Определение размера молекул мРНК, гибридизующихся с геномными клонами, дает оценку суммарной величины гена. Эта оценка имеет важное значение для реконструирования полноразмерной кДНК. Ее клонирование, по сути, означает идентификацию гена, так как позволяет определить его границы в геномной ДНК, охарактеризовать его экзонно-интронную структуру и регуляторные элементы. Зная первичную нуклеотидную последовательность кДНК, можно с уверенностью прогнозировать аминокислотную последовательность соответствующего белка и таким образом определить первичное биохимическое звено в патогенезе соответствующего наследственного заболевания.

Описанный способ изучения молекулярных и биохимических основ наследственных заболеваний получил название обратной генетики, а сам процесс, в отличие от традиционного пути от белка к гену, так называемого функционального клонирования, был назван позиционным клонированием, тем более что термин обратной генетики уже использовался ранее для обозначения метода анализа функций гена путем направленного введения в него мутаций (Collins F.S., 1992).

Возможность использования функционального клонирования зависит от доступности информации о белковом продукте и/или о функции соответствующего гена. На фоне стремительного роста данных о структуре генома человека и прежде всего о насыщенности генами и анонимными ДНК-маркерами отдельных хромосом и их сегментов реальные соотношения функционального и позиционного клонирования в идентификации генов, ответственных за наследственные заболевания, быстро меняются в сторону безусловного доминирования последнего.

Успех позиционного клонирования определяется возможностями картирования гена, при этом функция гена исследуется уже после его идентификации и клонирования. На рис. 13 представлена общая схема позиционного клонирования, заимствованная из работы Ф. Коллинза. Обычно для нахождения положения известного гена на карте сцепления используют 100-200 полиморфных маркеров. После обнаружения хромосомной принадлежности картируемого гена его более точна локализация может быть установлена с помощью прицельного отбора дополнительных индексных маркеров из определенного цитогенетического сегмента. Картирование гена, определяющего наследственное заболевание, может быть значительно ускорено при наличии у какого-то больного цитогенетически видимой структурной перестройки в области локализации этого гена, чаще всего делеции или транслокации. Хотя такие пациенты, как правило, встречаются редко, но описание даже одного такого случая может исключить необходимость картирования гена путем последовательного анализа его сцепления с генетическими маркерами целого генома и позволит перейти непосредственно к молекулярному клонированию. Именно таким образом были идентифицированы гены хронического грануломатоза, миопатии Дюшена, ретинобластомы, Х-сцепленной глухоты, нейрофиброматоза I, аниридии и некоторых других наследственных болезней. С другой стороны, в ряде случаев удается исключить длительный процесс молекулярного клонирования, используя метод «кандидатного гена». Разработка методов, облегчающих нахождение транскрибируемых областей генов, улавливание экзонов и регуляторных участков генов, секвенирование и картирование методами гибридизации in situ большого количества анонимных кДНК-последовательностей, изолированных из тканеспецифических библиотек, - все это в комплексе приводит к значительному увеличению степени насыщенности различных сегментов хромосом известными генными последовательностями, среди которых и осуществляют поиск гена-кандидата. Важная роль в этих исследованиях принадлежит также мутантным генетическим линиям животных, моделирующим различные наследственные заболевания человека. Значительное сходство нуклеотидных последовательностей кодирующих участков гомологичных генов млекопитающих и человека, наличие большого числа консервативных групп сцепления с наборами идентичных генов позволяют успешно вести параллельные исследования геномов человека и других животных, значительно ускоряющие эффективность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов человека.

Молекулярная идентификация генов открывает широкие возможности для анализа тканеспецифической регуляции их экспрессии в процессе развития организма на всех уровнях от трансляции до транскрипции. Следующим этапом молекулярного анализа является генотипирование мутаций и исследование тех нарушений в структуре, локализации или в ферментативной активности соответствующих белков, которые возникают в результате изменений нуклеотидных последовательностей ДНК.

2. ДНК-диагностика (DNA-diagnostics) - молекулярные методы диагностики

2.1 Методика детекции мутаций с обязательным секвенированием, занимаемых ими сегментов ДНК

Гетеродуплексный анализ позволяет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде или в гетерозиготном состоянии. Принцип метода заключается в том, что при амплификации относительно небольших фрагментов генов гетерозигот или гомозиготных компаундов мутация может быть локализована лишь в одной из гомологичных нитей матричной ДНК. Поэтому в амплификационной смеси наряду с двумя типами гомодуплексов образуются гетеродуплексы между нормальной и мутантной цепочками ДНК. Такие гетеродуплексные молекулы ДНК имеют иную электрофоретическую подвижность по сравнению с гомодуплексами (неотличающимися между собой по подвижности) за счет конформационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов (mismatch) (рис. 16). Эти различия могут быть обнаружены при электрофорезе в обычном полиакриламидном геле.

Значительно более эффективное разделение гомо- и гетеродуплексов может быть достигнуто при использовании других вариантов гелей - Hydrolink либо MDE. Вероятность идентификации точечных мутаций этим способом на фрагментах ДНК менее 300 п.о. достигает 80-90%. Детекция мутаций осуществляется как изотопным, так и неизотопными методами.

