Генная инженерия

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. История развития генной инженерии

2. Влияние генов на человека

3. Научно-исследовательские аспекты

4. Схема, используемая в генной инженерии

5. Среда и наследственность

6. Плюсы Генной инженерии

7. Минусы Генной инженерии

8. Уменьшение риска, связанного с генными технологиями

Заключение

Список литературы

Приложение



Введение

Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.

Генетическая инженерия (генная инженерия) - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.

За последние десятилетия, ученые с известной степенью вероятности установили, в каких именно хромосомах находятся гены, мутация которых вызывает ту или иную болезнь. Однако, замена «дефектных» генов на здоровые, не только крайне сложна, но и не очень эффективна - одно и то же заболевание бывает вызвано разными мутациями, из-за чего ход болезни часто не поддается прогнозированию.

Актуальность данной темы обусловлена тем, что за сто лет своего существования генетика добралась до человека, и теперь уже она его не оставит. Она нарисует его индивидуальный генетический портрет, даст ему в руки миниатюрный прибор, в котором будет собрана вся его наследственная информация. Каждый получит предупреждение, в каком возрасте болезнь Альцгеймера приступит к разрушению его памяти, насколько велик для него риск, заболеть раком или диабетом. Генетика порождает новую медицину - к этому и стремились сто лет назад ее основатели.

Целью данной работы является изучение генной инженерии

Исследование данной работы предопределило ряд задач:

· Рассмотреть историю генной инженерии.

· Проанализировать влияние генов на человека.



1. История развития генной инженерии

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж.Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год на рубеже 50-60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа:

Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами, создание рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных. Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

Генетическая инженерия - конструирование ДНК/in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК [12, с.62].

Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний.

2. О влиянии генов на человека

Одни и те же вопросы, задаваемые уже не первый год, сближают душу и тело и тут же непоправимо разделяют их. Неужели гены полностью и изначально программируют нашу жизнь? Неужели мы не способны измениться вообще? Или же наше поведение можно объяснить влиянием внешней среды, умением чему-то учиться? Итак, может ли человек развиваться, или все предопределено от века?

На протяжении всего XX столетия ученые по-разному отвечали на эти важнейшие вопросы бытия. В самом начале века была популярна вульгарная теория наследственности. В двадцатые годы маятник качнулся в обратную сторону. Заговорили о теории «бихевиоризма». Внезапно первопричиной всему стала окружающая среда. Самого же человека, как утверждали поклонники «новоуча» (вот оно, «время перековки»!), можно научить буквально всему. Человек есть существо перевоспитываемое. Итак, из непокорного материала он прямо на глазах превращался в пластилин, поднесенный к перстам социальных и политических ваятелей. В конце семидесятых годов империя биологов нанесла ответный удар. Преемники «теории наследственности» бросились в новую атаку. Они опирались на поразительные открытия, сделанные генетиками.

Теперь битва велась уже за первооснову человека. Является ли он марионеткой собственных генов? Может ли, например, «ген убийцы» определять агрессивное поведение человека?

Поиски нематериального начала в человеческом естестве - души, духа, сознания, эго - вылились в череду беспрерывных поражений. Новые сведения о нашей природе поступали одно за другим. В последние годы не проходило и месяца, чтобы не выявлялось: «Ген такой-то ответствен за то-то». Список казался неисчерпаемым. Среди десятков других «управделами» отрекомендовались ген авантюризма, ген обжорства, ген верности, ген робости, ген алкоголизма. Даже религиозность, политические воззрения или социальная позиция якобы передавались по наследству. Со времен иронических пассажей Джонатана Свифта мир не казался таким предопределенным, как это явствовало из откровений генетиков.

«За несколько дней до сотворения мира, - говорил он, - определено было, чтобы мой нос и этот столб столкнулись, и поэтому провидение сочло нужным послать нас в мир одновременно и сделать соотечественниками и согражданами. Если бы глаза мои были открыты, то, по всей вероятности, дело кончилось бы гораздо хуже. Разве не оступаются ежедневно люди, несмотря на всю свою предусмотрительность?» («Сказка бочки», пер. А. Франковского). Ретивые генетики, пожалуй, подправили бы Свифта, сказав, что движением носа, что шмякнулся о столб, конечно же, руководил «дефектный ген», мешавший индивиду держать нос по ветру и, наоборот, впутывавший его в разные неприглядные истории.

Впрочем, все вышеназванные открытия были сравнительно безобидными, хотя и сейчас еще немало политических тиранов будут рады истребить своих генетически неисправимых противников как тупиковую эволюционную ветвь, преграждающую дорогу в светлое будущее.

Между тем человек становился все «прозрачнее». Ученые заявили, что такие наклонности человека, как агрессивность или гомосексуализм, тоже коренятся в наших генах. Подобные открытия провоцировали следующий вывод: ген агрессивности управляет поведением человека, в то время как его обладатель не несет никакой ответственности за совершенные им деяния. «Несчастного хозяина гена» - возьмем самый крайний случай - нельзя даже осудить за убийство. Ген, знаете ли, попутал. Под выстрелами биологов падает бездыханное тело юриспруденции. Оппоненты говорят обратное: мы всегда имеем дело не только с различными генетическими факторами, но и с окружающим нас миром.

