Вплив стафілококового білка А та його різних форм на імунну відповідь

Під час презентації антигена макрофагами Т-хелпери-1 в присутності ІЛ-1, останні починають продукувати ІЛ-2. Окрім того, одночасно під впливом ІЛ-1 на Т-лімфоцитах починає експресуватись рецептор до ІЛ-2. Таким чином, створюються умови для проліферації лімфоцитів і дозрівання клону специфічних активованих клітин [Дранник Г.М., 1999;Ройт А. и соавт., 2000]. ІЛ-2 є основним ростовим фактором Т-лімфоцитів, що приймає участь у формуванні ефекторних клітин імунної відповіді. ІЛ-2 забезпечує активацію

Таблиця 1 - Вплив різних антигенів стафілокока на продукцію інтерлейкіну-1 у мишей

Примітки.

1. *р 0,01, розраховано відносно контролю; n = 5-6 в кожній групі.

2. КЗБА - клітинно-зв'язаний білок А, КАС - корпускулярний антиген стафілокока, БА - білок А,

КХЧ - короткохвильове електромагнітне опромінення мм-діапазону.

Таблиця 2 - Модифікація продукції інтерлейкіну-2 різними формами білка А стафілокока

Примітка: *р0,05, ** р0,01, розраховано відносно контролю; n=5-7 в кожній групі.

та проліферацію Т-лімфоцитів, частково В-лімфоцитів, продукцію ними імуноглобулінів, синтез цитокінів, -ІФН. Виявлено радіопротективні властивості ІЛ-2 [Ярилин А.А., 1999; Бережная Н.М. и соавт., 2000].

ФНП, який продукується в основному макрофагами, є важливим регулятором запальної реакції як форми імунної відповіді та вагомим фактором природної резистентності організму [Вершигора А.Е., 1990;. Ярилин А.А., 1997; Бережная Н.М., 1999]. В світлі цього варто відмітити стимуляцію продукції білком А ендогенного ФНП (табл. 3), адже, наприклад, при терапії злоякісних новоутворень за допомогою ФНП мають місце значні негативні побічні ефекти, пов'язані з коротким періодом деградації препарату та необхідністю застосування великих його доз. Більше того, кількість ФНП, індукованого КЗБА, виявилась дуже великою (активність перевищувала 160 ОД/мл).

Таблиця 3 - Зміни рівня фактора некрозу пухлин в сироватці крові мишей лінії СВА під впливом різних форм білка А*

Примітка: *р0,001, розраховано відносно контролю; n=7-9 в кожній групі.

Отже, як свідчать результати проведених нами експериментів, різні форми БА активують продукцію регуляторних цитокінів: інтерлейкінів 1 і 2 і викликають значну стимуляцію утворення фактора некрозу пухлин in vitro, дані цитокіни є важливими факторами регуляції, підтримки балансу росту та визначення шляхів розвитку імунокомпетентних клітин, що, в свою чергу, регулює імунний гомеостаз та апоптоз клітин, формування протипухлинного захисту, регенерацію лімфопоезу та формування імунної відповіді.

Дослідження впливу різних форм білка А на функціональну активність клітин системи імунітету

Використовуючи для імунізації різні форми БА, спостерігали статистично достовірне зростання титрів специфічних антитіл при імунізації наступними антигенами стафілокока: клітинно-зв'язаним білком А, та білком А, сорбованим силікагелем чи модифікованим опроміненням електромагнітними хвилями мм діапазону (КЗБА, БА КХЧ, КЗБА КХЧ, БА СГ, КАС Cowan-1 КХЧ), що свідчить про посилення імуногенних властивостей білка А в цих формах. Враховуючи викладене, найоптимальнішими для посилення антигенності та простішими у приготуванні, на наш погляд, є клітинно-зв'язаний білок А та БА КХЧ.

Білок А утворював лінію преципітації з нормальною кролячою сироваткою (НКС) та сироваткою кролів, імунізованих Staphylococus aureus Wood-46. При взаємодії білка А з сироваткою кролів, імунізованих Staphylococcus aureus Cowan-1 (ІКС), утворювались дві лінії преципітації, що підтверджує антигенні властивості БА. Білок А, НКС та ІКС до Staph. aureus Cowan-1 при взаємодії утворювали "зірку". При використанні ІКС до Staph. aureus Wood-46, який не містить білок А, подібного явища не спостерігали. Це свідчить про здатність білка А модифікувати імунну відповідь завдяки здатності антигенспецифічно взаємодіяти з Fab фрагментами антитіл та, окрім цього, взаємодіяти з Fc фрагментами антитіл будь-якої специфічності.

Отже, білок А має антигенні детермінанти, які неспецифічно реагують з нормальними IgG і специфічно з імунними, але слід відмітити, що встановлення цього факту все ще не є достатнім для пояснення значення білка А у формуванні протективного антистафілококового імунітету.

На підставі даних по впливу білка А на В-систему імунітету, порівняльної оцінки дії антигенів стафілокока, що відрізняються за вмістом білка А, на Т-залежну гуморальну імунну відповідь, встановлено імуномодулюючу дію білка А. Показано, що введення антигенів стафілокока сприяє появі в селезінці мишей активованих лімфоцитів, які прямо чи опосередковано (через Т-хелпери) впливають на синтез антитіл класів IgM та IgG до Т-залежного антигену.

Проліферація клітин імунної системи є основою формування імунної відповіді як гуморального, так і клітинного типу. Досліджували вплив БА на проліферативну активність лімфоцитів декількох видів тварин і ліній мишей, безтимусних мишей nude.

