Механизмы реализации путей гибели клетки

Среди каспаз различают (см.рис.4):

* индукторы - каспазы, которые принимают апоптотический сигнал и передаю его.

* эффекторы, т.е. ферменты, непосредственно гидролизующие структурные белки клетки.

Среди молекулярных мишеней каспаз-эффекторов известны многие белки, деградация которых вызывает развитие необратимых процессов, характерных для апоптоза.

Каспазы присутствуют в клетке конституционно (даже в нейронах, которые не обновляются на протяжении всей жизни), что позволяет индуцировать апоптоз быстро.

Рисунок 3. Активация прокаспаз путем протеолитического расщепления на субъединицы и их последующей ассоциации (Самуилов В.П., 2000).



Пути активации каспаз:

1. Первый путь связан с взаимодействием индуктора апоптоза со специфическими рецепторами (например, активация каспазы-8 при взаимодействии Fas-лиганда с Fas-рецептором).

2. Другой путь - активация каспазы-9 в результате образования гетеродимеров белками семейства Всl-2.

3. Третий путь активации каспаз - при помощи гранзимов В - сериновой протеазы.

Такой путь активации каспаз актуален в случае индукции апоптоза клетки цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые и секретируют эти ферменты. При таком способе активации каспаз необходимо присугствие порообразующих белков перфоринов, продуцируемых также цитотоксическими Т-лимфоцитами. В качестве мишеней гранзимов В известны каспазы 1,3 и 9. Цистеиновые протеазы, по-видимому, участвуют также в ПКС у растений.

Рисунок 4. Функциональные взаимодействия между инициирующими и эффекторными каспазами подсемейства каспазы-3 (Самуилов В.П., 2000).

В результате действия каспаз происходит:

* активация прокаспаз с образованием каспаз;

* расщепление антиапоптозных белков семейства Bcl-2;

* подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственный за фрагментацию ДНК. В нормальных клетках апоптозная ДНКаза CAD (caspase-activated DNase) образует неактивный комплекс с ингибитором CAD, обозначаемым I^CAD или DFF (DNA fragmentation factor). При aпоптозе ингибитор I^CAD с участием каспаз 3 или 7 инактивируется, и свободная CAD, вызывая межнуклеосомалъные разрывы хроматина, ведет к образованию фрагментов ДНК с молекулярной массой, кратной молекулярной массе ДНК в нуклеосомных частицах - 180-200 пар нуклеотидов. Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК;

* обнаружен ядерный белок Acinus (apoptotic chromatin condensation inducer in nucleus), из которого при комбинированном действии каспазы-3 (протеолиз при Asp 1093) и неидентифицированной протеазы (протеолиз при Ser 987) образуется фрагмент Ser 987 - Asp 1093. Этот фрагмент в присутствии дополнительных неядерных факторов вызывает апоптотическую конденсацию хроматина и фрагментацию ядра (кариорексис) без фрагментации ДНК;

* гидролиз белков ламинов, армирующих ядерную мембрану. Это ведет к конденсации хроматина;

* разрушение белков, участвующих в регуляции цитоскелета;

* инактивация и нарушение регуляции белков, участвующих в репарации ДНК, сплайсинге мРНК, репликации ДНК. Мишенью каспаз является поли(ADР рибозо )полимераза (ПАРП). Этот фермент участвует в репарации ДНК, катализируя поли(ADР-рибозилирование) белков, связанных с ДНК. Донором ADР-рибозы является NAD+. Активность ПАРП возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. Апоптотическая гибель клетки сопровождается расщеплением ПАРП каспазами.

Чрезмерная активация ПАРП при массированных разрывах ДНК, сильно снижая содержание внутриклеточного NAD+, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту некроза.

Прокаспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 1-2% активности зрелой каспазы. Будучи в мономерной форме, прокаспазы, концентрация которых в клетке ничтожна, находятся в латентном состоянии. Предполагается, что пространственное сближение молекул прокаспаз при их агрегации ведет к образованию активных каспаз через механизм протеолитического само- и перекрестного расщепления (ауто- или транс-процессинга). В результате от прокаспазы (молекулярная масса 3-50 кДа) отделяется регуляторный N-концевой домен (продомен), а оставшаяся часть молекулы разделяется на большую (~20 кДа) и малую (~10 кДа) субъединицы (рис.3). Затем происходит ассоциация большой и малой субъединиц. Два гетеродимера образуют тетрамер с двумя каталитическими участками, действующими независимо друг от друга. Таким образом прокаспаза-8 активируется и высвобождается в цитоплазму в виде каспазы-8.

Каспаза-8 активирует каспазу второго эшелона (эффекторную каспазу): путем протеолиза из прокаспазы-3 образуется каспаза-3, после чего процесс, запущенный программой смерти, оказывается необратимым. На рисунке 4 показано взаимодействие между каспазами первого и второго эшелона. Каспаза-3 способна в дальнейшем к самостоятельной активации (автокатализу или автопроцессингу), активирует ряд других протеаз семейства каспаз, активирует фактор фрагментации ДНК, ведет к необратимому распаду ДНК на нуклеосомальные фрагменты. Так запускается каскад протеолитических ферментов, осуществляющих апоптоз. Предполагаются следующие пути передачи про- и aнтиапоптозных сигналов:



На этапе активации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохранить.

Существуют регуляторы, которые блокируют или, напротив, усиливают разрушительное действие каспаз первого эшелона. К ним относятся белки Bcl-2 (ингибиторы апоптоза: Аl, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-XL, Brag-1, Mcl-l и NR13) и Вах (промоторы апоптоза: Bad, Bak, Вах, Bcl-Xs, Bid, Вik, Bim, Нrk, Mtd). Эти белки эволюционно консервативны: гомолог Bcl-2 обнаружен даже у губок Geodia cydoтiuт и Suberites doтuпcula, у которых апоптоз необходим для морфогенеза.

Молекулярные механизмы апоптоза

Апоптоз - многоэтапный процесс.

Первый этап - прием сигнала, предвестника гибели в виде информации, поступающей к клетке извне или возникающей в недрах самой клетки. Сигнал воспринимается рецептором и подвергается анализу.