Понятие «окружающий мир» имеет мало общего с привычным термином «среда». Как считают генетики, «окружающий мир» не является чем-то неизбежно-императивным для человека, чем-то вроде клетки, в которую заточен бедняга, «имевший несчастие родиться». Нет, человек сам выбирает, выискивает себе свою среду (даже в темном царстве ребенок может плениться лучиком света), воздействует на среду и, в свою очередь, ею же, своей избранницей, переделывается - таким образом, человек и окружающая его среда находятся, так сказать, в «диалоговом режиме»: «Она его заела, он ее достал».

У всех нас есть определенные качества, которые нам не избыть. Можем ли мы повлиять на это или нет - об этом мы узнаем, лишь попытавшись это сделать. Никогда не удастся предсказать, насколько человек способен преступить свои генетические задатки. Что же до точного поведения, то новооткрытые гены стали давать слабину.

Пресловутый «ген агрессивности» разделил участь большинства других генов, якобы предопределявших поведение человека. Встречали их фанфарами, провожали короткой усмешкой. Их всемогущая власть опровергалась более тщательными научными изысканиями, и неудавшиеся диктаторы человеческой сути бесславно покидали «поле битвы за человека». Отныне «биологическим Бонапартом» оставалось лишь будоражить умы менее сведущие, витать среди застольных бесед обывателей, равно взволнованных и экстрасенсами, и «экстрагенами», превращать вульгарную болтовню в подобие научных сентенций, которые можно поверить даже «точным бухгалтерским расчетом».

То же случилось и с геном гомосексуализма. Вопреки устремлениям и уверениям, ученым не удалось отыскать ген, заставляющий мужчину предпочитать особей своего пола «всем красавицам Шираза». Гены определяют многое, но не все!

Нет, и не будет найдено никаких особенных генов, отвечающих, например, за интеллект. Исследования показали, что новорожденные дети мало различаются по своему интеллекту. Все довершает воспитание, заботливое или небрежное. Дети - при своих-то врожденных способностях - чаще всего бывают именно «запущены» родителями и близкими. Или же они сами «запускают» себя, ленясь, зарывая свой талант, не развивая свои способности. Если б отвергнутый нами одиозный политик проповедовал в своей жизни только одно: «Учиться, учиться и учиться!», цены бы этому лапушке не было. Да и нам тоже, если б мы одного этого завета и слушались.

Гены решают многое, но не все. Мы уступаем им нашу конституцию, но то, что восстает против всеобщего закона - дух, - становится достоянием нашего знания, нашей воли. Да, мы часто идем на поводу у генов. Мы наследуем цвет глаз и окраску волос, форму носа и оттенок кожи. Мы наследуем многие недуги. Все, с чем мы приходим в жизнь, впрямь заложено в наших генах. Они - инструкция нашей конструкции. (Если точно говорить: наследственность определяет норму реакции, норму изменчивости.) Именно они определяют строение ферментов и протеинов, жизненно важных для работы всех клеток нашего организма. И все же, если в генах нет какого-то уж очень серьезного изъяна, любые их вариации можно как-то компенсировать путем влияния, воздействия окружающих, подражания им.



3. Научно-исследовательские аспекты

Генная инженерия - экспериментальная наука. Возникла на стыке молекулярной биологии и генетики официально в 1972 г., когда в лаборатории П. Берга (Стенфордский университет, США) была получена первая рекомбинантная (гибридная) ДНК на базе объединения генетического материала, полный геном вируса обезьян 40, часть генома изомерного бактериофага и гены галактозного оперона.

Генная инженерия нацелена на создание организмов с новыми комбинациями наследственных свойств путем конструирования функционально-активных генетических структур в форме рекомбинантных ДНК из фрагментов геномов разных организмов, которые вводились в клетку.

Как отмечалось, впервые рекомбинантную ДНК получила группа П. Берга в 1972 г. В 1973-74 гг. С. Коэном, Д. Хелинским, Г. Бойером и другими учеными впервые сконструированы функционально активные молекулы гибридной ДНК, то есть удалось их клонирование. Были созданы первые, не существующие в Природе, плазмиды (стабилизатор наследства) на базе ДНК из разных видов бактерий и высших организмов, из ДНК лягушки (кодирующей синтез рРНК), морского ежа (контролирующей синтез белков-гистон), и от мыши.

Вскоре аналогичная работа была выполнена в нашей стране группой специалистов под руководством С. И. Алиханяна и А. А. Баева.

Работы в направлении синтеза гена начались еще до 1972 г. Так в 1969 г. появились публикации по выделению генов при помощи физических и генетических методов.

На начальном этапе развития генной инженерии широко использовался способ получения генов из природных источников, и он до сих пор применяется для создания банка генов.

Метод химического синтеза генов и введения их в клетки микроорганизмов обеспечил возможность получения продуцентов инсулина человека для лечения больных диабетом, открылся путь для производства продуктов белковой природы.

Широкое распространение нашел метод ферментативного синтеза генов по механизму обратной транскрипции. Он позволяет синтезировать практически любой ген. С его помощью созданы и клонированы в бактериях гены, кодирующие глобины человека, животных, птиц и т. п., интерферон человека, который используют для борьбы с вирусными инфекциями, злокачественными опухолями и рядом других заболеваний.