Білок А володіє мітогенною активністю по відношенню до Т- і В-лімфоцитів та не впливає на синтез ДНК тимоцитами. Білок А проявляє Т-залежні мітогенні властивості при дії на лімфоцити селезінки безтимусних мишей nude (табл. 4). На мітогенну дію білка А не впливає неспецифічна взаємодія з імуноглобулінами сироватки крові. Мітогенний ефект білка А дозозалежний і пов'язаний з продукцією цитокінів та активацією проліферації стовбурових клітин.

Протипроменева дія препаратів білка А стафілокока

Відомо, що багато речовин з імуномодулюючими властивостями володіють також і протипроменевими ефектами та успішно застосовуються для імунореабілітації [Ковальський О.В. та співавт., 1993; Комиссаренко С.В. и соавт., 1994; Ярилин А.А., 1997]. Важливою також є стимуляція антиінфекційної резистентності за умов радіаційно індукованого імунодефіцитного стану [Андрущенко В.И. и соавт., 1996; Савцова З.Д., 1996]. Тому ведеться пошук таких речовин, які б поряд з імуномодулюючими мали б і протипроменеві властивості, а також могли б забезпечити як загальне відновлення імунореактивності, так і стимуляцію специфічного антиінфекційного імунітету. Ефективним засобом підвищення радіорезистентності організму в цілому та лімфоїдної системи зокрема може бути імуностимуляція. Встановлено, що антигенна та

мітогенна стимуляція суттєво модифікує чутливість лімфоцитів до опромінення. Запуск імунологічних реакцій супроводжується проліферацією лімфоцитів та в цілому підвищенням радіостійкості даних клітин у період максимальної експресії імунної відповіді.

Під впливом білка А відбувається стимуляція проліферації лімфоцитів щурів, опромінених в межах доз 0,5 та 1 Гр (потужність дози 0,5 Гр/хв), що може свідчити про його протипроменеву дію.

Таблиця 4- Мітогенний ефект антигенів стафілокока, В- та Т-мітогенів на В -лімфоцити селезінки безтимусних мишей nude

Примітка: * - вірогідна відмінність піддослідних та контрольних груп при р0,05.

Білок А та клітиннозв'язаний білок А сприяли стимуляції проліферації спленоцитів щурів, тотально опромінених невисокими дозами радіації. Індекси стимуляції залежали від часу введення антигену після опромінення. Під впливом пептидоглікану золотистого стафілокока спостерігалась стимуляція проліферації В-лімфоцитів, а білок А активував як В-, так і Т- лімфоцити, що поряд з впливом на продукцію цитокінів, неспецифічні фактори резистентності сприяє відновленню В- і Т- систем імунітету у опромінених тварин. Одержані дані свідчать про антипроменеву дію досліджуваних препаратів та підтверджуються результатами експериментів по стимуляції проліферації гемопоетичних стовбурових клітин та регенерації еритропоезу, кооперативної взаємодії Т- і В-лімфоцитів в селезінці опромінених тварин, продукції цитокінів, впливом на неспецифічні фактори резистентності організму.

Вплив білка А на функціональну активність клітин системи неспецифічної резистентності

Важливою ланкою в елімінації збудника та індукції імунної відповіді є клітини фагоцитарної системи - макрофаги і моноцити. Вони елімінують чужорідні антигени за допомогою ферментативних систем і генерації активних метаболітів кисню, здійснюють свою функцію без участі антигенспецифічних імунних механізмів, але можуть ініціювати і специфічну імунну відповідь, представляючи антиген лімфоцитам. В той же час, багато мікроорганізмів продукують фактори, які зменшують чутливість до бактерицидних систем фагоцитів, ускладнюючи їх розпізнавання та ін.

Виявлено відмінності у фагоцитарній активності макрофагів, отриманих від тварин, імунізованих корпускулами стафілокока та різними формами білка А. При імунізації мишей очищеним, клітинно-зв'язаним білком А та антигенами, що були оброблені електромагнітними хвилями, спостерігали стимуляцію фагоцитарної активності макрофагів по відношенню до різних об'єктів фагоцитозу ([⁵¹Cr]-мічених еритроцитів барана, [³H]-тимідин-мічених корпускул стафілокока), порівняно з відповідним контролем.

Природні кіллери розпізнають та елімінують різні клітини-мішені, виявляють регулюючий вплив на процеси гемо- та лімфопоезу [Семененя И.Н., 1991]. Є дані про позитивну роль природних кіллерних клітин (ПКК) у знищенні бактерій та паразитів [Покровский В.И и соавт., 1999]. ФНП, ІЛ-1, ІЛ-2, -ІФН модулюють активність ПКК. Поряд з цим ряд бактеріальних антигенів також можуть підсилювати функцію ПКК [Возианов А.Ф., Бутенко А.К. и соавт., 1998]. Так, інтраперитонеальне введення мишам БЦЖ підвищує їх цитотоксичну активність. Оцінка функціональної активності природних кіллерів при дії антигенних субстанцій стафілокока дозволила встановити ( табл. 5), що БА стафілокока здатен модулювати кіллерну активнічть ПКК периферійної крові мишей. У порівнянні з пептидогліканом, який переважно пригнічував цитотоксичну дію, розчинний та клітинно-зв'язаний білок А, навпаки, підвищували рівень цитотоксичності ПКК.

Таблиця 5 - Вплив розчинного білка А стафілокока на природну кіллерну активність клітин периферійної крові мишей

Примітка: * - статистично значимі відмінності між середніми показниками у контрольних та піддослідних тварин (р0,01). Число тварин в кожній дослідній групі дорівнює 5-6.

