну наукову проблему - визначені закономірності розвитку спороутворюючих мікроорганізмів роду Bacillus, встановлена здатність різних їх видів утворювати клітинні агрегати, в яких відбувається диференціація бактерій, визначені фазові зміни властивостей досліджуваних мікроорганізмів на клітинному та популяційному рівнях, показане значення певних мікробних біополімерів у становленні та формуванні міжклітинних зв'язків, з'ясовані періоди компетентності до сприймання регуляторних факторів в онтогенезі бактеріальної клітини, що дало можливість спрямовано впливати та змінювати стадії розвитку і диференціації клітин у певному напрямку.

Встановлено, що в процесі розвитку різних видів бактерій роду Bacillus вегетативні форми здатні об'єднуватися у багатоклітинні агрегати. В оптимальних для споруляції умовах розвиток періодичної культури спороутворюючих бактерій складається з наступних послідовних фаз: проростання спор, утворення первинних вегетативних клітин, експоненціального їх розмноження, початку агрегації, максимальної агрегації, споруляції агрегованих клітин, дозрівання спор в агрегатах, лізису параспоральних частин спорангіїв, дезагрегації спор, анабіозу бактеріальної популяції.

Виявлена динаміка зміни сил міжклітинних взаємодій від початку агрегації до її повного завершення та наступної дезагрегації клітин. Процес формування агрегатів характеризується послідовною зміною сил міжклітинної взаємодії: спочатку вони зростають, досягають максимуму, потім зменшуються і повністю зникають. Існує зв'язок між зростанням сил міжклітинної взаємодії та утворенням специфічних для цієї фази розвитку білків поверхневих шарів клітинних стінок (молекулярна маса 70,0-72,0 кДа).

Визначена морфологія бактеріальних клітин та їх взаєморозташування на всіх етапах агрегації. Електронно-мікроскопічними дослідженнями встановлено, що агрегація вегетативних клітин виникає в результаті щільного контакту їх боковими поверхнями (по поздовжній осі) з наступним злиттям поверхневих шарів клітинних стінок. Між бактеріями по завершенні спороутворення в складі агрегату та лізису параспоральних частин спорангіїв втрачаються попередні зв'язки та наступає дезагрегація клітин. Взаєморозташування бактеріальних клітин пов'язано з тим, що після поділу між ними зберігаються або зникають міжклітинні зв'язки поверхневими шарами клітинних стінок.

Показано важливе значення мікробних екзогенних біополімерів у розвитку процесів клітинної диференціації. На початкових етапах агрегації бактеріальні клітини синтезують специфічні для даної фази розчинні біополімери, а культура саме у цій фазі розвитку індукує спорогенез у інших вегетуючих клітин. На підставі біохімічних та електрофоретичних досліджень встановлено, що вказані біополімери мають глікопротеїдну природу з молекулярною масою 41,0 та 33,5 кДа.

Доведено, що агрегація бактеріальних клітин - закономірний процес, який має важливе значення у розвитку бактеріальної популяції. Агрегація бактеріальних клітин розглядається як найбільш ранній еволюційний механізм формування міжклітинної взаємодії. Агрегація забезпечує найкращу компетентність бактеріальних клітин для реалізації міжклітинних взаємодій, їх захист в складі агрегатів від зовнішніх впливів і створює умови для диференціації клітин та індукції спорогенезу.

Вперше одержані дані про зміну вмісту хімічних елементів на різних фазах розвитку мікробної клітини. Методом рентгеноспектрального мікроаналізу хімічного складу бактерій роду Bacillus встановлено, що вміст калію, натрію, кальцію, хлору, сірки, фосфору та кисню суттєво змінюється в окремих клітинах на різних фазах розвитку періодичної культури. Під час проростання спор відбувається втрата клітинами більшості елементів, утворення агрегатів вегетативних клітин супроводжується накопиченням калію, хлору, сірки та фосфору, що беруть участь у синтетичних та енергетичних процесах клітин.