Однако остается нерешенной проблема стабильности гибридных молекул. Вектор должен обеспечивать стабильное наследование ДНК в автономном состоянии, иметь генетические маркеры для обнаружения трансформированных клеток, содержать сайт узнавания и др. Он используется для получения банка генов, так как клонированные в них большие фрагменты ДНК легко хранить, выделять и анализировать. Создаются специальные векторы и для клонирования ДНК в клетках животных и растений, при этом в клетках животных могут быть некоторые вирусы, а растений - агробактерии на основе специальных плазмид и передаваться клеткам в естественных условиях бактериями.

4. Схема, используемая в генной инженерии

Генную инженерию составляет совокупность различных экспериментальных приемов (методик), обеспечивающих конструкцию (реконструкцию) и клонирование молекул ДНК (генов) с заданными целями.

Методы генной инженерии используют в определенной последовательности, причем различают несколько стадий в выполнении типичного генно-инженерного эксперимента, направленного на клонирование какого-либо гена, а именно:

1. Выделение ДНК из клеток интересующего организма (исходного) и выделение ДНК-вектора.

2. Разрезание (рестрикция) ДНК исходного организма на фрагменты, содержащие интересующие гены, с помощью одного из ферментов-рестриктаз и выделение этих генов из образованной рестрикционной смеси. Одновременно разрезают (рестрикциируют) векторную ДНК, превращая ее из кольцевой структуры в линейную.

3. Смыкание интересующего сегмента ДНК (гена) с ДНК вектора с целью получения гибридных молекул ДНК.

4. Введение гибридных молекул ДНК путем трансформации в какой-либо другой организм, например, в Е. coli или в соматические клетки.

5. Высев бактерий, в которые вводили гибридные молекулы ДНК, на питательные среды, позволяющие рост только клеток, содержащих гибридные молекулы ДНК.

6. Идентификация колоний, состоящих из бактерий, содержащих гибридные молекулы ДНК.

7. Выделение клонированной ДНК (клонированных генов) и ее характеристика, включая секвенирование азотистых оснований в клонированном фрагменте ДНК.

ДНК (исходная и векторная), ферменты, клетки, в которых клонируют ДНК - все это называют «инструментами» генной инженерии.

Выделение ДНК

Рассмотрим методику выделения ДНК на примере ДНК плазмид. ДНК из плазмидосодержащих бактериальных клеток выделяют с помощью традиционной техники, заключающейся в получении клеточных экстрактов в присутствии детергентов и последующем удалении из экстрактов белков фенольной экстракцией Полная очистка плазмидной ДНК от белков, РНК и других соединений проводится в несколько стадий. После того как клетки разрушены, например, с помощью лизоцима (растворены их стенки), к экстракту добавляют детергент, чтобы растворить мембраны и инактивировать некоторые белки. Большинство хромосомной ДНК удаляют из получаемых препаратов обычным центрифугированием.

Часто для полной очистки используют хроматографию. Если требуется очень тщательная очистка, используют высокоскоростное центрифугирование в градиенте плотности CsCI с использованием этидия бромида. Оставшаяся хромосомная ДНК будет фрагментирована в линейную, тогда как плазмидная ДНК останется ковалентно закрытой. Поскольку этидия бромид менее плотен, чем ДНК, то при ультрацентрифугировании в центрифужной пробирке будет «выкручиваться» два кольца - плазмидная ДНК и хромосомная ДНК Плазмидную ДНК отбирают для дальнейшей работы, хромосомную ДНК выбрасывают.

Ферменты-рестриктазы и рестрикция ДНК

В ходе эволюции бактерии развили способность синтезировать так называемые рестрицирующие ферменты (эндонуклеазы), которые стали частью клеточной (бактериальной) системы рестрикции-модификации. У бактерий системы рестрикции-модификации являются внутриклеточной иммунной системой защиты от чужеродной ДНК. В отличие от высших организмов, у которых распознание и разрушение вирусов, бактерий и других патогенов происходит внеклеточно, у бактерий защита от чужеродной ДНК (ДНК растений и животных, в организме которых они обитают) происходит внутриклеточно, т. е. тогда, когда чужеродная ДНК проникает в цитоплазму бактерий. С целью защиты бактерии в ходе эволюции развили также способность «метить» собственную ДНК метилирующими основаниями на определенных последовательностях. По этой причине чужеродная ДНК из-за отсутствия в ней метальных групп на тех же последовательностях плавится (разрезается) на фрагменты разными бактериальными рестриктазами, а затем деградируется бактериальными экзонуклеазами до нуклеотидов. Можно сказать, что таким образом бактерии защищают себя от ДНК растений и животных, в организме которых они обитают временно (как патогены) или постоянно (как сапрофиты).

Рестриктазы впервые были выделены из Е. coli в 1968 г- Оказалось, что они способны разрезать (плавить) молекулы ДНК на разных сайтах (местах) рестрикции. Эти ферменты получили название эндонуклеаз класса I. Затем у бактерий были обнаружены эндонуклеазы класса II, которые распознают в чужеродной ДНК сайты рестрикции специфически и на этих сайтах тоже осуществляют рестрикцию. Именно ферменты этого класса стали использовать в генной инженерии. Тогда же были открыты ферменты класса III, которые плавят ДНК рядом с сайтами распознания, но эти ферменты не имеют значения в генной инженерии.