Далее через рецепторы или их сочетания полученный сигнал последовательно передается молекулам-посредникам (мессенджерам) различного порядка и в конечном итоге достигает ядра, где и происходит включение программы клеточного самоубийства путем активации летальных и/или репрессии антилетальных генов. Однако существование ПКС в безъядерных системах (цитопластах - клетках, лишенных ядра) показывает, что наличие ядра не является обязательным для реализации процесса.

Рецепторы представляют собой белковую молекулу, обычно состоящую из трех частей:

1. Внеклеточной - наружная часть рецептора способна узнавать сигнальные молекулы строго определенного строения, которые либо свободно плавают во внеклеточной жидкости, либо при креплены к поверхности других клеток или, скажем, межклеточных волокон. Сигнальные молекулы и рецепторы соответствуют друг другу, как ключ - замку.

В результате контакта сигнальных молекул с наружной частью белка-рецептора этот рецептор претерпевает структурные изменения: некоторые атомы меняют положение относительно других атомов. Структурная перестройка захватывает и внутриклеточную часть белков молекулы

2. Внутриклеточной. Внутриклеточная часть рецептора может либо сама обладать определенной ферментативной активностью, либо быть тесно связана с некоторыми клеточными ферментами.

3. Промежуточной, пронизывающей клеточную мембрану.

Изменение структуры рецептора сказывается на работе этих ферментов. Поэтому в результате контакта рецептора с внеклеточным веществом происходят биохимические изменения внутри клетки. Зачастую меняется концентрация ионов кальция, а также некоторых довольно мелких фосфорсодержащих органических соединений, относящихся к классу нуклеотидов. Могут появляться активные соединения в результате гидролиза некоторых липидов клеточной мембраны. Все это в состоянии вызывать присоединение или отщепление остатков фосфата от молекул белковых регуляторов, способных влиять на генетический аппарат клетки. Фосфорилироваиие и дефосфорилирование, а также некоторые другие биохимические модификации меняют активность этих регуляторов.

При связывании лиганда с рецептором происходит олигомеризация цитоплазматических белков:

* Ключевыми молекулами инструктивного апоптоза являются рецепторы смерти (death receptors). Рецепторы смерти передают внутрь клетки сигналы, поступающие в виде лигандов смерти (death ligands).

* DD (домен смерти), относящийся к рецептору,

* адапторного белка - FADD (Fаs-ассоциированный домен смерти), содержащий DED - эффекторный домен смерти

* прокаспазы-8. В результате этого процесса происходит активация апоптоз-специфической протеазы - каспазы-8 и развиваются характерные для апоптоза процессы.

Мутации в гене fas или в гене fas-L приводят к развитию аутоиммунных заболеваний.

У млекопитающих существует дополнительный механизм, позволяющий организму направлять клетки в апоптоз, называемый инструктивным апоптозом. Суть его сводиться к следующему: одна клетка посылает другой сигнал, говорящий о том, что после должна умереть. Инструктивный апоптоз обеспечивает защиту иммунопривилегированных органов от действия иммуноцитов, приниимает участие в толерантности клеток, пораженных вирусами. Таким образом, инструктивный апоптоз совершенно необходим нормальной работы иммунной системы.

Рецепторы смерти принадлежат сyперсемейству рецептора фактора некроза опухолей (ТNFR) I рецетора фактора роста нервов (NGFR). Отличительной чертой членов этого сyперсемейства является наличие экстраклеточного домена, содержащего повторы, богатые цистеином - CRD (cystein rich domain). CRD формирует поверхность, ответственную за взаимодействие с лигандом.

Белки сyперсемейства ТNFR I NGFR относят к рецепторам смерти по признаку наличия 70 - 80 аминокислотного цитоплазматического мотива, ответственного за белок -белковые взаимодействия и называемого доменом смерти (death domain). Домены смерти называются так потому, что с их помощью рецепторы взаимодействуют с клеточной апоптотической машиной.

Наиболее изученными рецепторами смерти являются:

1- CD95 (он же Аро1 и Fas)

2 - рецептор фактора некроза опухолей - (ТNFR1, (он же р55),

3 - DRЗ (он же Аро3, WSL-l, TRAMP и LARD),

4 - рецептор смерти - 5 (DR5, он же Аро2, TRAIL-R2, ТRIСК2 и КILLER),

5 - рецепторы смерти 4 и 6 (DR4 и 6). .

За исключением фактора роста нервов, лиганды рецепторов смерти сходны между собой по структуре и принадлежат суперсемейству фактора некроза опухолей.

Биологическая роль рецепторов смерти.

Рецептор фактора некроза опухолей-1 и его лиганды являются ключевыми молекулами воспалительного ответа. Fas - важный медиатор клеточного иммунного ответа, экспрессируется довольно широко. Экспрессия лиганда в норме ограничивается активированными Т и NK - клетками, клетками иммунопривилегированных органов.

Fas и его лиганд - важные эффекторные молекулы, используемые цитотоксическими иммуноцитами в защитной реакции против опухолевых клеток и клеток, пораженных вирусами. Кроме того, Fas и лиганд важны для элиминации иммуноцитов, попавших в иммунопривилегированные opraны, и клеточной смерти, зависимой от активации (AICD - activation induced сеlI death). AICD - важнейший механизм, позволяющий контролировать клеточный иммунный ответ. Биологическая роль рецепторов смерти 3,4, 5 и 6 не совсем понятна. Принято считать, что физиологические функции рецептора смерти 3 сходны с таковыми рецептора фактора некроза опухолей 1, то же - относительно рецепторов смерти 4 и 5 и Fas. Полной аналогии в данном случае проводить нельзя, так как имеются существенные отличия в профиле экспрессии соответствующих рецепторов и лигандов.

Взаимодействие с лигандом и передача сигнала внутрь клетки (общая схема).

1. Лиганды рецепторов смерти представляют собой тримеры. Тример лиганда связывается с тремя молекулами рецептора, вызывая таким образом тримеризацию последнего (рис.5).

2. В результате тримеризации рецептора происходит агрегация принадлежащих ему доменов смерти. С доменами смерти, подвергшимися агрегации посредством собственных доменов смерти, связываются разнообразные адапторные белки. Эти белки осуществляют дальнейшую передачу сигнала внутрь клетки. Не все адапторные белки принимают участие в индукции апоптоза, некоторые из них запускают сигнальные пути, не связанные с апоптозом и антиапоптотические.