Вперше експериментально встановлено, що бактеріальні спори при зберіганні в лабораторних умовах протягом більше 25 років не втрачають життєздатність та характерні для кожного виду мікроорганізмів властивості. Клітини періодичної культури, що розвиваються із спор після довготривалого зберігання, здатні до агрегації. В процесі довготривалого анабіозу зростає асинхронність проростання спор та виростання первинних вегетативних клітин. Час генерації при цьому не змінюється.

Вперше об'єктивно доведено, що в бактеріальних популяціях процеси вегетації та споруляції можуть відбуватися одночасно. На всіх етапах розвитку бактеріальної популяції встановлена гетерогенність властивостей окремих її особин: спори проростають, а первинні вегетативні клітини утворюються асинхронно, процеси вегетації та спороутворення відбуваються одночасно в однакових умовах середовища, в популяції клітин в стані спокою завжди існують поодинокі вегетативні форми, здатні до криптичного росту. Гетерогенність розвитку, як еволюційно сформована і генетично детермінована властивість, має важливе значення для виживання бактерій у природних умовах існування.

Створена мікробіологічна модель для дослідження регуляторних механізмів розвитку окремих бактеріальних клітин, використання якої дозволило встановити наступні закономірності: явище агрегації клітин різних видів умовно патогенних спороутворюючих бактерій; можливість спорогенезу під впливом індукторів споруляції в умовах середовища, де без них відбувається вегетація; визначені фази в онтогенезі бактеріальної клітини, коли вона сприймає або не сприймає зовнішні регуляторні сигнали, що дало можливість змінювати стадії її розвитку в певному напрямку; одержані дані, що підтверджують гіпотезу існування у бактерій материнської клітини.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Встановлені закономірності розвитку спороутворюючих бактерій роду Bacillus доцільно враховувати в мікробіологічній промисловості при створенні лікувальних, діагностичних та профілактичних препаратів, одержанні біологічно активних речовин, пробіотиків, біомаси спорових форм мікроорганізмів.

Запропоновані методи мікрокультивування бактерій можуть бути застосовані з діагностичною метою та прискореного визначення чутливості мікроорганізмів до антимікробних препаратів.

СПИСОК ОСНОВНИХ РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Періодичні фахові видання, затверджені ВАК України (*-особистий внесок здобувача)

1. Завальнюк А.К. Гашинский В.В., Войцеховский В.Г. Покой и активация как самые ранние этапы превращения споры в вегетативную клетку // Актуальные проблемы медицины и биологии. - Киев. -1986. - Т. 2. - С. 43-52. (* вивчено особливості спорових форм різних видів бацил на ранніх етапах їх проростання, підготовлено роботу до публікації).

2. Войцеховский В.Г., Завальнюк А.К. Морфология микробных клеток в процессе спорообразования // Научно-технический прогресс в медицине и биологии. - Киев. - 1987. - Т. II. - С. 188-195. (* вивчено особливості морфології клітин різних видів аеробних спороутворюючих бактерій в процесі спороутворення, підготовлено роботу до публікації).

3. Войцеховский В.Г., Завальнюк А.К. Инициация и вырастание спор как завершающие процессы ранних этапов развития спорообразующей культуры // Научно-технический прогресс в медицине и биологии. - Киев. - 1987. - Т. II. - С. 218-227. (* вивчено особливості ініціації та виростання спор у різних видів бацил, підготовлено роботу до публікації).

4. Войцеховский В.Г., Завальнюк А.К. Условия, определяющие спорообразование бактерий // Научно-технический прогресс в медицине и биологии. - Киев. - 1987. - Т. II. - С. 228-232. (* вивчено умови культивування та їх вплив на спороутворення, підготовлено роботу до публікації).

5. Войцеховский В.Г., Завальнюк А.К. Ауторегуляция спорогенеза // Научно-технический прогресс в медицине и биологии. - Киев. - 1987. - Т. II. - С. 233-238. (* вивчено вплив факторів мікробного походження на спороутворення у різних видів бацил, оформлено роботу).