Действие системы рестрикции-модификации «рационализуется» так называемыми палиндромными (распознающими последовательностями) азотистых оснований, которые являются сайтами рестрикции ДНК. Палиндромные последовательности - это последовательности оснований, которые одинаково читаются вперед и назад, как, например, последовательность букв радар. Поскольку цепи ДНК обладают антипараллельным направлением, то считают, что последовательность является палиндромной, если она идентична, когда читается в направлении от 5'- к 3'-концу на верхней и 3'- к концу на нижней цепи, а именно:

Палиндромы могут быть любых размеров, но большинство тех палиндромов, которые используют в качестве сайтов узнавания рестриктазами, состоят из 4, 5, 6 и реже 8 оснований.

Рестриктазы - это абсолютно необходимый инструмент в генной инженерии для вырезания интересующих фрагментов (генов) из больших молекул ДНК. Поскольку известно более 100 ферментов рестрикции, то это позволяет выбор рестриктазы и селективное вырезание фрагментов из исходной ДНК.

Замечательной особенностью рестриктазы является то, что они продуцируют разрезы молекул на несколько фрагментов (рестрик-тов) ДНК уступами, в результате чего в образующихся концах одна цепь длиннее другой, образуя своеобразный хвост. Такие концы (хвосты) получили название «липких» концов т. к. они способны к самокомплементарности.

Рассмотрим результаты рестрикции на примере одной из наиболее известных рестриктазы Eco RI из системы рестрикция-модификация Е. coli. Вместо того чтобы плавить ДНК в центре па-линдромной последовательности узнавания, этот фермент плавит ДНК за пределами центра и продуцирует 4 самокомплементарных («липких») конца, состоящих из разного количества нуклеотидов, а именно:

Эти «липкие» концы в генно-инженерных опытах полезны по той причине, что они могут быть воссоединены комплементарно при низких температурах, что позволяет эффективное смыкание ДНК-фрагментов.

Сайты распознания и сайты плавления в случае других рестриктазы имеют другое содержание, а именно:

Вслед за рестрикцией ДНК из рестрикционной смеси выделяют рестрикционные ДНК-фрагменты (ДНК-рестрикты), которые необходимы затем для объединения с вектором. Для выделения ДНК-рестриктов прибегают к электрофорезу, поскольку с помощью этого метода рестрикцированную ДНК очень легко фракционировать благодаря размерам фрагментов-рестриктов и благодаря константным отношениям электрический заряд-масса. Фрагменты в электрическом поле мигрируют в ходе электрофореза при частоте, зависимой от их размеров (массы). Чем больше (длиннее) фрагмент, тем медленнее он мигрирует в электрическом поле. Материалом, в котором проводят электрофорез, являются незаражающиеся агарозы и полиакриламид. Для опознания фрагментов используют этидия бромид, который красит фрагменты, что ведет к их более легкому обнаружению

Результативность электрофореза очень высока, поскольку с его помощью могут быть разделены фрагменты, размеры которых составляют от 2 до 50 000 оснований.

После электрофореза фрагменты из агарозы выделяют с помощью разных методов. На основании результатов сравнения размеров рестрик-тов одной и той же ДНК, полученных с помощью разных рестриктазы, строят рестрикционные карты, на которых показывают сайты рестрикции каждой из использованных рестриктазы. В практическом плане рестрикционные карты позволяют определять не только размеры рестрик-тов, но и выяснять расположение в молекулах ДНК локусов тех или иных генов.

Поскольку у высших организмов в ходе транскрипции синтезируется гетерогенная ДНК, корректируемая процессингом, то в генной инженерии обычно используют комплементарную ДНК (кДНК), которую получают при использовании в качестве матрицы мРНК, на которой обратная транскриптаза синтезирует одноцепочечную ДНК (кДНК), являющуюся копией мРНК. В последующем эти одноцепочечные ДНК превращают в двухцепочечные ДНК. Считают, что кДНК содержит непрерывные нуклеотидные последовательности (транскрибируемые и транслируемые). Именно кДНК используют для рестрикции.

Выделенные после электрофореза из агарозных гелей фрагменты ДНК (рестрикты) можно предварительно подвергнуть секвенирование, т. е. определить в них нуклеотидную последовательность. Для этого используют химический и ферментативный методы сек-венирования.

Химический метод основан на получении меченных радиоактивным фосфором (32р) фрагментов и удалении из этих фрагментов одного из оснований с последующим учетом результатов радиоавтографии гелей, содержащих эти фрагменты. Ферментативный метод основан на том, что в конец анализируемого фрагмента вводят нуклеотид, используемый затем в синтезе разных фрагментов in vitro, анализируемых на нуклеотидную последовательность электрофоретически. Для изучения специфических последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК используют также гибридизацию ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК, Нозерн- и Саузерн-блоттинги.