3. Проапоптотические адапторные белки, вовлеченные в передачу сигнала от рецепторов смерти, содержат DED - death effector domain. DED относится к CARD - группе доменов, привлекающих каспазы.

4. Взаимодействие CARD с неактивным проферментом каспазы, вызывает автокаталитический процессинг предшественника, сопровождающийся появлением активной формы фермента.

Рисунок 5. Общая схема передачи сигнала через рецепторы смерти (Ермолаева М., 2001).

Существует несколько путей реализации программы ПКС :

1.Через клеточные рецепторы

Среди них важное место занимает путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых реализуется через клеточные рецепторы, специально предназначенные для включения программы апоптоза. Этот путь передачи сигнала ПКС схематически можно изобразить следующим образом: индукторы; рецепторы; адапторы; каспазы первого эшелона; регуляторы; каспазы второго эшелона. Так, рецептор, обозначаемый Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандом FasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на поверхности Т_Н- l-лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В-лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasL - лиганд, относящийся к многочисленному семейству фактора некроза опухолей (ТNF - tumor necrosis factor). Это семейство гомотримерных лигандов, кроме FasL и ТNFa, включает ТNPb (лимфотоксин), TRAIL (Ap02L), CD40L, CD27L, CD30L, OX40L.

Fas - член семейства рецепторов ТNP. Все они представлены трансмембранными белками, которые внеклеточными участками взаимодействуют с тримерами лигандов- индукторов. Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адапторами. Адаптор, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами, пока еще неактивными предшественниками протеаз из семейства каспаз первого эшелона (инициирующих каспаз).

Взаимодействие адаптора с рецептором и эффектором осуществляется через гомофильные белок-белковые взаимодействия небольших доменов:

* DD (death domain - домен смерти),

* DED (death-effector domain - домен эффектора смерти),

* САRD (caspase activation and recruitment domain - домен активации и рекрутирования каспазы). Все они имеют сходную структуру, содержат по шесть а-спиральных участков.

* Домены DD участвуют во взаимодействии рецептора Fas с адаптором FADD (Fas-associated DD-protein) и во взаимодействии рецепторов ТNFRl и DR3 (death receptor3) с адаптером TRADD (ТNFR1-associated DD-protein).

* Домены DED участвуют во взаимодействии адаптера FADD с прокаспазами 8 и 10.

* адаптор RAIDD (RIP-associated Ich-l/CED-3 homologous protein with а death domain, RIP - receptor interacting protein) связывается с прокаспазой-2 через СARD-домены.

Подобные агрегаты, в которых происходит активация каспаз, названы апоптосомами, апоптозными шаперонами, или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть (DISC - deathinducing signaling complex).

Наиболее детально охарактеризованы внутриклеточные события, происходящие в результате активации Fas и рецептора фактора некроза опухолей-l (ТNFR1).

1. К доменам смерти Fas, подвергшимся агрегации в результате взаимодействия рецептора с лигандом, посредством собственного домена смерти присоединяется адaпторный белок FADD (Fas associated death domain).

2. FADD содержит эффекторный домен смерти (DED). За счет взаимодействия вышеупомянутых гомологичных доменов каспаза-8 связывается с FADD - формируется сигнальный комплекс, индуцирующий клеточную смерть (DISC - death inducing signalin complex).

3. Каспаза-8 олигомеризуется и активируется посредством самопроцессинга. Активный фермент уходит из DISC.

Каспаза-8 является инициаторной - запускает апоптоз посредством активации других - эффекторных каспаз. Эффекторные каспазы расщепляют множества клеточных субстратов, разрушая клетку напрямую и косвенно - посредством высвобождения соответствующих ферментативных активностей.

4. Кроме FADD, с цитоплазматической частью Fas могут взаимодействовать другие белки. Белок Daxx взаимодействует с доменом смерти, принадлежащим Fas. По одним данным, Daxx активирует JNК (с - jun N - terminal kinase) через киназу ASK l. По другим данным, Daxx является транскрипционным фактором. Данные о последствиях действия Daxx также противоречивы: от индукции апоптоза по FADD - независимому пути до антиaпоптотического действия - прямого или опосредованного JNK.

5. Один из сигнальных путей, запускаемых Fas - активация кислой сфингомиелиназы (aSMase). aSMase продуцирует С2 - церамид - молекулу, долгое время считавшуюся активатором апоптоза. В настоящее время принято считать, что церамид не связан напрямую с апоптотической машиной, а лишь способствует апоптозу.

Передача сигнала от TNFRl (рис. 6) осуществляется иначе. В данном случае индукция апоптоза не является основным последствием взаимодействия рецептора с лигандом:

1. С доменом смерти (DD - death domain), принадлежащим ТNFR1 взаимодействует адапторный белок TRADD (ТNF receptor associated death domain).

2. С TRADD, в свою очередь, взаимодействуют DD - содержащие белки RIP (receptor interacting protain) и FADD.

3. FADD осуществляет индукцию апоптоза по механизму, аналогичному описанному выше.

4. RIР взаимодействует с еще одним адапторным белком - TRAF2 (ТNF receptor associated factor - 2).

5. TRAF2 и RIР запускают сигнальные пути, приводящие к активации транскрипционных факторов АР-1 и NF kappa В, под контролем которых экспрессируются провоспалительные и иммуномодулирующие гены.

6. Кроме того, под контролем вышеупомянутых транскрипционных факторов синтезируются антиапоптотические белки (различные белки семейства IAP - inhibitor of apoptosis, Bcl- х и другие).

Благодаря продукции антиапоптотических белков активация ТNFRl приводит к апоптозу лишь в определенных условиях. Например, в случае отсутствия белкового синтеза в клетке.



Рисунок 6. Передача сигнала через TNFRl (Ермолаева М., 2001).

Передача сигнала посредством рецепторов смерти 3, 4, 5 и 6

Из вышеупомянутых рецепторов лучше всего изучены последствия активации рецептора смерти 3. Этот рецептор очень похож на ТNFRl, а его лиганд (Apo3L) - на ТNF. С рецептором смерти 3 взаимодействуют те же адапторные белки, что и с ТNFRl.

Рецепторы смерти 4 и 5 (лиганд - TRAIL, он же Apo2L) по структуре напоминают Fas. Наименее изучена передача сигнала посредством рецептора смерти 6: для него не известны ни адапторные белки, ни лиганд.