6. Широбоков В.П., Тишко О.Г., Войцеховський В.Г., Завальнюк А.К. Про деякі умови відтворення агрегативного стану мікробних клітин в процесі росту і розвитку мікроорганізмів // Актуальные проблемы медицины и биологии. - Киев. - 1993. - Т. II. -С.3-10. (* досліджено умови, при яких відбувається агрегація вегетативних клітин, підготовлено роботу до публікації).

7. Широбоков В.П., Войцеховський В.Г., Завальнюк А.К., Тишко О.Г. Закономірності агрегації бактерій // Мікробіол.журн. - 1994. - Т. 56, № 4. - С. 53. (* визначено закономірності агрегації вегетативних клітин спороутворюючих бактерій, підготовлено роботу до публікації).

8. Войцеховський В.Г. Пошук оптимальних умов електронно-мікроскопічного дослідження агрегації бактерій // Актуальные проблемы медицины и биологии. - Киев. - 2000. - №1. - С. 246-254.

9. Войцеховський В.Г. Зміна міцності міжклітинних зв'язків у різних фазах розвитку бактеріальної популяції // Ліки України. - 2000. - №5. - С.57-58.

10. Войцеховський В.Г. Електронно-мікроскопічне дослідження агрегатів бактерій // Бюл. Інституту сільськогосподарської мікробіології. - Чернігів. - 2000. - №7. - С.60-62.

11. Войцеховський В.Г. Формування агрегатів клітин під час розвитку та диференціації бактерій // Зб. наук. праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. - Київ. - 2000. - Вип.9, №2. - С. 780-786.

12. Войцеховський В.Г. Дослідження зміни рН середовища в процесі агрегації та дезагрегації спороутворюючих бактерій // Вісник проблем біології і медицини. - Харків. - 2001. - №2. - С.108-110.

13. Войцеховський В.Г. Дослідження ймовірності формування штучних агрегатів бактерій в процесі виготовлення препаратів для растрової електронної мікроскопії // Актуальные проблемы медицины и биологии. - Киев. - 2000. - №2. - С. 109-125.

14. Войцеховський В.Г. Фази розвитку періодичної культури, обумовлені агрегацією бактерій // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т. 16, № 5. - С.430-435.

15. Войцеховський В.Г. Агрегати бактерій періодичної культури та їх стійкість до антимікробних речовин // Вісник Вінницького держ. мед. університету. - 2000. - № 2. - С. 278-279.

16. Войцеховський В.Г. Рентген-спектральний аналіз складу бактеріальних клітин на різних фазах розвитку періодичної культури // Ліки України. - 2001. - № 4. - С. 51-53.

17. Войцеховський В.Г. Агрегація вегетативних клітин в процесі розвитку періодичної культури // Зб. наук. праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. - Київ. - 2001. - Вип.10, № 1. - С. 687-695.

18. Войцеховський В.Г. Споруляція в агрегатах вегетативних клітин, як самостійний етап розвитку періодичної культури бактерій // Зб. наук. праць співробітників КМАПО ім. П.Л.Шупика. - Київ. - 2001. - Вип.10, № 3. - С. 1230-1238.

19. Войцеховський В.Г. Розвиток спороутворюючих бактерій в залежності від умов культивування //Актуальные проблемы медицины и биологии. - Киев. - 2001. - № 2. - С. 99-110.

20. Войцеховський В.Г. Управління розвитком мікрокультур спороутвоюючих бактерій під впливом факторів агрегації //Актуальные проблемы медицины и биологии. - Киев. - 2001. - №2. - С.157-172.

21. Широбоков В.П., Михальський Л.О., Фуртат І.М., Войцеховський В.Г. Електрофоретичні дослідження біополімерів спороутворюючих бактерій на різних стадіях їх розвитку // Актуальные проблемы медицины и биологии. - Киев. - 2002. - № 1. - С.122-128. (* проведено культивування мікроорганізмів, одержано зразки мікробних клітин і культуральної рідини для біохімічних та електрофоретичних досліджень, підготовлено роботу до публікації).