Генетические векторы

Сегмент ДНК (ген), который предназначен для молекулярного клонирования, должен обладать способностью к репликации при переносе его в бактериальную клетку, т. е. быть репликоном. Однако он такой способностью не обладает. Поэтому, чтобы обеспечить перенос и обнаружение клонируемых генов в клетках, их объединяют с так называемыми генетическими векторами. Последние должны обладать, как минимум, двумя свойствами. Во-первых, векторы должны быть способны к репликации в клетках, причем в нескольких копиях. Во-вторых, они должны обеспечивать возможность селекции клеток, содержащих вектор, т. е. обладать маркером, на который можно вести контрселекцию клеток, содержащих вектор вместе с клонируемым геном (рекомбинантные молекулы ДНК). Таким требованиям отвечают плазмиды и фаги. Плазмиды являются хорошими векторами по той причине, что они являются репликонами и могут содержать гены резистентности к какому-либо антибиотику, что позволяет вести селекцию бактерий на устойчивость к этому антибиотику и, следовательно, легкое обнаружение рекомбинантных молекул ДНК.

Поскольку природные плазмидные векторы неизвестны, то все известные к настоящему времени плазмидные векторы были сконструированы искусственно. Исходным материалом для создания ряда генетических векторов послужили R-плазмиды, в которых с помощью рестриктаз удаляли излишние последовательности ДНК, в том числе те, на которых располагались множественные сайты рестрикции. Это удаление определялось тем, что плазмидный вектор должен обладать только одним сайтом узнавания для одной рестриктазы, причем этот сайт должен лежать в функционально несущественном районе плазмидного генома. Например, плазмидный вектор pBR 322, который содержит гены резистентности к ампициллину и тетрациклину, что делает его очень удобным для селекции бактерий, содержащих клонируемый сегмент ДНК, обладает одиночными сайтами рестрикции для более 20 ферментов-рестриктаз, включая такие известные рестриктазы, как Eco R I, Hind III, Pst I, Pva II и Sal I

Фаговые векторы тоже обладают рядом преимуществ. Они могут включать в себя более крупные (более длинные) клонируемые фрагменты ДНК по сравнению с плазмидными векторами. Далее, перенос фагами клонируемого фрагмента в клетки в результате ин-фицирования ими последних является более эффективным, чем трансформация ДНК. Наконец, фаговые векторы позволяют более эффективный скрининг (распознание) на поверхности агара колоний, содержащих клетки, несущие клонируемый ген. Многие фаговые векторы сконструированы на базе фага лямбда.

Кроме фаговых используют и другие вирусные векторы, сконструированные на базе вируса герпеса, а также векторы, сконструированные на базе дрожжевой ДНК.

Если клонирование генов проводят, используя клетки млекопитающих или растений, то требования к векторам те же, что и в случае клонирования в бактериальных клетках.

Конструирование рекомбинантных молекул ДНК

Непосредственное конструирование рекомбинантных молекул ДНК следует после того, как получены рестрикты исследуемой ДНК и векторной ДНК. Оно заключается в смыкании сегментов-рест-риктов исследуемой ДНК с рестриктом векторной ДНК, которая в результате рестрикции превращается из кольцевой в линейную ДНК.

Чтобы сомкнуть фрагменты исследуемой ДНК с ДНК-вектора, используют ДНК-лигазу Легирование(связывание) будет успешным, если смыкаемые структуры обладают 3'-гидроксил и 5'-фосфатной группами и если эти группы расположены соответствующим образом одна относительно другой. Фрагменты объединяются через их «липкие» концы в результате самокомплементарности. При высоких концентрациях фрагментов последние время от времени становятся в правильное положение (напротив друг друга). Многие рестриктазы, такие как Eco R I, продуцируют «липкие» концы, состоящие из 4-х оснований. Процесс легирования «липких» концов, состоящих из четырех оснований, происходит при пониженной температуре (до 12°С).

Если при рестрикции образуются фрагменты без «липких» концов, то их «насильственно» конвертируют в молекулы с «липкими» концами, используя фермент трансферазу. Этот фермент добавляет нуклеотиды к 3'-концу ДНК. На одном фрагменте может быть добавлен Поли-А-хвост, на другом -- Поли-т-хвост. Для генерации любых желаемых концов ДНК используют также так называемую полимеразную цепную реакцию (ПНР). Принцип ПЦР основан на денатурации выделенной из клеток ДНК и «отжиге» ее с добавлением к ренатурирующимся цепям ДНК-олигонуклеотидов, состоящих из 15--20 нуклеотидов каждый. Эти олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательностям в целях, разделенных расстояниями в 50-2000 нуклеотидов. Будучи «затравкой» для синтеза ДНК in vitro, они позволяют ДНК-полимеразе копировать те участки, которые находятся между «затравками». Это копирование дает большое количество копий изучаемого фрагмента ДНК.

Введение рекомбинантных молекул ДНК в клетки

После смыкания интересующего фрагмента ДНК (гена) с генетическим вектором с помощью ДНК-лигазы образованные рекомбинантные молекулы вводят в клетки с целью добиться их репликации (за счет генетического вектора) и увеличения количества копий. Наиболее популярным способом введения в клетки рекомбинантных молекул ДНК, в которых вектором служит плазмида, является трансформация Е. coli. С этой целью бактериальные клетки предварительно обрабатывают кальцием или рубидием (ионами) для того, чтобы они стали «компетентными» в восприятии рекомбинантной ДНК.