Ингибирование клеткой передачи сигнала от рецепторов смерти

Передача сигнала через рецепторы смерти является мощным инструментом индукции апоптоза. Есть данные о способности рецепторов смерти и других DD-содержащи:х белков агрегировать в отсутствие лиганда. Для того, чтобы не допустить несвоевременный апоптоз, передачу сигнала через рецепторы смерти необходимо жестко контролировать. Для этого в клетках имеются соответствующие механизмы .

Белок SODD (silencer of death domains) состоит из 457 аминокислот, содержит домен смерти. SODD связывается с мономерами ТNFRl, препятствуя спонтанной агрегации молекул рецептора. Передача сигнала через рецепторы смерти может быть заблокирована на уровне взаимодействия рецептора с лигандом, посредством связывания лиганда с рецептором-приманкой (decoy receptor). Рецепторы-приманки - это рецепторы смерти, лишенные полноценного домена смерти. Среди них есть заякоренные на мембране (рецепторы-приманки 1 и 2) и растворимые (остеопротогерин, рецептор-приманка 3 и другие).

Некоторые рецепторы-приманки являются самостоятельными белками - кодируются соответствующими генами. Предполагается, что у вышеупомянутых рецепторов был общий предковый ген. Рецептор-приманка 1 полностью лишен цитоплазматического хвоста, цитоплазматический домен рецептора-приманки 2 сильно усечен, таким образом, оба рецептора не способны передавать сигнал внутрь клетки. Рецептор-приманка 3 (DcR3) и остеопротогерин (OPG) также являются самостоятельными белками.

Рецепторы-приманки могут быть продуктами альтернативного сплайсинга мРНК, кодирующих полноценные рецепторы смерти, а также получаться в результате отщеплеиия экстраклеточной части рецепторов смерти от мембраны под действием металпротеиназ.

Сигнальный путь, запускаемый рецепторами смерти, может быть заблокирован на уровне формирования DISC для этой цели в геноме клетки закодированы специальные белки, способные, посредством собственных DED, связываться с аналогичными доменами FADD и каспззы-8, препятствуя тем самым взаимодействию последних. Эти белки называются FLIPs - FLICE inhibitory proteins.

Все клеточные FLIPs (cFLIPs - cellular FLIPs) являются продуктами одного гена и образуются путем альтернативного сплайсиига соответствующей мРНК. Самый длинный из cFLIPs - cFLIPL или cFLIPa, содержит два DED и домен, гомологичный каспазам-8 и 10 с точечными заменами аминокислот, необходимых для протеолитической активности.

У двух других cFLIPs - cFLIPв и cFLIPг, отсутствует часть домена, гомологичного каспазам. Самый короткий вариант - cFLIPS или cFLIPд, полностью лишен этого домена.



Снижение мембранного потенциала (Dу) митохондрий

В клетках, подвергшихся воздействию индуктора апоптоза, резко снижается мембранный потенциал (Dy) митохондрий. Падение Dy обусловлено увеличением проницаемости внутренней мембраны митохондрий (permeability transition) вследствие образования гигантских пор. Разнообразны факторы, вызывающие раскрытие пор. К ним относятся истощение клеток восстановленным глyтатионом, NAD(p)H, АТР и ADP, образование активных форм кислорода, разобщение окислительного фосфорилирования протонофорными соединениями, увеличение содержания Са2+ в цитоплазме. Образование пор в митохондриях можно вызвать церамидом, NO, каспазами, амфипатическими пептидами, жирными кислотами. Поры имеют диаметр 2,9 нм, позволяющий пересекать мембрану веществам с молекулярной массой 1,5 кДа и ниже. Следствием раскрытия поры является набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение растворимых белков межмембранного объема. Сренди этих белков - ряд апоптогенных факторов: цитохром с, прокаспазы 2,3,9, белок AIF, представляющий собой флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа.

Образование гигантских пор не является единственным механизмом выхода мембранных белков митохондрий в цитоплазму. Возможен и альтернативный механизм, без разрыва мембраны, - раскрьrтие гигантского белкового канала в самой наружной мембране, способного пропускать цитохром с и другие белки из межмембранного пространства:

1. Высвобождаемый из митохондрий цитохром с вместе с цитоплазматическим фактором АРАF-1 (apoptosis protease activating factor-1) участвует в активации каспазы- 9.

2. АРАF-1 играет роль арматуры, на которой происходит аутокаталитический процессинг каспазы-9. Предполагается, что в результате зависимого от гидролиза dATP (или АТР) конформационного изменения АРАF-1 приобретает способность связывать цитохром с .

З. Связав цитохром С, APAF-1 претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ САRD -домена APAF-1 для прокаспазы-9, которая тоже содержит САRD-домен.

4. Так образуется конструкция, называемая тоже апоптосомой, с молекулярной массой > l,3 млн. дальтон, в составе которой - не менее 8 субъединиц APAF-1. Благодаря гомофильному САRD - СARD-взаимодействию с APAF-l в эквимолярном соотношении связывается прокаспаза-9, а затем прокаспаза-9 связывает прокаспазу-3. Пространственное сближение молекул прокаспазы-9 на мультимерной арматуре из АРAF-1-цитохром - с - комплексов, по-видимому, приводит к межмолекулярному протеолитическому процессингу прокаспазы-9 с образованием активной каспазы-9. Сходный механизм предложен для активации прокаспазы CED-3 у червя Cacпorhabditis elegaпs -аналога прокаспазы-9 млекопитающих. Альтернативный вариант - прокаспаза-9, связавшись с aпоптосомой, может принять конформацию, которая приводит к внутримолекулярному процессингу (самоактивации). Зрелая каспаза-9 затем расщепляет и активирует прокаспаз у - 3. Мутантный АРAF-1, лишенный WD-40-повторов, активирует прокаспазу-9, но не способен к рекрутированию и активации прокаспазы-3.

Кроме рассмотренных компонентов, при нарушении наружной мембраны митохондрий из межмембранного объема вьделяется термолабильный фактор, вызывающий необратимое превращение ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу. Фактор устойчив к ряду испытанных ингибиторов протеаз, включая каспазы, сериновые и металлопротеазы.