22. Войцеховський В.Г. Обмін кальцію та фосфору в клітинах спороутворюючих бактерій в процесі розвитку періодичної культури // Актуальные проблемы медицины и биологии. - Киев. - 2002. - №2. - С.338-344.

23. Войцеховський В.Г. Міжклітинні взаємодії у бактерій в процесі їх розвитку // Гігієна населених міст. - Київ, 2003. - Вип. 42. - С. 506-509.

24. Широбоков В.П., Войцеховський В.Г. Агрегація бактерій як один із механізмів міжклітинної взаємодії прокаріот // Журнал академії медичних наук України. - 2003. - Т.9, № 3. - С. 542-548. (* проведено всі дослідження та підготовлено роботу до публікації).

Патенти

1. Способ приготовления плотной питательной среды для культивирования микроорганизмов. А.с. 1654332 СССР, МКИ С N 1/20 / В.В.Гашинский, В.П.Широбоков, Н.Н.Марченко, В.Г.Войцеховский, Т.И.Крайнюкова, В.В.Онищенко (СССР).- № 4182247/13; Заявлено 30.01.87; Опубл. 07.06.91, Бюл. № 21. - 4 с. (*досліджено культуральні властивості бактерій при рості на поживному середовищі, проаналізовано та описано результати).

2. Способ получения плотной питательной среды для культивирования микроорганизмов. А.с. 1837059 СССР, МКИ С 08 F 220/56, C 12 N 1/00 / В.В.Гашинский, В.П.Широбоков, Н.Н.Марченко, В.Г.Войцеховский, Т.И.Крайнюкова, В.В.Онищенко (СССР). - № 4278310/05; Заявлено 25.06.87; Опубл. 30.08.93, Бюл. № 32. - 6 с. (*досліджено культуральні властивості бактерій при рості на поживному середовищі, проаналізовано та описано результати).

3. Пат. 2007242 Испания, МКИ С 08 F 220/56, CI 2 N 1/100. Un metodo de obtencion del medio nutritivo denso para el cultivo de microorganismos: Пат. 2007242 Испания, МКИ С 08 F 220/56, CI 2 N 1/100. - N 8801978 / V.V.Gashinsky, V.P.Shirobokov, N.N.Marchenko, V.G.Voitsekhovsky, T.I.Krainjukova, V.V.Onischenko (СССР); Заявл.24.06.88; Опубл. 01.07.89. - 10 с. (*досліджено культуральні властивості бактерій при рості на поживному середовищі, проаналізовано та описано результати).

4. Пат. 239260 Аргентина, МКИ С12 N 1/00 . Un metodo de obtencion del medio nutritivo denso para el cultivo de microorganismos: Пат. 239260 Аргентина, МКИ С12N 1/00 / V.V.Gashinsky, V.P.Shirobokov, N.N.Marchenko, V.G.Voitsekhovsky, T.I.Krainjukova, V.V.Onischenko (СССР). - № 311446; Заявл.18.07.88; Опубл. 31.07.89. - 8 с. (*досліджено культуральні властивості бактерій при рості на поживному середовищі, проаналізовано та описано результати).

5. Пат. 13063 Уругвай. Un metodo de obtencion del medio nutritivo denso para el cultivo de microorganismos: Пат. 13063 Уругвай / V.V.Gashinsky, V.P.Shirobokov, N.N.Marchenko, V.G.Voitsekhovsky, T.I.Krainjukova, V.V.Onischenko (СССР); Опубл. 14.03.90. - 8 с. (*досліджено культуральні властивості бактерій при рості на поживному середовищі, проаналізовано та описано результати).