Чтобы повысить частоту проникновения ДНК в клетки, используют метод электропорации, заключающийся в кратком экспонировании клеток в интенсивном электрическом поле. Эта обработка создает полости в мембранах клеток, что способствует лучшему восприятию клетками ДНК- После введения рекомбинантных молекул ДНК в бактерии последние высевают на МПА, обогащенный антибиотиками для селекции желаемых клеток, т. е. клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Частота трансформации является невысокой. Обычно один трансформант возникает на 106 высеянных клеток. Если же вектор является фаговым, то прибегают к трансфекции клеток (бактерий или дрожжей) фагом. Что касается соматических клеток животных, то их трансфекцию осуществляют ДНК в присутствии химических веществ, облегчающих прохождение ДНК через плазматические мембраны. Возможны также прямые микроинъекции ДНК в овоциты лягушек, в культивируемые соматические клетки и в эмбрионы млекопитающих.

Важнейшим моментом, связанным с молекулярным клонированием, является поиск способа, позволяющего установить, действительно ли клонируемый фрагмент включился в вектор и вместе с вектором, образовав рекомбинантную молекулу ДНК, вошел в клетки. Если речь идет о бактериальных клетках, то один из способов основан на учете инсерционной инактивации плазмидного (векторного) гена резистентности. Например, в плазмидном векторе pBR322, детерминирующем резистентность к ампициллину и тетрациклину, единственный сайт для рестриктазы Pst I находится в локусе, занимаемом геном резистентности к ампициллину. Pst I --плавление на этом сайте генерирует липкие концы, позволяющие лигирование клонируемого фрагмента с векторной ДНК. Как уже отмечено, рестрикционные линейные фрагменты векторной ДНК способны к восстановлению кольцевой структуры без включения в них клонируемых сегментов. Чтобы уменьшить частоту спонтанного образования таких кольцевых молекул векторной ДНК, рестрикты векторной ДНК обрабатывают фосфатазой. В результате этого образование кольцевых молекул ДНК становится невозможным, поскольку будут отсутствовать концы 5'-РО^, необходимые для действия лигазы.

Совокупность колоций-трансформантов, выросших на селективной среде, представляет собой совокупность клеток, содержащих клоны разных фрагментов (генов) клонируемой геномной или кДНК. Коллекции этих клонов формируют так называемые библиотеки ДНК, широко используемые в генно-инженерных работах.

Заключительной стадией клонирования генов является выделение и исследование клонированной ДНК, включая секвенирование.

Перспективные штаммы бактерий или соматических клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, которые контролируют синтез интересующих белков, имеющих коммерческую ценность, передают в промышленность.

Известно несколько методов объединения фрагментов ДНК из разных источников, позволяющих включить клонируемую донорную ДНК в состав вектора.

Одним из перспективных методов клеточной инженерии в культуре клеток человека, животного и растения является гибридизация соматических клеток (Б. Эфрусси и Г. Барски).

В культивируемые клетки млекопитающих или развивающиеся эмбрионы ДНК вводят методом микроинъекции ДНК в ядро с помощью микроманипулятора.

Развитие методов микрохирургии клеток позволило заменять ядра оплодотворенных яйцеклеток на ядра из соматических клеток и в результате получать организм, идентичный тому, чье ядро было перенесено в яйцеклетку.

Создание гибридов высших растений возможно путем слияния протопластов и соматической гибридизации растительных клеток.

Все эти методы могут использоваться для конструирования новых форм микроорганизмов, животных и растений, несущих гены, детерминирующие желаемые признаки.

Не менее важна генная инженерия как аппарат фундаментальных исследований.

Потенциальные возможности генной инженерии в действительности очень велики, и они будут реализовываться.

5. Среда и наследственность

генная инженерия наследственность рестрикция

Излечивая больного, предотвращая распространение инфекционных заболеваний, врач использует могучее влияние среды на живой организм. Лечить - это значит так изменить среду, чтобы эти изменения шли на пользу больному, помогая ему бороться с болезнью. В борьбе с инфекциями наука достигла поразительных результатов. Лечение наследственных или врожденных заболеваний - дело гораздо более трудное. В случае врожденной болезни инфицирующий возбудитель отсутствует. Нет врага, которого следует уничтожить. Излечимы ли наследственные болезни, возможна ли их профилактика? Неужели действительно нет способов воздействовать извне на наследственный недуг, снять с помощью лекарства, диеты, лечебной гимнастики, хирургическим путем, наконец, симптомы заболевания?

Благодаря достижениям медицинской цитологии и биологической химии ученые начали понимать, в чем же заключается разница между здоровым организмом и организмом, отягощенным наследственной болезнью. Разработаны способы ранней диагностики многих наследственных заболеваний и найдены методы их лечения. По отношению к некоторым болезням открылась возможность предупредить рождение больных детей или предотвратить у них развитие болезни. Успех таился на стыке наук. Стена, отделяющая ученых-биологов и врачей-практиков, рухнула. Этот процесс осуществляется одновременно во всем мире. Интерес к законам наследственности со стороны врачей значительно возрос.

Наследственно обусловленные болезни человека привлекают к себе в настоящее время огромное внимание ученых всех стран. Создаются специальные научные институты для их изучения, периодически созываются

Съезды по медицинской генетике, издаются специальные журналы. Эта новая глава медицины развивается быстрым темпом. Современному человечеству удалось в какой-то мере справиться с рядом болезней, таких, как многие инфекции (туберкулез, оспа, тифы, сифилис, малярия и др.). Или как многие хирургические заболевания, вследствие чего значительно увеличилась средняя продолжительность жизни современных людей; в то же время в отношении наследственных болезней до последнего времени почти ничего еще не было сделано. Понятен тот огромный интерес, который в настоящее время привлекают к себе эти заболевания.