Ксантиндегидрогеназа катализирует зависимое от NAD+ окисление ксантина до гипоксантина и последующее окисление гипоксантина до мочевой кислоты. Ксантиноксидаза катализирует те же реакции, но не с NAD+, а с О₂ в качестве акцептора электронов. При этом образуются О₂А, Н₂О₂, а из них - и другие активные формы кислорода (АФК), которые разрушают митохондрии и являются мощными индукторами апоптоза. Механизмы образования АФК, конечно, не ограничиваются ксантиноксидазной реакцией. Главным источником АФК в клетках являются митохондрии. Резкое увеличение АФК происходит при возрастании мембранного потенциала в митохондриях, когда снижено потребление АТР и скорость дыхания лимитируется ADP. Доля электронного потока через дыхательную цепь митохондрий, идущая на образование О₂А, достигает 1-5 %. Цитоплазматическая мембрана макрофагов и нейтрофилов, как уже отмечалось, содержит О ₂А - генерирующую NADPH -оксидазу.

Комбинированного действия двух путей - с участием и рецепторов плазматической мембраны, и митохондриального цитохрома- с

В ряде случаев ПКС реализуется в результате комбинированного действия двух путей - с участием и рецепторов плазматической мембраны, и митохондриального цитохрома - с. Так, повреждение ДНК ведет к накоплению в клетке белкового продукта гена р53, который может останавливать деление клеток и/или индуцировать апоптоз. У более чем 50% изученных видов опухолевых клеток ген р53 инактивирован, у них нарушена р53-зависимая регуляция клеточного гомеостаза.

Белок р5З является фактором транскрипции, регулирующим активность ряда генов.

Предполагается, что ответная реакция на образование белка р5З зависит от степени нарушения клеточного генома. При умеренном нарушении генома происходит остановка клеточного деления, осуществляется репарация ДНК, и клетка продолжает свое существование. При чрезмерном нарушении генома, когда ДНК уже не поддается репарации, включаются рецепторный и цитохром -с- зависимый апоптозные каскады активации каспаз.

Различные пути апоптоза могут взаимодействовать между собой. В некоторых случаях зависимый от рецепторов путь ведет к малоэффективной активации прокаспазы-8. В этом случае подключается зависимый от митохондрий путь апоптоза: каспаза-8 (образовавшаяся в небольших количествах) взаимодействует в цитоплазме с белком Bid из семейства Вах, расщепляя его надвое. С-концевой домен Bid далее внедряется в митохондриальную мембрану, индуцируя выход цитохрома с из митохондрий и его связывание с APAF-l.

С участием эпдоплазматического ретикулума (ЭР)

Существует путь передачи сигнала ПКС с участием эндоплазматического ретикулума (ЭР). В ЭР локализована прокаспаза-12. Нарушение внутриклеточного Ca²⁺ - гомеостаза добавкой тапсигаргина или Са^2+-ионофорного антибиотика А2З187 ведет к апоптозу клеток, вызванному превращением прокаспазы-12 в каспазу-12. ЭР-зависимый апоптоз связан с болезнью Альцгеймера: кортикальные нейроны мышей, дефицитных по каспазе-12, устойчивы к апоптозу, Индуцированному I-амилоидным белком, но не к апоптозу с участием рецепторов плазматической мембраны или митохондриального цитохрома-с.

С помощью белка перфорина

Цитотоксические лимфоциты, Т-киллеры, могут вызывать апоптоз у инфицированных клеток с помощью белка перфорина. Полимеризуясь, перфорин образует в цитоплазматической мембране клетки-мишени трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки поступают ТNFb, гранзимы (фрагментины) - смесь сериновых протеаз. Существенным компонентом этой смеси является гранзим В - протеолитический фермент, превращающий прокаспазу-З в активную каспазу-З.

С помощью интегринов

Взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом осуществляется с помощью интегринов. Интегрины - большое семейство гетеродимерных мембранных белков, которые участвуют в адгезии клеток, связывая внутриклеточный цитоскелет с лигандами внеклеточного матрикса. Нарушение адгезии клеток индуцирует апоптоз. Большинство интегринов специфически взаимодействует с трипептидным RGD (аргинин-глицин-аспартат)-мотивом, входящим в состав белков внеклеточного матрикса. Растворимые низкомолекулярные RGD-содержащие пептиды являются эффективными индукторами апоптоза: проникая в клетки, они активируют латентную каспазу-З. Ряд каспаз, включая каспазу-З, содержит RGD-последовательность вблизи активного центра фермента. В молекуле прокаспазы эта последовательность, вероятно, вовлечена во внутримолекулярное взаимодействие, придающее молекуле профермента такую конформацию, при которой протеазная активность не может проявиться. Предположительно, RGD-последовательность взаимодействует с последовательностью DDM (аспартат-аспартат-метионин), локализованной вблизи участка протеолитической активации прокаспазы-З. Низкомолекулярный RGD-пептид, проникая в клетку и вступая в конкурентные взаимоотношения с RGD-последовательностью прокаспазы-З, вытесняет ее из сферы взаимодействия с DDМ-последовательностью молекул профермента и индуцирует изменение их конформации, олигомеризацию и аутопроцессинг прокаспазы-3 с образованием активной каспазы-3.

Апоптоз эритроцитов

Особую форму апоптоза претерпевают эритроциты млекопитающих. Биогенез эритроцитов из плюрипотентной стволовой клетки в костном мозге включает ряд промежуточных этапов. На этапе эритробласта ядро изгоняется (выталкивается) из клетки и пожирается макрофагом. Альтернативный вариант: кариорексис (деструкция ядра) с образованием телец Жолли и их последующий распад и лизис внутри клетки. Безъядерная клетка, называемая ретикулоцитом, в дальнейшем теряет митохондрии и рибосомы и превращается в эритроцит. Потерю ядра эритробластом можно рассматривать как особую формуи ядерного aпоптоза. Выяснение его механизма позволило бы применить его для обезвреживания опухолевых клеток. Эритроцит человека функционирует около 4 месяцев, а затем, поизносившись, исчезает в недрах ретикулоэндотелиальной системы, не причиняя неудобств окружающим клеткам. Лишенный ядра и митохондрий эритроцит, исполнив свое назначение, по-видимому, включает программу гибели, чтобы после этого поступитъ в распоряжение макрофагов печени и селезенки. Однако ингибитор протеинкиназы -стауроспорин и ингибитор синтеза белка - циклогексимид (индуцирующий ПКС у большинства испьrrанных типов клеток млекопитающих) не вызывают ПКС у безъядерных

эритроцитов человека. Стауроспорин и циклогексимид, а также отсутствие сыворотки в среде инкубации индуцируют гибель эритроцитов цьшленка (содержащих транскрипционно неактивное клеточное ядро) с выраженными признаками апоптоза по пути, который реализуется без участия каспаз. Сперматозоиды мьппи, у которых ядра тоже не обладают активностью в транскрипции ДНК, при инкубации в искусственных средах спонтанно погибают за 1-2 суток; стауроспорин, циклогексимид и пептидный ингибтор каспаз z-VAD.fmk не ускоряют и не замедляют клеточную гибель.