Гістоморфологічні зміни в лімфоїдних органах тварин, імунізованих антигенами стафілокока

Основними органами імунної системи, які відіграють значну роль в індукції імунної відповіді є селезінка та тимус. Важлива роль в акумуляції імунокомпетентних клітин в процесі розвитку антиінфекційного імунітету належить також лімфатичним вузлам.

В даній роботі представлені матеріали досліджень гістоморфологічних змін в лімфоїдних органах тварин, імунізованих антигенами стафілокока. В селезінках тварин, імунізованих корпускулярним антигеном стафілокока (КАС), спостерігалось значне збільшення кількості макрофагів та багатоядерних клітин, що свідчить про підсилення фагоцитарної активності та надмірну функціональну напругу захисних властивостей макрофагальної системи (рис. 2(а)). При імунізації білком А виявлено зміни, що свідчать про підсилення функції ретикуло-гістеоцитарної системи селезінки без порушення структури її білої та червоної пульп (рис. 2(б)). В тимусі тварин дослідної групи відмічено значне розширення коркового та мозкового шару, зменшення кількості тимоцитів, функціональну напругу тілець Гассаля, які, як відомо, беруть участь у продукції тимічних факторів (рис. 2(в)). В лімфатичних вузлах імунізованих тварин кількість лімфоцитів паракортикального та мозкового шарів також була збільшеною, а в кортикальному шарі - зменшена. Оскільки паракортикальний шар відноситься до Т-залежної зони, то це може свідчити про збільшення кількості Т-лімфоцитів при даному антигенному впливі (рис. 2(г)). Отже, мають місце добре виражені відмінності в гістоморфологічній структурі центральних та периферичних органів імунної системи у імунізованих антигенами стафілокока тварин.

Перебіг експериментальної стафілококової інфекції у мишей під впливом стафілококового білка А

В ході проведених досліджень по впливу препаратів очищеного і клітинно-зв'язаного білка А на перебіг експериментальної стафілококовій інфекції та деякі показники імунного статусу організму дослідних мишей, зокрема на функціональну активність перитонеальних макрофагів і ПКК селезінки, персистенцію збудника в нирках тварин, а також на рівень ІФН та ФНП в сироватці крові, встановлено, що досліджувані препарати мають значну імунорегулюючу та протекторну дію. Профілактичне застосування названих препаратів забезпечувало значне (4-кратне) підвищення вмісту ІФН в сироватці крові (рис. 3) та дозозалежне зростання рівня ФНП (рис. 4).

Важливою ланкою неспецифічної резистентності організму є система мононуклеарних фагоцитів. Її функціонування залежить від багатьох факторів, в тому числі і від продукції ІФН та ФНП (Ершов Ф.И., 1996; Esepchuk Y.V. et al., 1996).

Рис. 3. Зміни рівня ІФН в сироватці крові мишей лінії СВА при стафілококовій інфекції під впливом препаратів білка А Staphylococcus aureus.

Рис. 4. Вплив препаратів білка А на рівень ФНП в сироватці крові мишей лінії СВА при стафілококовій інфекції. Вводили на тварину: здорові тварини (1); 0,15 М розчин NaCl (2); клітинно-зв'язаний білок А (100 мкг) (3), (10 мкг) (4); очищений білок А (100 мкг) (5), (10 мкг) (6).

Результати визначення функціональної активності перитонеальних макрофагів хемілюмінесцентним методом дозволили констатувати їх пригнічення під час розвитку стафілококової інфекції, особливо на 1 добу, що узгоджується з даними інших авторів [Лазаренко Л.Н., Спивак Н.Я. и соавт., 1992]. Під впливом БА спостерігали підсилення функціональної активності перитонеальних макрофагів (табл. 6). Виявлено існування кореляції між ступенем активації макрофагів і вмістом ІФН в сироватці крові хворих тварин з експериментальною стафілококовою інфекцією: зниження рівня ІФН на 3-5 добу супроводжувалось зниженням активності макрофагів (МФ) і, навпаки, його підвищення на 1-3 добу співпадало з посиленням виділення активних форм кисню макрофагами.

Таблиця 6 - Вплив препаратів білка А на функціональну активність макрофагів перитонеального ексудату мишей лінії СВА при стафілококовій інфекції (за даними люмінолзалежної хемілюмінесценції)

Примітка: *p0,05, n=4.

Білок А модифікує фагоцитарну активність МФ. Стимуляція їх бактерицидної активності на 1 добу розвитку стафілококової інфекції може бути зумовлена стимуляцією фагоцитозу при безпосередній взаємодії білка А з МФ [Вихоть Н.Е., 1981]. Для препарату КЗБА спостерігалась подібна до БА динаміка впливу на МФ мишей при експериментальній стафілококовій інфекції. На 5 добу розвитку інфекції не відбувалось пригнічення бактерицидної активності МФ, що узгоджується з даними літератури [Ефремова В.И., Шкурат О.Е. и соавт., 1982]. Важливо, що білок А забезпечує імуностимуляторну дію в перші 5-7 днів після інфікування. Більш тривалу активацію процесів фагоцитозу при застосуванні препарату КЗБА можна пояснити наявністю в його складі компонентів клітинної стінки стафілокока, зокрема пептидоглікана.

Результати дослідження природної кіллерної активності (ПКА) лімфоїдних клітин селезінки мишей при стафілококовій інфекції за умов профілактичного застосування БА і КЗБА свідчать про її посилення на 3 добу розвитку інфекційного процесу (табл. 7).

Таблиця 7 - Зміни кіллерної активності лімфоцитів селезінки мишей лінії СВА при стафілококовій інфекції під впливом препаратів білка А

Примітка: *p0,05, n=4.

Для з'ясування протекторних властивостей досліджуваних антигенів аналізували персистенцію збудника в організмі мишей лінії СВА, яким з профілактичною метою вводили препарати БА, що призводило до зниження персистенції збудника (табл. 8).