Важная роль при этом принадлежит тщательному изучению семейного анамнеза, составлению и анализу родословной. Успехи в ранней диагностике наследственных заболеваний обмена веществ в период, когда имеются лишь небольшие нарушения и заболевание еще не привело к необратимым морфологическим изменениям, способствуют разработке мер лечебного воздействия. Занятия физической культурой благотворно влияют на человека, и людям, занятым умственным трудом, необходимо компенсировать ограничение двигательной активности. Но вернемся к тесту. Длительный сон (свыше 10 часов в сутки) отрицательно влияет на продолжительность жизни, сокращая ее на 4 года по сравнению с 7-8-часовым сном, что также объясняется снижением двигательной активности, а значит, и ухудшением кровообращения. Тест показал, что агрессивные люди вспышками гнева укорачивают свой век, тогда как спокойные - продляют его благодаря собственной уравновешенности. Разница в продолжительности жизни этих двух категорий лиц составляет шесть лет. На продолжительность жизни отрицательно влияют курение, употребление спиртного, наркотиков, избыточный вес, положительно влияет образование. Среднее удлиняет ее на год, а высшее - на два. Образование развивает интеллект и культуру, которые влияют на всю организацию жизни человека.

Статистика свидетельствует, что долголетие бабушек и дедушек (срок жизни не менее 85 лет одного из них или не менее 80 - двух) повышает шансы внуков на продолжительность жизни, превышающую среднестатистическую. Скоропостижная смерть одного из этих прародителей в возрасте до 50 лет от сосудистых или онкологических заболеваний говорит о необходимости профилактики названных болезней у их потомков. Сейчас стало модно рисовать генеалогическое древо своей семьи. Вполне естественен интерес людей к своей родословной, к тому, чем занимались их прабабушки и прадедушки, участниками каких исторических событий они были, как жили. Полезно поинтересоваться и здоровьем родственников старшего поколения, так как предрасположенность ко многим заболеваниям передается по наследству. Например, гипертония, диабет, рак. Другой пример: медики считают алкоголизм болезнью, предупреждая, что склонность к злоупотреблению спиртным может наследоваться. Что это значит? Говоря бытовым языком, человек быстрее втягивается в пьянство, быстрее спивается. Это обусловлено особенностями биохимических процессов в его организме. Однако предрасположенность и предопределенность - понятия разные. Реализация генетической программы зависит от целого комплекса условий. В рассматриваемом случае она корректируется соответствующим образом жизни.

6. Плюсы Генной инженерии

Эмбриогенез - это феноменальный процесс, при котором информация, заложенная в линейной структуре ДНК, реализуется в трехмерный организм.

ДНК представляет запись последовательности аминокислот для построения молекул различных белков. В эмбриональном развитии в разное время появляются разные белки. Существуют гены-регуляторы, которые определяют время и скорость синтеза. Установлены состав и структура гена, но неизвестно как кодируется форма организма и, соответственно, как линейные спирали цепочной структуры белков соединяются в объемные структуры.

Клонирование есть воспроизведение живого существа из его неполовых клеток. Это попытка прорыва сквозь запреты Природы.

Клонирование органов и тканей - это задача номер один в области трансплантологии, травматологии и др. областях медицины и биологии.

При пересадке клонированных органов не возникает реакции отторжения и возможных последствий (например, рака, развивающегося на фоне иммунодефицита). Клонированные органы - это спасение для людей, попавших в автомобильные аварии или иные катастрофы, а также нуждающихся в радикальной помощи из-за каких-либо заболеваний.

Клонирование может дать возможность бездетным людям иметь своих собственных детей, поможет людям, страдающим тяжелыми генетическими заболеваниями. Так, если гены, определяющие какую-либо подобную болезнь, содержатся в хромосомах отца, то в яйцеклетку матери пересаживается ядро ее собственной соматической клетки, тогда появится ребенок, лишенный опасных генов, точная копия матери. Если эти гены содержатся в хромосомах матери, то в ее яйцеклетку будет перемещено ядро соматической клетки отца - появится здоровый ребенок, копия отца.

Более скромная, но не менее важная задача клонирования - регуляция пола сельскохозяйственных животных, а также клонирование в них человеческих генов "терапевтических белков", которые используются для лечения людей, например гемофиликов, у которых мутирован ген, кодирующий белок, участвующий в процессе свертывания крови. Это тем более важно, поскольку гемофилии считаются "группой риска" по СПИДу.

Бум, связанный с рождением овечки Долли, это всего лишь эпизод развитии клонирования. Когда она подрастет и обзаведется своим потомством, в ее молоке будет и человеческий белок, отличающийся от овечьего. Она станет на службу человечеству.

Американские ученые несколько модифицировали метод шотландцев, использовав ядра эмбриональных (зародышевых) фибробластов - взятых у взрослого организма клеток. Это облегчило задачу введения "чужого" гена, поскольку в культуре фибробластов это делать значительно легче и дешевле.

А, кроме того, так был обойден теломерасный (теломерас - бессмертие гена) запрет и смягчен запрет на клонирование (не распространяется на животных, отдельные органы и ткани, а клонирование людей отодвигается на 10 лет).