6. Пат. 4939150 США, МКИ С12N 1/20. Method for preparing dense nutrient medium for culturing microorganisms: Пат. 4939150 США, МКИ С12N 1/20 / V.V.Gashinsky, V.P.Shirobokov, N.N.Marchenko, V.G.Voitsekhovsky, T.I.Krainjukova, V.V.Onischenko (СССР). - № 283950; Заявл.07.01.88; Опубл. 03.07.90. - 6 с. (*досліджено культуральні властивості бактерій при рості на поживному середовищі, проаналізовано та описано результати).

7. Пат. 1295569 Канада, МКИ C08F-220/56; C08F-267/10; C12N-1/00. Method for preparing dense nutrient medium for culturing microorganisms: Пат. 1295569 Канада, МКИ C08F-220/56; C08F-267/10; C12N-1/00 / V.V.Gashinsky, V.P.Shirobokov, N.N.Marchenko, V.G.Voitsekhovsky, T.I.Krainjukova, V.V.Onischenko (СССР). - № 569565; Заявл. 15.06.88; Опубл. 11.02.92. (*досліджено культуральні властивості бактерій при рості на поживному середовищі, проаналізовано та описано результати).

Інші наукові видання

1. Войцеховский В.Г. Особенности развития периодической культуры спорообразующих микроорганизмов // Тез. докл. IV Респ. конференции молодых ученых-медиков. - Донецк. - 1983. -С. 192-193.

2. Войцеховский В.Г, Завальнюк А.К., Гашинский В.В., Авдеева Л.В. Новые возможности исследования состояния иммунитета при кишечных инфекциях // Тез. докл. VI Всес. конф. по клинической биохимии, морфологии и иммунологии инфекционных болезней. - Рига. - 1983. - С. 45.

3. Войцеховский В.Г. Развитие периодической культуры условно-патогенных спорообразующих бактерий // Материалы IХ Всесоюзной. конф. “Гигиеническое изучение биологического загрязнения окружающей среды”. - Москва. - 1983. - С.32.

4. Войцеховский В.Г. Особенности развития спорообразующих бактерий в микрокультурах // Материалы Х итог. научн. конф. молодых ученых и специалистов Киевского медицинского института. - Киев. - 1984. - С.9.

5. Войцеховский В.Г., Гашинский В.В. Исследования развития микропопуляций бактерий // Достижения микробиологии - практике: Тезисы VII Всес. съезда микробиол. общества. - Алма-Ата: Наука. - 1985. - Т. 6. - С. 37.

6. Войцеховский В.Г. Применение сред с синтетическим отвердителем для культивирования возбудителя пищевой токсикоинфекции Bacillus cereus // Тез.докл. XI Укр. респ. съезда микробиол., эпидемиол. и паразитол. - Киев. - 1985. - С. 124.

7. Войцеховский В.Г., Авдеева Л.В., Бернасовская Е.П., Лукач И.Г. Ускоренное определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в камерах для микрокультивирования клеток // Всесоюз. семинар “Вопросы антибактериальной терапии инфекционных осложнений в неинфекционной клинике”. - Москва. - 1987. - С.23.

8. Широбоков В.П., Гашинский В.В., Войцеховский В.Г., Крайнюкова Т.И., Марченко Н.Н., Пимченко В.П. Пластагаровые питательные среды для культивирования микроорганизмов и перспектива их использования // Tез. конф. “Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии”. - Махачкала. - 1988. - С.48.

9. Гашинский В.В., Широбоков В.П., Войцеховский В.Г., Крайнюкова Т.И., Марченко Н.Н., Лукач И.Г., Авдеева Л.В., Пимченко В.П. Применение пластагаровых питательных сред для диагностики заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами // Тез. докл. II Всесоюзн. конф. “Акт. вопр. клинической микробиологии в неинфекционной клинике”. - Барнаул. - 1988. - С.105-106.

10. Гашинский В.В., Войцеховский В.Г., Марченко Н.Н., Крайнюкова Т.И. Применение пластагара в медицине // Tез. докл. I городской научно-практич. конф. изобретателей и рационализаторов “Изобретательство и рационализация на современном этапе развития медицины ”. - Киев. - 1988. - Ч.1. - С. 90.