2.1.1.2 DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis)

Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза - основан на зависимости свойств плавления (или денатурации) небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А--Т- и G--C-пар в исследуемых фрагментах. Объясняется это тем, что G--C-связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т. Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях (рис. 17). Градиент денатурации достигается разницей температур, различной концентрацией мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют по-разному. Разработан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказать характер плавления в зависимости от нуклеотидной последовательности. При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре плавления - , т.е. такой температуре, при которой каждая пара оснований с 50% вероятностью может соединиться или разойтись. После начала плавления продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространственной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК.

В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Т.о. удается идентифицировать лишь около 50% однонуклеотидных замен во фрагментах ДНК длиной от 50 до нескольких сотен нуклеотидов. Связано это с тем, что при прохождении ДНК через гель может начаться частичная денатурация концов молекул еще до достижения оптимальной области плавления. Поэтому мутации, локализованные вблизи концов амплифицированных участков ДНК, оказывают меньшее влияние на процесс плавления и могут не выявляться. Эффективность обнаружения мутаций с помощью градиентного денатурирующего электрофореза может быть существенно повышена за счет присоединения к концам амплифицированной геномной ДНК синтетических фрагментов GC-нуклеотидов длиной в несколько десятков пар оснований. Эта модификация делает метод очень чувствительным. Чаще всего DGGE-метод применяется для скрининга мутаций в амплифицированных экзонах, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК.

Этот метод может быть с успехом применен также для анализа индуцированных мутаций, так как позволяет улавливать точечные мутации, возникшие даже в одной из 100 обработанных мутагеном клеток. К недостаткам метода следует отнести техническую сложность получения равномерного градиента денатурирующего агента в полиакриламидном геле, а также высокую стоимость искусственно синтезированных GC-концов.

2.1.1.3 CMC (Chemical Mismatch Cleavage)

Метод химического расщепления некомплементарных сайтов - основан на способности некоторых химических агентов специфически разрывать нить ДНК в месте локализации неспаренного основания (рис. 18). Так, цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, а тимин - к действию осмия тетраоксида. Некоторые модификации метода используют чувствительность тимина и гуанина к карбодиимиду. Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву молекулы ДНК в модифицированном сайте. Выявление мутаций осуществляют с помощью меченых ДНК-зондов, соответствующих, как правило, нормальным вариантам последовательности ДНК. Такими зондами могут быть синтезированные олигонуклеотиды, клонированные последовательности ДНК или ее амплифицированные фрагменты.

При проведении исследования эталонную меченую (*) ДНК смешивают с избытком тестируемой ДНК (или РНК). Тестируемыми образцами ДНК могут служить клонированные ДНК, обработанные соответствующими эндонуклеазами, либо амплифицированные фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых молекул и затем охлаждают, чтобы создать условия для образования дуплексов. При наличии мутаций в тестируемых образцах ДНК и гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК, образуются места негомологичного спаривания. После обработки соответствующими химическими агентами идентификация и локализация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК проводится путем электрофореза и радиоавтографии. Появление укороченных фрагментов ДНК на электрофореграмме (а точнее - необычных бэндов в нижней части геля) свидетельствует о наличии мутантного сайта, а определение размера укороченных фрагментов однозначно определяет локализацию этого сайта в исходной тестируемой молекуле ДНК. Современные модификации метода СМС позволяют идентифицировать до 95-100% мутаций. Большими преимуществами этого метода являются:

Ё возможность исследовать протяженные участки ДНК - до 2 тыс. п.о.;

Ё способность одновременно выявить и локализовать несколько мутаций в одном фрагменте ДНК;

Ё возможность одновременно использовать несколько ДНК-зондов для поиска мутаций - мультиплексный вариант методики.

К числу недостатков можно отнести высокую токсичность используемых химических реактивов. Последняя может быть частично ослаблена использованием карбодиимида для идентификации GT-гетеродуплексов.

Весьма близким по принципу к СМС-методу является метод расщепления гетеродуплексов РНКазой А. С этой целью создаются условия образования гетеродуплексов между тестируемой ДНК и комплементарной ей радиоактивно меченной РНК-пробой. При обработке РНКазой А происходит разрезание молекул РНК в местах нарушения спаривания оснований. Места точечных мутаций определяются, как в случае СМС, по размерам образовавшихся фрагментов после электрофореза и радиоавтографии. Необходимость использования радиоактивно меченной РНК-пробы и возможность детекции только около 50% точечных мутаций лимитируют широкое применение метода.

2.1.1.4 SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)

Метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, предложенный М. Орита с соавт., основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности однонитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотидных замен по пространственной организации молекул. Метод включает амплификацию специфических сегментов ДНК размером от 50 до 300 пар оснований, обычно в присутствии меченых dNTP, денатурацию образовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий электрофорез в полиакриламидном геле.

На процесс конформации оказывают влияние различные внешние факторы: температура, концентрация акриламида и глицерина в геле, ионная сила буферных растворов. Оптимальный подбор этих параметров позволяет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК, различающиеся даже всего на один нуклеотид. Конформационный метод быстро получил широкое распространение благодаря своей простоте и возможности обнаруживать любые типы замен. Эффективность детекции мутаций при размерах амплифицируемого фрагмента менее 200 п.о. составляет 70-95%, но при длине фрагмента превышающей 400 п.о., вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.

Молекулярное сканирование известных мутаций