Это сулит уникальные перспективы для человечества, несмотря на все высказанные политическими, религиозными, научными и общественными деятелями морально-этические и чисто биологические возражения по использованию клонирования.

7. Минусы Генной инженерии

Некоторые особенности новых технологий 21 века могут привести к большим опасностям, чем существующие средства массового уничтожения. Прежде всего, это способность к саморепликации. Разрушающий и лавинно самовоспроизводящийся объект, специально созданный или случайно оказавшийся вне контроля, может стать средством массового поражения всех или избранных. Для этого не потребуются комплексы заводов, сложная организация и большие ассигнования. Угрозу будет представлять само знание: устройства, изобретённые и изготовленные в единичных экземплярах, могут содержать в себе всё, необходимое для дальнейшего размножения, действия и даже дальнейшей эволюции - изменению своих свойств в заданном направлении. Конечно, выше описаны вероятные, но не гарантированные варианты развития генной инженерии. Успех в этой отрасли науки сможет радикально поднять производительность труда и способствовать решению многих существующих проблем, прежде всего, подъему уровня жизни каждого человека, но, в то же время, и создать новые разрушительные средства.

8. Уменьшение риска, связанного с генными технологиями

Совершенно ясно, что главное при разработке правил и законов, регулирующих применение генных технологий - это создать рациональные концепции оценки риска. Действительно, как оценить риск того, чего еще никогда не случалось?

Первый шаг в этом направлении - установить, какие именно опасности могут возникнуть и как их избежать. Следующий шаг - оценить степень риска. Уменьшить риск можно, если определить категории опасности патогенов и использовать для работы с ними соответствующее защитное оборудование. По мере накопления конкретных знаний о конкретных опасностях оценки следует уточнять.

Есть документы, регламентирующие применение генных технологий. Это директивы, касающиеся правил безопасной работы в лабораториях и в промышленности, а также правила внесения генетически модифицированных организмов в окружающую среду. В большинстве европейских стран, как и положено, подобные директивы включены в свод национальных законов, а это, согласимся, уже немало.

Общий вывод меморандума ФЕМО таков: “При осмотрительном применении генных технологий польза от них сильно перевесит риск отрицательных последствий; технологии конструирования рекомбинантных ДНК внесут существенный вклад в здравоохранение, в развитие устойчивого сельского хозяйства, в производство пищи, в очистку окружаю



Заключение

Естествознание затрагивает широкий спектр вопросов о многочисленных и всесторонних проявлениях свойств природы.

В 70-е годы XX века создана техника выделения гена из ДНК, а также методика размножения нужного гена. В результате этого возникла генная инженерия. Внедрение в живой организм чужеродной генетической информации и приемы, заставляющие организм эту информацию реализовывать, составляют одно из самых перспективных направлений в развитии биотехнологии. Методами генетической инженерии удалось получить интерферон и инсулин. Объектом биотехнологии выступает сегодня не только отдельный ген, но и клетка в целом.

Клеточная инженерия открывает широкие возможности практического использования биомассы культивируемых клеток и создания на их основе промышленных технологий, например, для быстрого клонированного размножения и оздоровления растений.

Применение методов клеточной инженерии позволяет существенно интенсифицировать процесс создания новых форм организмов. Метод гибридизации соматических клеток - новый метод, дающий возможность получать межвидовые гибриды, т.е. преодолевать естественный барьер межвидовой нескрещиваемости, чего нельзя было достичь традиционными методами селекции. Для этого в искусственно созданных условиях выделяют и сливают протопласты - клетки, лишенные стенок, обоих родительских растений и получают гибридные клетки, которые могут затем регенерировать целое гибридное растение с признаками обоих родителей. Это позволяет получать совершенно новые организмы, не существовавшие в природе. Но при этом возникает опасность, что искусственно созданные организмы могут вызвать непредсказуемые и необратимые последствия для всего живого на Земле, в том числе, и для человека.

Генная и клеточная инженерия обратили внимание человечества на необходимость общественного контроля за всем, что происходит в науке.

Проделанная работа позволяет сделать вывод о том, что на технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний. Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом, можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов, как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Сейчас, даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков. Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

При помощи генной инженерии можно получать потомков с улучшенной внешностью, умственными и физическими способностями, характером и поведением. С помощью генотерапии в будущем возможно улучшение генома и нынеживущих людей. В принципе можно создавать и более серьёзные изменения, но на пути подобных преобразований человечеству необходимо решить множество этических проблем.

Таким образом, современное состояние науки о наследственности и хромосомных болезнях не дает никаких оснований для безучастного наблюдения над проявлением тяжелых наследственных пороков у человека, как это имело место еще недавно. Однако сегодня ученым удалось выяснить только связь между нарушениями хромосомного аппарата, с одной стороны, с различными патологическими изменениями в организме человека - с другой. Касаясь вопроса о завтрашнем дне медицинской генетики, можно сказать, что установление взаимосвязи между наследственными заболеваниями и хромосомными повреждениями представляет для клинической медицины большой практический интерес. Выявление причин первоначальных нарушений в системе хромосом, а также изучение механизма развития хромосомных болезней - также задача ближайшего будущего, причем задача первостепенного значения.