Таблиця 8 - Вплив препаратів білка А на персистенцію збудника при стафілококовій інфекції у мишей лінії СВА

Примітка:*р0,05, n=4.

Таким чином, одержані результати свідчать про те, що препарати білка А впливають на перебіг стафілококової інфекції та володіють протекторними властивостями.

Вплив білка А на клітинну імунну відповідь. Індукція та імунологічні властивості фактора переносу клітинної імунної реактивності, специфічного до різних форм білка А

Під впливом досліджуваних антигенів стафілокока спостерігаються зміни імунної реактивності імунокомпетентних клітин, які виявляються як in vitro, так і in vivo. Так, після імунізації білком А в різних формах у тварин формується стан гіперчутливості сповільненого типу до антигенів стафілокока.

Механізм гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ) є одним з базових в процесі розвитку клітинної імунної відповіді [Пол У., 1987; Ройт А., 1999]. ГСТ визначає зміни у функціональній активності популяцій імунокомпетентних клітин, що призводять до істотних змін в імунній реактивності організму до певних антигенів [Медуницын Н.В. и соавт., 1980, 1999]. З урахуванням цього нами проведено вивчення стану ГСТ до білка А та його різних форм на декількох видах тварин. Одноразова сенсибілізація тварин білком А та клітинно-зв'язаним білком А призводила до розвитку стану ГСТ, який виявлявся за допомогою шкірних проб і корелював зі стимуляцією продукції міграцію інгібуючого фактора (МІФ) спленоцитами сенсибілізованих тварин. Нами проаналізовані популяції лімфоцитів, що індукують продукцію МІФ, під впливом різних форм білка А. Встановлено, що розвиток стану ГСТ до стафілококових антигенів можна модифікувати при використанні для імунізації білка А, опроміненого електромагнітними хвилями мм-діапазону, та застосуванні в якості ад'ювантного засобу силікагелю. Введенням тваринам циклоспорину А також можна змінювати розвиток реакції ГСТ до досліджуваних стафілококових антигенів, впливаючи на Tхелпери-1 і продукцію ІЛ-2. Останнє не виключає суперантигенних властивостей білка А. Виявлено, що клітинна імунна відповідь до стафілокока ефективно стимулюється БА та КЗБА.

Багато інфекційних агентів за допомогою різних пристосувань супресують клітинну ланку імунної відповіді [Endo N. et al., 1997; Мац А.Н. и соавт., 1998] і в цьому випадку стимуляція клітинно-опосередкованого імунітету по відношенню до антигенів збудника сприяє відновленню специфічної імунної реактивності. В наших дослідженнях було виявлено, що БА в різних формах індукує стан ГСТ, який відображає високу ступінь імунної реактивності до даного антигену. Стан ГСТ до БА також можна відтворити за допомогою адаптивного переносу, але в цьому випадку виникає проблема гістосумісності лімфоцитів донора та тканин реципієнта. Одним із шляхів вирішення цієї проблеми є використання фактора переносу імунної реактивності, який забезпечує безклітинний перенос ГСТ від сенсибілізованого організму до інтактного [Kirkpatrick C.H., 1994; Fudenberg H.H., Pizza G., 1994]. З цією метою з лейкоцитів імунізованих тварин, які знаходились в стані ГСТ до різних форм білка А, одержано специфічний фактор переносу клітинної імунної реактивності, за допомогою якого експериментальним тваринам було успішно перенесено стан ГСТ до БА. Це є одним з перспективних засобів антигенспецифічної імуномодуляції.

Фармакологічні властивості різних форм білка А та індукованого фактора переносу до антигенів стафілокока

Нами була проведена оцінка фармакологічних властивостей використаних в роботі препаратів. Досліджено мутагенні властивості препаратів білка А та КЗБА (рис. 5, рис. 6) та індукованих ними препаратів ФП, їх алергенність, токсичність, пірогенність. Не виявлено ніяких негативних побічних ефектів. На протязі часу спостереження у тварин не відзначали запальних та алергічних реакцій, падіння маси тіла, зміни реактивності (p0,01 між дослідними та контрольною групами).

Рис. 5. Визначення мутагенної дії білка А в тесті Еймса по кількості ревертантних колоній Salmonella typhymurium, штам ТА-100 (в умовах метаболічної активації та без неї).

Примітки: 1 - спонтанний рівень ревертантів, 2-5 - білок А в концентраціях: 100 мкг/мл (2), 10 мкг/мл (3), 1 мкг/мл (4) - без мутагену, та 100 мкг/мл - з додаванням мутагену (5*), (6*) - позитивний контроль (з мутагеном).

Рис. 6. Визначення мутагенної дії клітинно-зв'язаного білка А в тесті Еймса по кількості ревертантних колоній Salmonella typhymurium, штам ТА-100 (в умовах метаболічної активації та без неї).

Примітки: 1 - спонтанний рівень ревертантів, 2-5 - клітинно-зв'язаний білок А в концентраціях: 100 мкг/мл (2), 10 мкг/мл (3), 1 мкг/мл (4) - без мутагену, та 100 мкг/мл - з додаванням мутагену (5*), (6*) - позитивний контроль (з мутагеном).

Отже, одержані результати вказують на імунорегулюючий вплив досліджуваних препаратів різних форм білка А і дозволяють охарактеризувати основні механізми індукції імунної відповіді до отриманих антигенних субстанцій стафілокока.