Молекулярные механизмы некроза

Некроз (греч. nekros - мертвый) возникает в результате прямого воздействия патогенного фактора (микроорганизм, ишемия и др.), нарушающего целостность мембраны клетки. Это приводит к массивному выбросу индукторов воспаления и к миграции иммунных клеток к очагу поражения. В результате в зоне поврежденной клетки развивается септическое или асептическое (в зависимости от причины) воспаление.

При этом происходят характерные изменения как в ядре, так и в цитоплазме. Ядро сморщивается, наблюдается конденсация хроматина (кар(опикноз) затем он распадается на глыбки (каризрексис) и растворяется (кариолизис). В цитоплазме происходят денатурация и коагуляция белков. Мембранные структуры распадаются. Нарушаются окислительно - восстановительные процессы и синтез АТФ в митохондриях, и вся клетка начинает страдать от нехватки энергии. Постепенно клетка распадается на отдельные глыбки, которые захватываются и поглощаются макрофагами. На месте в прошлом функционально активной клетки формируется соединительная ткань.

При некрозе клетки набухают, их митохондрии и другие органеллы расширяются (вследствие нарушения работы ионных каналов) и разрываются внутриклеточные и плазматическая мембраны клетки. В результате этого активируются лизосомальные ферменты, а внутриклеточное содержимое, попадая во внеклеточную среду, вызывает воспалительные процессы. Классические причины, приводящие к некрозу клетки - гипертермия, ингибирование окислительного фосфорилирования, гликолиза или цикла Кребса, гипоксия, действие комплемента или различных токсинов.

Некроз - это форма неапоптозной клеточной гибели, вносящая определенный вклад в некоторые патологические состояния у человека. Несмотря на значительное влияние некроза на здоровье человека, его молекулярные механизмы оставались плохо изученными. Это отчасти обусловливает широкое распространение идей о том, что некроз является хаотическим уничтожением клеток, у которого также отсутствует подходящая генетическая моделеь.

Недавние исследования обнаружили некоторые общие закономерности в некротической гибели клеток, указывающие на ограниченный репертуар биохимических каскадов клеточной деструкции. Эти механизмы, в отличие от большинства апоптозных путей, не эволюционировали. Они представляют нормальные физиологические процессы, которые становятся деструктивными при неблагоприятных условиях.

Определяющими детерминантами некроза являются механизмы ионного гомеостаза. Самые разные воздействия, инициирующие некроз, приводят к нарушениям ионного баланса, выходящего за пределы критического уровня, и таким образом запускается клеточная гибель. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция и окисление могут индуцировать и усиливать клеточную некротическую гибель.

Как и при апоптозе, в некротической гибели задействован механизм белковой деградации. Calpain и cathepsin протеазы играют ключевую роль в «демонтаже» клеток во время некротической гибели. Кроме того, каспазы (caspases) - главные «убийцы» при апоптозе - и протеасомы (proteasome) также участвуют в некрозе.

Несколько экспериментальных моделей некротической гибели клеток были разработаны на простых организмах, легко поддающихся генетическим манипуляциям - Caeпorhabditis elegaпs и Drosophila тelaпogaster. Эти организмы пригодны для анализа биохимических механизмов некроза и дают возможность получить данные, необходимые для разработки эффективных защитных мер против некротической гибели.

При сильных стрессовых воздействиях клетки подвергаются некрозу - острой, неапоптозной форме клеточной гибели. Некроз является тяжелым повреждением, нарушаюшим в числе прочих и функционирование нервной системы. Недавние исследования выявили молекулярные механизмы некроза и доказали, что механизмы некротической клеточной гибели эволюционно высококонсервативны и почти одинаковы от нематоды до человека, Однако, в отличие от механизмов апоптоза, механизмы некроза не эволюционировали специфическим образом. При экстремальных условиях нормальная активность клеток дестабилизируется тяжелыми для нее последствиями (рис. 120).



Рисунок 7. Некротическая смерть клетки. Электрониые микрографы нормальиой клетки (а) и клетки, испытывающей некротическую смерть (б).

Как и при апоптозе есть, несколько путей активации процессов некроза.

Фибробласты в культурах входят в стадию покоя (G_о-стадия) с измененной рН. При таких условиях наблюдается остановка транскрипции, синтеза ДНК и снижается синтез белка, клетка прекращает расти или делиться, пока рН не вернулся на нормальные уровни.

Учитывая, что большинство молекул не может функционировать в условиях измененной рН, имеется комплекс специализированных гомеостатических механизмов, которые поддерживают внутренний рН (pHi) на постоянном уровне (обычно приблизительно 7,2 в цитоплазме).

Эти механизмы могут быть разделены на активный, которые требуют использования АТР, и пассивный, который не требует АТР.

1. Клетки пассивно регулируют рН с огромным изобилием буфера. Буфер изолирует дополнительные протоны в условиях низкого рН и выпускает протоны, если цитозольный рН становится слишком высоким. Самый важный цитозольный буфер - фосфорная кислота (Н_ЗРО₄) - который помогает поддерживать рН 7,2. Аминокислоты - также важные компоненты рН буфера. Лизин, аргинин и гистидин имеют основные цепи стороны с группами аминопласта; и аспартат, и глутамат имеет кислые карбоксильные группы.

Свободные аминокислоты имеют дополнительный аминопласт и группы карбоксила, которые усиливают, увеличивают их буферную способность. Нормальный клеточный метаболизм также создает буферные молекулы. Они включают уксусные, молочные и лимонные кислоты и производство углекислого газа.