11. Войцеховский В.Г. Применение метода микрокультивирования бактерий для определения их чувствительности к фитонцидам // Tез. II областной межинститутской конф. молодых ученых ”Микробиология, иммунология, биотехнология - практике здравоохранения”. - Харьков. - 1989. - С.35.

12. Гашинский В.В., Войцеховский В.Г., Крайнюкова Т.И., Марченко Н.Н., Онищенко В.В. Использование пластагара для контроля качества питательных субстратов // Тез. докл. VII съезда Укр. микробиол. общества. - Киев-Черновцы. - 1989. - Ч.2. - С. 83.

13. Гашинский В.В., Войцеховский В.Г., Крайнюкова Т.И., Фаль М.М., Фурман А.А., Марченко Н.Н. Применение синтетических наполнителей для конструирования плотных питательных сред // Тез. докл. VII съезда Укр. микробиол. общества. - Киев-Черновцы. - 1989. - Ч.2. - С.82-83.

14. Войцеховський В.Г. Агрегація бактерій в періодичній культурі // Тез. доп. “XII Український з'їзд мікробіологів, епідеміологів і паразитологів”. - Харків. - 1991 . - Т. 1. - С.112.

15. Гашинский В.В., Войцеховский В.Г., Лукач И.Г., Авдеева Л.В., Марченко Н.Н., Костенко С.И., Долина В.Л. Ускоренное определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам // Материалы межвед. симпоз. “Пластагар, проблемы, перспективы использования в медицине и биологии”. - Киев. - 1992. - С.19-20.

16. Лукач И.Г., Авдеева Л.В., Войцеховский В.Г., Завальнюк А.К., Долина В.Л. Метод контроля эффективности антибиотикотерапии // Междунар. конф. по проблемам медицины катастроф. - Киев. - 1992. - Т. II. - С.181.

17. Широбоков В.П., Войцеховський В.Г. Дослідження механізму агрегації бактерій // Материалы междунар. научн. конф., посв. 150-летию со дня рожд. И.И. Мечникова “Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания”. - Харьков. - 1995. - С.58-59.

18. Войцеховський В.Г. Динаміка формування агрегатів вегетативних клітин в процесі розвитку макрокультури // Актуальні питання медичної мікробіології та вірусології. - Київ. - 1998. - С.24-27.

19. Войцеховський В.Г. Нові фази розвитку культури, що проходить стадію агрегації клітин // Актуальні питання медичної мікробіології та вірусології. - Київ. - 1998. - С.27-32.

АНОТАЦІЯ

Войцеховський В.Г. Агрегація клітин в онтогенезі спороутворюючих мікроорганізмів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, Київ, 2004.

В дисертації представлені результати дослідження міжклітинних взаємодій в процесі розвитку та диференціації спороутворюючих бактерій роду Bacillus. Встановлено здатність різних видів бацил на певній фазі розвитку періодичної культури утворювати багатоклітинні агрегати, в яких відбувається диференціація клітин. Досліджено властивоті бактеріальних клітин, що об'єднані в агрегати, а саме: електронно-мікроскопічна структура, сили міжклітинної взаємодії, іонний склад, полімери поверхневих шарів клітинних стінок, екзогенні розчинні полімери.

Встановлено, що агрегація бактерій - закономірний процес, який забеспечує найкращу компетентність для реалізації міжклітинних взаємодій і створює умови для диференціації мікроорганізмів та індукції спорогенезу.

Ключові слова: агрегація, розвиток, диференціація, міжклітинні взаємодії, бактерії, спори, спороутворення, періодична культура.

Войцеховский В.Г. Агрегация клеток в онтогенезе спорообразующих микроорганизмов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца, Киев, 2004.