Враховуючи протективну дію препаратів очищеного та клітинно-зв'язаного білка А при експериментальній стафілококовій інфекції, їх можна рекомендувати для імунізації і створення превентивного протистафілококового імунітету. Також можна рекомендувати і інший шлях стимуляції клітинної імунної реактивності по відношенню до стафілококових антигенів - за допомогою специфічного фактора переносу, що може знайти своє застосування у вирішенні проблеми розробки методів ефективної стимуляції пригніченого протистафілококового імунітету та пошуку препаратів, здатних переносити/стимулювати специфічний імунітет швидко та ефективно, минаючи стадію вакцинації.

Висновки

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає у визначенні ефектів впливу стафілококового білка А та його різних форм на основні етапи становлення та розвитку імунної відповіді, формування імунологічної пам'яті, у з'ясуванні основних механізмів імуномодулюючої дії, впливі досліджуваних антигенів на функціональну активність окремих популяцій імунокомпетентних клітин, системи неспецифічної резистентності, можливості індукції продукції цитокінів, у визначенні протекторних властивостей, а також показаних напрямках їх практичного застосування.

Досліджено ряд факторів, які впливають на продукцію та активність білка А стафілокока, його патогенність. Встановлено, що склад поживного середовища суттєво позначається на продукції білка А. Серед досліджених факторів електромагнітне випромінювання мм-діапазону змінює чутливість стафілококів до антибіотиків, модифікує продукцію та активність білка А, що впливає на антигенність та формування імунної відповіді до нього. Індуковані опроміненням зміни не пов'язані з модифікацією гену spa, що підтверджується результатами полімеразної ланцюгової реакції.

Білок А стафілокока в різних формах модифікує функціональну активність клітин імунної системи, опосередковуючи її як специфічною, так і неспецифічною взаємодією з імуноглобулінами, модулюючи окремі етапи розвитку імунної відповіді до Т-залежного антигену. Імуностимулююча дія різнопланова, проявляється вже на рівні процесів міграції стовбурових кровотворних клітин, активації Т- і В-клітин і їх взаємодії.

Білок А здатен незворотньо вмонтовуватися та формувати іон-провідникові структури в штучних біліпідних мембранах, стимулювати транспорт Ca²⁺ через потенціалзалежні канали плазматичної мембрани клітин, що можна розглядати як ранні молекулярні механізми активації лімфоїдних клітин під впливом білка А.

Вплив досліджуваних антигенів стафілокока починається вже на рівні стовбурових клітин, про що свідчить стимуляція утворення гемопоетичних осередків в селезінці опромінених мишей незалежно від лінії (СВА, BALB/c, (CBAxC57BL/6)F₁), починаючи з 1 доби після дії опромінення (5,5 - 8,5 Гр) та прискорення регенерації еритропоезу, досягаючи рівня інтактних тварин по включенню [⁵⁹Fe] на 7 добу після сублетального опромінення мишей (лінії B6AF₁, (CBAC57BL/6)F₁, (C57BL/6ASn/F₁)).

Білок А в різних формах є ефективним мітогеном по відношенню до Т- та В-лімфоцитів мишей, морських свинок і щурів як in vitro, так і in vivo. Мітогенний ефект залежить від присутності Т- і В-клітин. Білок А проявляє Т-залежні мітогенні властивості при дії на лімфоцити селезінки безтимусних мишей nude. На мітогенну дію різних форм білка А не впливає неспецифічна взаємодія з імуноглобулінами сироватки крові. Мітогенний ефект дозозалежний, пов'язаний з продукцією цитокінів та активацією проліферації стовбурових клітин.

Різні форми білка А активують продукцію регуляторних цитокінів: інтерлейкінів 1 і 2, інтерферону, викликають значну стимуляцію утворення фактора некрозу пухлин in vitro та in vivo. Такі процеси є важливими факторами регуляції підтримки балансу росту та визначення шляху розвитку клітин, що має значення для регуляції імунного гомеостазу, формування протипухлинного захисту, регенерації лімфопоезу та становлення імунної відповіді.

Виявлено імуномодулюючі властивості очищеного та клітинно-зв'язаного білка А відносно Т- і В-лімфоцитів. Дані субстанції модифікують гуморальну імунну відповідь, стимулюючи синтез IgM та IgG до Т-залежного антигену, впливаючи на Т-хелпери та кооперацію лімфоцитів.

Використані форми білка А стафілокока стимулюють продукцію неспецифічних факторів резистентності організму. У інтактних, імунних тварин та при експериментальній стафілококовій інфекції очищений та клітинно-зв'язаний білок А стимулює фагоцитарну та бактерицидну активність макрофагів і лейкоцитів по відношенню до різних об'єктів фагоцитозу, активує природні кіллерні клітини селезінки та периферійної крові мишей, утворення фактора некрозу пухлин та інтерферону.

Стафілококовий білок А, та в більшій мірі клітинно-зв'язаний білок А, проявляють протективні властивості при експериментальній стафілококовій інфекції за профілактичною схемою застосування (після одноразової імунізації), знижуючи персистенцію збудника.

Білок А, впливаючи на стимуляцію проліферації стовбурових клітин, регенерацію еритропоезу, кооперативну взаємодію Т- і В-лімфоцитів, продукцію цитокінів, мітогенну дію як Т-, так і В-лімфоцитів, неспецифічні фактори резистентності організму, протекторні властивості, сприяє відновленню імунної реактивності організму і виживаності опромінених тварин, що свідчить на користь його протипроменевої дії.

Білок А та його різні форми індукують клітинну імунну відповідь, що підтверджується тестами in vivo та in vitro. В тимусі, селезінці та лімфатичних вузлах імунізованих тварин спостерігаються гістоморфологічні зміни, що свідчать про активацію Т- і В-зон та макрофагів, і пов'язані з розвитком клітинної імунної відповіді до антигенів стафілокока.