2. Пассивные рН регулирующие механизмы увеличены зависимыми энергией процессами, которые поддерживают цитоплазматический и органоидный рН в оптимальном режиме. Много ионообменников регулируют внутриклеточный рН, позволяя одном) заряженному иону проникать в клетку с одновременной потерей другого заряженного иона. Эти антипорты «перетаскивают» энергию против электрохимического градиента плазматической мембраны и мембраны органелл, чтобы обеспечить обмен протонами для Na- или К + .

Calpains становится активизированным, когда концентрация кальция увеличивается. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция происходит или непосредственно или косвенно в ответ на многие разнообразные стимулы, вызывающие некроз и апоптоз. Cathepsin протеазы, освобожденные в цитоплазму, активируются только после того как активизирован calpains, ставя под угрозу целостность мембраны лизосом. Лизосомы содержат более чем 80 типов гидролитических ферментов, включая cathepsins. Механизм сalрain-индуцированного разрыва лизосом неясен. В цитоплазме эти ферменты нарушающие клеточные структуры, и смерть неизбежна. Этот процесс напоминает аутофагию и подтверждает выражение de Дюв «лизосомы - мешок самоубийства клетки». Механизм, которым достигается сверх активация аутофагии, неясен. Предполагается, что она может быть вызвана серьезным истощением энергии после разрушения митохондрий. Гены, которые кодируют белки, вовлеченные в регуляцию клеточного кальциевого гомеостаза, так же, как гены calpain протеаз, были обнаружены в генетических экранах как источники некроза нейронов.

Рецепторы.

Важнейшими медиаторами воспалительных и инфекционных процессов, ceкpeтируемыми из клеток пораженной ткани, являются цитокины и ростовые факторы. Многие из этих агентов способны инициировать некротические программы. При этом увеличение доли некротических клеток к апоптотическим соответствовало снижению активности каспаз.

Функционирование некротической программы также зависело от активности митоген- активируемых протеинкиназ (МАРК), участвующих в передаче летального сигнала.

В присутствии перехватчиков активных форм кислорода (АФК) некротическая программа, индуцируемая противовоспалительными цитокинами, переключалась на апоптотическую.

Индуцируемые патофизиологическим стимулом (инфекция, воспаление и т.д.) межклеточные медиаторы-цитокины среди других реакций активируют различные формы ПКГ, и апоптоз, и некроз. Эти программы гибели реализуются клеткой-мишенью в зависимости от типа цитокина-стимула и биохимического фенотипа клетки.

Рецепторы и лиганды. Модельные эксперименты с экзайтотоксинами показали, что ключевую роль в выборе формы клеточной гибели нейронов играет возбуждение (ехcite) различных подтипов глутаматных и неглютаматных рецепторов.

При этом интенсивность некротической деструкции вполне поддается регулированию не только с помощью их антагонистов, но и нижележащих путях передачи стрессового сигнала. Некротическая чувствительность клеток гиппокампа к гипоксии и экзайтотоксинам подавлялась ингибитором ЕRК-киназ или ингибированием протеаз типа кальпаина.

Семейство ТNF-рецепторов в различных условиях может быть инициатором клеточной гибели не только С апоптотической, но и с некротической морфологией.

Таким образом, ранее хорошо известные апоптогенные репепторы способны инициировать и некротическую программу .

Описаны и рецептор-зависимые пути, ограничивающие некроз. Элементом этой защиты может быть белок А20 (белок с «цинковым пальцем»), экспрессия которого активируется TNF. Ростовые факторы TGFб и EGRF также проявляли защитное действие аутокринным образом.

Таким образом различные рецепторы "в клетках, "в том числе специфические для передачи апоптотического сигнала, в определенных условиях инициируют программу клеточной деструкции с некротической морфологией. При этом имеются механизмы и рецепторы не только для реализации той или иной формы гибели, но и для ауто- или паракринной защиты клеток от превращения стрессового сигнала в летальный.

Липиды. Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ), как и сами липиды, играют важную роль в механизмах трансляции танатогенных сигналов. Индуцируемый ими клеточный некроз может подавляться на разных этапах реализации летальной программы: ингибированием включения липидов в клетку (брефелдин А и ловастатин), связыванием Са²⁺, поддержанием редокс-статуса клетки предшественниками глутатиона.

Один из продуктов метаболизма холестерина - желчная гликоценодезоксихолевая кислота (GCDC), вызывала в гепатоцитах некротическую деструкцию. Таким образом, естественные липиды, наряду с другими физиологическими медиаторами, являются индукторами некротической программы в клетках, некоторые стадии которой могут быть мишенями для различных ингибиторов некроза.

Ионные каналы. Кальций является одним из наиболее мощных индукторов и медиаторов клеточной гибели. Клеточный выбор того или иного пути гибели при действии этого иона, обычно моделируемый Са^2+-ионофорами (А23187, Вг-А23187), зависит от вида клеток или микроокружения и может определяться экспрессией внутриклеточных ингибиторов апоптоза из Всl-2 семейства. Удаление Са²⁺ из среды или внесение хелаторов (EGTA, ВАРТА) защищает клетки от некроза, индуцируемого голоданием и аноксией.

Но это не свидетельство пассивной диффузии иона через мембраны. Как втекание экстраклеточного Са^2+, так и выделение из внутриклеточных депо является активным процессом, зависящим от функционирования специфических каналов. В определении летальной реакции клеток на стресс могут принимать участие и одновалентные ионы.

Медиаторы (типа глутамата) выпущены от синапсов на деполяризации после достижения потенциала действия. Процесс выпуска тщательно управляется, и наращивание чрезмерного медиатора в синапсе предотвращено действием посвященных транспортеров, которые очищают синаптическую щель. Глутамат связывается с открытыми ионными каналами рецептора на постсинаптических нейронах. Открытие этих каналов вызывает приток ионов кальция в клетке (непосредственно через глутаматные рецепторы которые проводят и кальций и натрий или косвенно - через вторичную активацию кальция). Острое увеличение внутриклеточной концентрации кальция - основной смертельно-сигнальный случай, который вовлечен в некроз и апоптоз. Вклад каждого типа смерти коррелирует с силой и внезапностью увеличения внутриклеточного кальция. Выбор пути зависит от уровня действия повреждающего фактора. Однако и некроз, и апоптоз клетки происходит в пределах ткани, которая меньше страдает от недостатка кислорода.