В диссертации изложены результаты исследований межклеточных взаимоотношений, которые возникают в процессе развития спорообразующих бактерий рода Bacillus в периодической культуре. Установлена общая для различных видов бацилл (B.cereus, B.subtilis, B.mesentericus, B.megaterium) закономерность, заключающаяся в том, что на определенной фазе их развития вегетативные формы образуют многоклеточные агрегаты, в которых происходит дифференциация бактерий, завершающаяся образованием покоящихся форм. Описаны условия, при которых проявляется феномен агрегации, представлена характеристика динамики формирования и распада клеточных агрегатов.

Показано, что в процессе образования агрегатов силы межклеточного взаимодействия постепенно увеличиваются, достигают максимума, а затем уменьшаются и полностью исчезают. Существует взаимосвязь между увеличением силы межклеточного взаимодействия и образованием специфических для фазы агрегации белков поверхностных слоев клеточных стенок (молекулярная масса 70,0-72,0 кДа). Электронно-микроскопическими исследованиями установлено, что агрегация вегетативных клеток возникает в результате их плотного контакта боковыми поверхностями с последующим слиянием поверхностных слоев клеточных стенок. После завершения спорообразования и лизиса параспоральных частей спорангиев между бактериями, находящимися в составе агрегатов, утрачиваются прежние связи и наступает разрушение агрегатов. Показано также, что взаиморасположение бактерий связано с тем, что после деления между ними могут сохраняться или исчезать межклеточные связи, обусловленные поверхностными слоями клеточных стенок.

В результате изучения бактериальных экзогенных биополимеров установлено, что на начальных этапах агрегации клетки синтезируют специфические растворимые биополимеры, а бактериальная культура именно в этой фазе развития индуцирует спорогенез у вегетативных форм. На основании биохимических и електрофоретических исследований показано, что эти биополимеры имеют гликопротеидную природу с молекулярной массой 41,0 и 33,5 кДа и специфичны для фазы агрегации бактерий. Применение бактериальной культуры в фазе агрегации в качестве фактора, регулирующего развитие микробных клеток, дало возможность экспериментально изменять стадии их онтогенеза в определенном направлении.

При исследовании содержания химических элементов методом рентгеноспектрального анализа у бактерий рода Bacillus установлено, что содержание калия, натрия, кальция, хлора, серы, фосфора и кислорода существенно изменяется на различных фазах развития периодической культуры. Во время прорастания спор происходит потеря клетками большинства элементов, а образование агрегатов вегетативных форм сопровождается накоплением калия, хлора, серы и фосфора, которые принимают участие в синтетических и энергетических процессах в клетках.

Всестороннее изучение феномена агрегации бактерий показало, что это закономерный процесс, имеющий важное значение в развитии микробной популяции. Агрегация у бактерий рассматривается как наиболее ранний эволюционный механизм формирования межклеточных взаимодействий. Агрегация обеспечивает наилучшую компетентность бактериальных клеток для реализации межклеточных взаимодействий, их защиту в составе агрегатов от внешних влияний и создает условия для дифференциации клеток и индукции спорогенеза.

Ключевые слова: агрегация, развитие, дифференциация, межклеточные взаимодействия, бактерии, споры, спорообразование, периодическая культура.

Voitsechovskiy V.G. Cells aggregation in the ontogenesis of sporeforming of microorganisms . - The manuscript.

The dissertation for a doctor's degree in medicine, speciality 03.00.07 - microbiology. - Bogomolets National medical university, Kyiv, 2004.

The disertation presens the results of research of extracellular interactions in a proses of sporeform Bacillus development and differentiation. There has been established the ability kinds of bacilli to form multicellular aggregates on certain phase of periodical culture development. There have been investigated such properties of forming aggregates bacterial cells as: electron-microscopic structure, intercellular interaction powers, ion composition, polymers and exogenic solubile polymers.

The bacterial agregation has been established to be the natural process which provides the best competence for cellular realizations realization and makes the conditions for microorganisms differentiation and sporogenesis induction.

Key wоrds: aggrigation, development, differentiation, intercellular interactions, bacterias, spores, sporification, periodical culture.

Размещено на Allbest.ru