Клітинний імунітет до антигенів стафілокока переноситься за допомогою індукованого до білка А та клітинно-зв'язаного білка А фактора переносу клітинної імунної реактивності. Досліджувані антигени білка А та індуковані ними препарати фактора переносу не виявили мутагенної дії. Встановлено відсутність токсичності, пірогенності та алергенності названих препаратів. Препарати фактора переносу, одержані з лейкоцитів донорів, не містять антигенів збудників гепатиту В і С, ВІЛ та сифілісу.

Проведені вперше комплексні експериментальні дослідження імунної відповіді та імуномодулюючої дії різних форм білка А стафілококів та індукованого ними фактора переносу клітинної імунноі реактивності, ефективність антигенспецифічного імунітету та відсутність побічних реакцій на досліджувані препарати дозволяють рекомендувати їх для застосування в якості протистафілококових препаратів для імунізації, здатних ефективно індукувати чи швидко, минаючи вакцинацію, переносити специфічний імунітет.

білок стафілокок імунний тварина

Список опублікованих праць

Холодная Л.С., Хоробрых В.В. Индукция гиперчувствительности замедленного типа белком А и корпускулярными антигенами стафилококка // Иммунология. - 1984. - № 3. - C. 51-54.

Хоробрых В.В., Холодная Л.С. Миграция клеток селезенки, сенсибилизированных антигенами стафилококка // Иммунология. - 1984. - № 3. - C. 54-56.

Хоробрых В.В., Санин А.В., Холодная Л.С. Влияние S. aureus на образование кроветворных колоний и регенерацию эритропоэза у мышей после облучения // Биологические науки. - 1984. - № 8. - C. 44-47.

Хоробрых В.В., Прохоров В.Я., Позур В.К., Холодная Л.С., Симонова А.В., Толовская К.Р. Влияние клеток и компонентов S. aureus на функциональную активность гемопоэтических клеток мышей // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. - 1984. - № 9. - C. 85-90.

Хоробрых В.В., Снигерева А.Е., Акатов А.К., Прохоров В.Я., Позур В.К., Холодная Л.С. Митогенная активность антигенов, выделенных из разных штаммов золотистого стафилококка, в отношении спленоцитов мышей и морских свинок // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. - 1986. - № 7. - C. 67-73.

Вершигора А.Е., Холодная Л.С. Иммунобиологические свойства белка А стафилококка // Успехи современной биологии. - 1986. - Т. 101, вып. 3. - С. 449-461.

Холодная Л.С., Давыдовская Т.Л. Действие белка А и токсина стафилококка на мембранные процессы клеток гладких мышц // Мікробіол. журн. - 1994. - Т. 56, № 4. - C.100-101.

Холодная Л.С., Гордиенко В.М., Любченко Т.А. Морфофункциональная характеристика лимфоидных органов мышей после иммунизации антигенами стафилококка // Вестник проблем современной медицины. Харьковский государственный медицинский университет. - 1995. - С. 46-49.

Афонін С.Е., Давидовська Т.Л., Шатурський О.Я., Шуба М.Ф., Холодна Л.С. Вивчення мембранної активності білка А стафілокока на бімолекулярних ліпідних мембранах // Вісник Київського університету. - 1996. - вип. 3-4. - C. 30-36.

Голева О.Г., Любченко Т.А., Холодна Л.С., Вершигора А.Ю. Одержання Фактора переносу гіперчутливості сповільненого типу морських свинок до антигенних субстанцій Staphylococcus aureus // Фізіол. журн. - 1996. - Т. 42, № 5-6. - C. 58-66.

Филипов И.Б., Шуба М.Ф., Давыдовская Т.Л., Холодная Л.С., Позур В.К., Любченко Т.А. Влияние активных субстанций золотистого стафилококка (белка А и пептидогликана) на сокращения гладких мышц, вызванные действием нейромедиаторов //Нейрофизиология.-1996. - Т. 28, № 1. - C. 30-35.

Любченко Т.А., Холодная Л.С., Вершигора А.Е. Иммуномодулирующие свойства фактора переноса при онкологических заболеваниях//Иммунология. - 1997. - № 6 .- C. 48-51.

Холодна Л.С., Позур В.К., Любченко Т.А., Гриценко Л.М., Голева О.Г., Кучеренко М.Є. Синтез ДНК в лімфоцитах опромінених тварин під впливом мітогенів та антигенів стафілокока // Укр. біохім. журн. - 1998. - Т. 70, № 1. - C. 58-62.

Любченко Т.А., Голева О.Г., Холодна Л.С., Степанчук В.А., Вершигора А.Ю. Людський специфічний фактор переносу до антигенів Staphylococcus aureus // Фізіол. журн. - 1997. - Т. 43, № 3-4. - C. 25-32.

Любченко Т.А., Голева О.Г., Холодна Л.С., Смірнов В.В., Вершигора А.Ю. Біологічна активність фактора переносу, індукованого бактеріальними антигенами // Мікробіол. журн. - 1997. - Т. 59, № 5. - C. 83-100.

Любченко Т.А., Голева О.Г., Холодна Л.С. Фактор переносу як модулятор клітинної імунної відповіді // Биополимеры и клетка. - 1997. - Т. 13, № 5. - C. 345-351.

Любченко Т.А., Голева О.Г., Холодна Л.С. Продукція інтерлейкіну-1 під впливом фактора переносу// Вісник Київського університету - 1998. - вип. 28. - С. 69-70.

Холодна Л.С. Основний фактор патогенності стафілокока - білок А. І. Продукція та властивості// Биополимеры и клетка. - 1999. - Т. 15, № 4. - C. 275-279.