Таким образом, ионное окружение, функциональное состояние ионных каналов и способность клеток поддерживать (или переносить) определенное содержание внутриклеточных ионов может влиять на выбор программы суицидной элиминации.

Редокс-сигнальвые пути. Усиление продукции активных форм кислорода (АФК) и азота (АФА) может вызываться в организме многими причинами: иммунологической реакцией, дисфункцией митохондрии при реализации летальных программ, передачей сигнала. На важность последнего механизма указывают данные о том, что доминант- негативная мутация по гену малого GТР-белка - Racl, подавляет продукцию АФК и перекисей липидов, активацию NF-кВ и некроз гепатоцитов. Как следствие высокой токсичности кислорода, аэробные клетки обладают множественными системами антиокислительной защиты, и в ряде случаев гипоксия препятствует исполнению некротической гибели, например, вызываемой производным витамина А или ТNFб.

Один из компонентов АФК - перекись водорода интенсивно продуцируется в клетках и как фактор иммунной защиты, и в условиях самых различных клеточных стрессов и вызывает как апоптотическую, так и некротическую деструкции клеток.

Одна из схем танатогенного действия NO* предполагает его связывание с железом различных гемов, особенно митохондриальной цепи дыхания и их инактивацию.

Пероксинитрит - одно из высокоактивных соединений азота, образующееся в организме. Исследования показывают, что поддержание уровня глутатиона его предшественником предотвращает индукцию некроза.

Анализ свидетельствует, что в большинстве случаев антиоксиданты подавляют некротическую программу деструкции клеток, как и anоптотическую.

Таким образом, оксидативный/нитрозотивный стресс индуцирует некроз в тех случаях, когда внутриклеточное восстанавливающее содержимое исчерпывается при точном образовании АФК и АФА, повреждении систем естественной антиоксидантной защиты и недостаточном уровне АТР.

Поли (ADР-рибозо)-полимераза.

Поли(ADР-рибозо)-полимераза (РЛRP) - ядерный фермент, содержащий Zn-связывающую последовательность. Он активирует разрывами ДНК и присоединяет к различным белкам и к самому себе 50-200-звенные олигомеры АDР-рибозы.

Предполагается, что избыточная активация PARP, например, в результате массовой индукции разрывов ДНК, может быть одной из причин клеточной гибели, вызывая катастрофическое падение уровня АТР, которое связано с расходованием АТР на NAD+ - субстрата фермента. Индукция разрывов ДНК гидропероксидом приводит к экстремальной активации РАRP и последующему исчерпанию NAD4 и АТР. Ингибирование РARP существенно отдаляло клеточный лизис или переключало на апоnтотический путь. При этом значительно возрастала активность каспаз.

Тем не менее фрагментация и образование фрагментов ДНК, соответственно инактивация РАRP происходят и в клетках, претерпевающих некроз, правда, образуются фрагменты, отличные от тех, что образуются при апоптозе. Возможно, это отражает специфику протеолитического аппарата, выполняющего программу деструкции, а возможно и специфические функции образующихся пептидов, связанных с участием РАRP не только в поддержании функций аппарата репарации ДНК, но и стимуляции апоптотического эндонуклеолиза.

Обнаружение новых членов РARP семейства предполагает более сложный (не только через исчерпание АТР) механизм участия этого фермента в модуляции резистентности клеток к патофизиологическим воздействиям и в программах суицидной деструкции.

Протеазы. Протеолитические ферменты в аппарате суицидной элиминации клеток выполняют несколько функций, в том числе активацию рецепторного аппарата, передачу летального сигнала и выполнение собственно деструкции различных биополимеров. Существенную роль играют в этих процессах цистеиновые протеазы из семейства каспаз.

Вместе с тем для некоторых других стрессорных стимулов и клеточных линий реализация некротической программы требует активации каспаз. Участие каспаз в некрозе подтверждается не только расщеплением РARP, но и других субстратов, например, во фрагментации ламина В, индуцированной некротической дозой ИР, возможно, принимает участие касп-6.

Подобный эффект наблюдался при экзайтотоксической гибели нейронов гиппокампа. Эти наблюдения проявляют еще одну - антинекротическую роль каспаз. В этом случае они, вместе с другими протеазами, по-видимому, включаются в катаболический аппарат (апоптосомы), элиминирующий те «негодные» митохондрии, которые продуцируют избыточные количества АФК. Если такая попытка не удается, в клетке инициируется некроз. Такая «программируемая» аутофагия митохондрий с участием тех же протеазкаспаз, как и апоптотическая деструкция клеток, весьма точно отражена в термине «митоптоз».

Растет число свидетельств о механизмах деструкции клеток, не требующих каспаз.

В частности сериновые протеазы участвуют в ТNF-индуцируемом некрозе и гибели вследствие химической гипоксии. Роль каспаз, по-видимому, могут выполнять и другие ферменты, в том числе цистеиновые протеазы типа кальпаина. Переключение некротической гибели нейронов на апоптотическую наблюдалось в условиях ингибирования Са²⁺ - активируемой протеазы кальпаин 1. Ингибитор кальпаина II блокировал Са + - индуцированную гибель нейронов.

При некротической гибели наблюдается существенное снижение активности эктопротеаз, функционирующих на внешней поверхности клеток, в отличие от апоптотической.

Таким образом, роль центрального «экзекутора апоптоза» - каспаз, в некротических программах более разнообразна. Их ингибирование может приводить и к подавлению, и к усилению некроза. Подавление некроза, по-видимому, отражает роль каспаз в активации специфических для этой программы гидролаз. Неясным остается вопрос о значении АТР в этих механизмах. Вероятно, в части случаев переключение апоптоза на некроз в присутствии ингибиторов каспаз связано с энергетикой. Если ингибирование каспаз предохраняет РАRP от инактивации и соответственно стимулирует «самопоедания» АТР, то это прямой стимул к реализации нергонезависимых программ некротической гибели. И напротив, инактивация РARP каспазами поддерживает энергозависимые апоптотические процессы. И наконец, имеются каспазо-независимые программы, в исполнение которых включаются другие протеазы, например кальпаиновые или сериновые протеазы, вызывающие в первую очередь повреждения плазматической мембраны и клеточных органелл.