Голева О.Г., Пастер І.П., Любченко Т.А., Холодна Л.С., Пастер Є.У., Доніч С.Ф., Гродзінський Д.М. Модифікація активності лімфоцитів ксенотрасплантацією тканини щитовидної залози та фактором переносу імунної реактивності за умов радіаційноіндукованого гіпотиреозу //Доповіді НАН України. - 1999. - № 10. - С. 156-160.

Холодна Л.С. Основний фактор патогенності стафілокока - білок А. ІІ. Особливості взаємодії з імуноглобулінами // Биополимеры и клетка. - 1999. - Т. 15, № 5. - С. 360-366.

Холодна Л.С., Голева О.Г., Любченко Т.А., Кучеренко М.Є. Мітогенна дія антигенних субстанцій стафілокока на лімфоцити опромінених щурів лінії Вістар // Укр. біохім. журн. - 1999. - Т. 71, № 5. - С. 65-68.

Холодна Л.С., Коржик Н.П., Голева О.Г., Любченко Т.А., Голєв Г.В. Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків // Клінічна хірургія. - 1999. - № 8. - С. 25-27.

Давидовская Т.Л., Мирошниченко Н.С., Фадеенко Н.П., Давидовская Н.В., Холодная Л.С., Любченко Т.А., Голева Е.Г. Специфический фактор переноса к антигенам Staphylococcus aureus влияет на активацию сокращения гладкомышечных клеток толстого кишечника // Биополимеры и клетка. - 1999. - Т. 15, № 5. - С. 402-408.

Холодна Л.С. Синтез та фізико-хімічна характеристика поверхневого соматичного антигену стафілококів - білка А // Вісник Київського університету. - 2000. - вип. 29. - С. 62-64.

Голева О.Г., Пастер І.П., Любченко Т.А., Пастер Є.У., Холодна Л.С., Замотаєва Г.А., Гродзінський Д.М. Фактор переносу імунної реактивності як модулятор функціональної активності лімфоцитів щурів з радіаційноіндукованим гіпотиреозом після ксенотрансплантації органної культури щитовидної залози новонароджених поросят // Фізіол. журн. - 2000. - Т. 46, № 4. - С. 58-65.

Холодна Л.С., Любченко Т.А., Голева О.Г., Михальський Л.О. Очищення препаратів фактора переносу імунної сенсибілізації до антигенів стафілокока // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т. 16, № 5. - С. 335-339.

Голева О.Г., Любченко Т.А., Холодна Л.С. Імуномодулююча дія препаратів Фактору переноса різного походження // Вісник Київського університету. - 2000. - вип. 31. - С. 56-59.

Холодна Л.С., Гордієнко В.М., Гарматіна С.М., Пазюк Л.М., Дзержинський М.Е., Любченко Т.А. Гістологічні зміни в лімфоїдних органах тварин, імунізованих антигенами стафілокока // Доповіді НАН України. - 2000. - № 8. - С. 171-175.

Позур В.К., Федорчук А.Г., Самойленко Л.А., Холодна Л.С., Скивка Л.М., Грищенко Л.М. Протипухлинна активність природних кіллерів під впливом пептидоглікану і білка А стафілокока // Вісник Київського університету. - 2000. - вип. 31. - С. 65-67.

Lyubchenko T.A., Smirnov V.V., Goleva E.G., Kholodna L.S. Purification and biochemical characterisation of Guinea pig's antistaphylococal transfer factor // Int. J. Clin. Invest. - 2001. - № 4. - P. 106-108.

Kholodna L.S., Pozur V.K., Lyubchenko T.A. Modification effects of millimeter waves on immunobiological activity in conditionally pathogenic bacteries // 10^th International Symposium on Millimeter waves in Biology and Medicine. - Moscow (Russia). - 1995. - P. 100.

Lyubchenko T.A., Goleva E.G., Kholodna L.S., Pozur V.K. Studies of mechanism of action of leukocyte dialysates on functional activity of T- and B-lymphocytes // Congress of Moleucular Medicine. - Berlin (Germany). - 1997. - J .Molec.Med. - 1997. - V. 75, № 5. - P. B59.

Любченко Т.А., Голева О.Г., Холодна Л.С., Позур В.К. Очистка, тестування та вивчення механізму дії людського та тваринного фактора переносу до бактеріальних антигенних субстанцій // 7 Український Біохімічний з`їзд. - Київ (Україна). - 1997. - Т. 2. - С. 128-129.

Холодная Л.С. Влияние КВЧ электромагнитного излучения на иммунную систему // 3 съезд по радиационным исследованиям. - Москва (Россия). - 1997. - т. 3. - С. 78.

Lyubchenko T.A., Goleva E.G., Kholodna L.S., Smirnov V.V. Elaborating of effective preparates with immunomodulating properties on the base of transfer factor of cell-mediated immune response// XI-th International Congress on Transfer factor. - Monterrey (Mexico). -1999. - Р. 17.

Анотація

Холодна Л.С. Вплив стафілококового білка А та його різних форм на імунну відповідь. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 14.03.08 - імунологія та алергологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2001.

Дисертацію присвячено визначенню ролі основного фактора патогенності стафілококів - білка А та його різних форм у формуванні імунної відповіді, з'ясуванню механізмів імуномодулюючої дії, вивченню впливу на функціональну активність окремих популяцій імунокомпетентних клітин та системи неспецифічної резистентності. Досліджено вплив факторів, що змінюють продукцію та активність білка А, що може впливати на його антигенність.

Вперше проведено комплексне дослідження впливу на клітини імунної системи очищеного, кон'югованого, сорбованого, модифікованого, клітинно-зв'язаного білка А. Встановлено основні закономірності впливу досліджуваних антигенних субстанцій стафілококів на розвиток гуморальної та клітинної ланок імунної відповіді, неспецифічних факторів природної резистентності організму, виявлено протекторні властивості. На основі даних по вивченню впливу досліджуваних антигенів на штучні та природні мембрани, на продукцію регуляторних цитокінів та на функціональну активність окремих популяцій імунокомпетентних клітин висунуто гіпотезу про можливі механізми імуноактивуючої дії білка А за рахунок залучення Са²⁺ - залежних процесів. Встановлено клітини-мішені, що активуються. Знайдено протекторні властивості серед досліджуваних субстанцій в експериментальній стафілококовій інфекції. Показано можливість індукції продукції ними фактора переносу клітинної імунної реактивності. Досліджено фармакологічні властивості одержаних препаратів. Антигенспецифічність та відсутність побічних ефектів дозволяють рекомендувати досліджувані препарати для практичного використання.

Ключові слова: імунітет, імунокомпетентні клітини, стафілококова інфекція, антигени стафілококів, білок А, фактор переносу клітинної імунної реактивності.

Аннотация

Холодная Л.С. Влияние стафилококкового белка А и его разных форм на иммунный ответ. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 14.03.08 - иммунология и аллергология. - Киевский национальний университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2001.

Диссертация посвящена определению роли основного фактора патогенности стафилококков - белка А и его разных форм в формировании иммунного ответа, изучению механизмов иммуномодулирующего действия, влияния на функциональную активность отдельных популяций иммунокомпетентних клеток и системы неспецифической резистентности. Исследованы факторы, которые изменяют продукцию и активность белка А, что может вплиять на его антигенность и формирование иммунного ответа к нему. Установлено, что среди исследуемых факторов, облучение стафилококка электромагнитными волнами миллиметрового диапазона нетепловой интенсивности изменяет чувствительность культур к антибиотикам, модифицирует продукцию и активность белка А. Индуцированные облучением изменения не связаны с модификацией гена spa, что подтверждено результатами полимеразной цепной реакции.

Впервые проведено комплексное исследование влияния на клетки иммунной системы очищенного, конъюгированного, сорбированного, модифицированного и клеточно-связанного белка А. В диссертации установлены основные закономерности вплияния исследуемых антигенных субстанций стафилококков на развитие гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа, неспецифических факторов природной резистентности организма, определены их протекторные свойства. Белок А стафилококка в разных формах модифицирует функциональную активность клеток иммунной системы, опосредуя ее как специфическим так и неспецифическим взаимодействием с иммуноглобулинами, что приводит к изменению отдельных этапов развития иммунного ответа к Т-зависимому антигену. Иммуностимулирующее действие является разноплановым и проявляется уже на уровне процессов миграции стволовых кроветворных клеток, активации Т- и В- клеток и их кооперативного взаимодействия.

На основе даных изучения влияния исследуемых антигенов на исскуственные и природные мембраны клеток, продукцию регуляторных цитокинов и функциональную активность отдельных субпопуляций иммунокомпетентных клеток выдвинута гипотеза о механизме иммуноактивирующего действия белка А с участием Са²⁺.- зависимых процессов транслокации через плазматические мембраны. Установлены клетки-мишени, которые активируются. Найдены протекторные свойства среди исследуемых субстанций при экспериментальной стафилококковой инфекции.

Влияя на стимуляцию пролиферации стволовых клеток, регенерацию эритропоэза, кооперативные взаимодействия Т- и В-лимфоцитов, продукцию цитокинов, митогенное действие как Т- так и В-лимфоцитов, неспецифические факторы резистентности организма, белок А способствует восстановлению иммунной реактивности организма и выживаемости облученных животных, что свидетельствует о его противолучевом действии.

Показана возможность индукции исследуемыми антигенами продукции фактора переноса клеточной иммунной реактивности. Исследованы фармакологические свойства полученных препаратов. Антигенспецифичность и отсутствие побочных эффектов позволяют рекоммендовать данные препараты для практического использования.

Ключевые слова: иммунитет, иммунокомпетентные клетки, стафилококковая инфекция, антигены стафилококков, белок А, фактор переноса клеточной иммунной реактивности.

Abstract

Kholodna L.S. Influence of staphylococcal protein A and its different forms on immune response. - Manuscript.

Doctoral degree thesis, speciality 14.03.08 - immunology and allergology - T. Shevchenko National University, Kiеv, 2001.

The dissertation is devoted to investigation of role of the main staphylococcal patigenic factor - protein A and its different forms in formation of immune response, mechanisms of immunomodulative action, influence on functional activity of various populations of immune cells, nonspecific resistance. Conditions that can change synthesis and antigenic properties of protein A have been evaluated.

A new complex study of immunoloical effects of different forms of protein A (purified, conjugated, absorbed, modified, cell-bound) was conducted to characterize their influence on cellular and humoral immune response, nonspecific resistance; protective effects have been found. Based on data from experiments on protein A influence on artificial bilipid and native membranes, cytokine production, activity of certain sub-populations of immune cells, a hypothesis on mechanisms of immunoactivity of protein A has been proposed. Protein A is found to be able to incorporate in bilipid membranes and to influence Са²⁺-dependent cellular membrane transport. Protein A induceable target cells have been determined. Protective properties of investigated substances were found in experimental staphylococcal infection in mice. A possibility for production of specific anti-staphylococcal transfer factor was estimated. Pharmacological studies of investigated staphylococcal substances have been performed. Antigenspecifity and absence of negative side effects of these preparations provide practical approaches for protein A usage in various diseases.

Кey words: immunity, immunocompetitive cells, staphylococcal infection, staphylococcal antigens, protein A, transfer factor.

Размещено на Allbest.ru