Вспомогательные белки репликации ДНК

Праймаза DnaG инициирует синтез затравок РНК преимущественно (в 60% случаев) на тринуклеотидном сайте 3'-GTC в матричной нити ДНК. В геноме E. coli имеются 205 тысяч таких сайтов на среднем расстоянии 23 н. друг от друга, чего достаточно для быстрой инициации синтеза РНК всех фрагментов Оказаки. Праймазы фагов Т7 и Т4 инициируют синтез праймерных РНК на других триплетах: 3'-T(C/T)G 3'-GTC соответственно. Различная специфичность этих праймаз частично объясняется разной структурой петли длиной 17 н. в мотиве цинкового пальца.

Первый остаток G в сайте инициации существенен только для узнавания стартового сайта белком DnaG и не используется для включения нуклеотида в РНК. Синтез праймерной РНК de novo начинается на напротив второго остатка Т. На растущем 3'-конце РНК вначале образуется динуклеотид AG. Эта стадия, как и при инициации транскрипции РНК-полимеразами, является лимитирующей скорость синтеза праймера. Последующие 10 фосфодиэфирных связей образуются гораздо быстрее, и праймаза DnaG синтезирует затравку РНК длиной 111 н. Этот размер примерно соответствует длине гибрида ДНК-РНК, помещающегося в полости молекулы DnaG. Затем праймаза переходит в дистрибутивную моду и синтез РНК замедляется или прекращается. Обычно это сопровождается вытеснением праймазы с матрицы ДНК, механизм которого мы рассмотрим в главе 4. Короткая затравка РНК предается к ДНК-полимеразе III, которая синтезирует ДНК фрагмента Оказаки. Для эффективного синтеза РНК праймаза DnaG нуждается в физическом контакте с ДНК-геликазой DnaВ.

Аналогично идет синтез праймерной РНК эукариотической праймазой. Однако она не требует для инициации специфических последовательностей в матрице ДНК и обычно начинает синтез напротив пиримидинов, так что на 5'-конце РНК-затравки всегда присутствует пурин. Эукариотическая праймаза в присутствии ДНК-полимеразы также синтезирует короткие праймерные РНК с «единичной длиной», равной 7-10 н. Вместе с тем, в отсутствие ДНК-полимеразной активности эта праймаза способна элонгировать «единичные» праймеры РНК. Отметим, что бактериальные и эукариотические праймазы являются неточными полимеразами и в среднем включают один ошибочный нуклеотид на 30 н. вновь синтезированной РНК.

4. ДНК-лигазы

ДНК-лигазы катализируют образование фосфодиэфирной связи в однонитевом разрыве (ОР) днДНК между смежными 3'-гидроксильным и 5'-фосфатным концами разорванной нити. Для связывания ДНК-лигаз с ОР в днДНК абсолютно необходима 5'-фосфатная группа, а 3'-ОН-группа не обязательна. Однако обе группы требуются для реакции лигирования. ДНК-лигазы воссоединяют в ДНК только ОР, но не бреши, и пробел длиной даже в 1 н. полностью устраняет связывание фермента с ДНК. ДНК-лигазы участвуют в воссоединении фрагментов Оказаки, образующихся во время синтеза отстающей нити в процессе репликации. Кроме того, ДНК-лигазы устраняют ОР ДНК в процессах репарации и рекомбинации.

Прототипом бактериальных ДНК-лигаз является продукт гена ligA (ранее lig), расположенного на 51-ой мин генетической карты E. coli. Эта ДНК-лигаза имеет длину 671 остаток (мол. м. 73,7 кД), вызывает воссоединение ОР во всех процессах метаболизма ДНК (репликации, репарации и рекомбинации) и является абсолютно необходимой для роста клеток. В последнее время в полностью секвенированном геноме E. coli была обнаружена открытая рамка считывания, названная ligB и кодирующая вторую, более короткую ДНК-лигазу длиной 562 аминокислотных остатка, гомологичную LigA. Лигаза LigB также катализирует воссоединение ОР в ДНК in vitro, но её физиологическая роль пока не установлена.

У млекопитающих идентифицированы 4 разных типа ДНК-лигаз, содержащихся в ядерных экстрактах клеток. Главной функцией ДНК-лигазы I явлется воссоединение фрагментов Оказаки, хотя она участвует и в репарации ДНК. ДНК-лигаза I человека имеет длину 919 остатков (мол. м. 102 кД) и кодируется геном LIG1, расположенным в хромосоме 19 и содержащим 27 интронов. ДНК-лигазы III?, участвующая в эксцизионной репарации ДНК, и III?, (известная также как ДНК-лигаза II) кодируются альтернативно сплайсированными мРНК одного и того же гена, и их аминокислотные последовательности различаются только на С-конце. ДНК-лигаза IV по субстратной специфичности отличается от ДНК-лигаз I и III и у мышей является существенным белком. Она участвует в негомоогическом соединении концов ДНК во время репарации двунитевых разрывов ДНК.

У дрожжей S. cerevisiae отсутствуют гомологи ДНК-лизаз III млекопитающих, а гомолог ДНК-лигазы IV кодируется геном DNL4/LIG4 и также участвует в негомологическом соединении концов ДНК. Главная ДНК-лигаза I у дрожжей кодируется ядерным геном CDC9. Продуктами этого гена являются два белка, которые транслируются в одной рамке считвания, но с использованием разных инициирующих кодонов. При инициации трансляции на первом кодоне АУГ образуется белок длиной 755 остатков, имеющий на N-конце функциональную предпоследовательность, которая нацеливает белок на экспорт в митохондрии. При инициации трансляции на втором кодоне АУГ образуется белок длиной 732 остатка, локализующийся в ядре. После отщепления пропоследовательности в митохондриях первая форма ДНК-лигазы I становится тождественной главной ядерной форме.

Для активности ДНК-лигаз необходимы нуклеотидные кофакторы, в зависимости от природы которых лигазы можно разбить на два класса. ДНК-лигазы эукариотов, археев, бактериофагов, эукариотических вирусов и некоторых эубактерий используют в качестве кофакторов АТФ и относятся к классу I. ДНК-лигазы класса II, кофактором которых служит НАД⁺, имеются исключительно у эубактерий. ДНК-лигазы LigA и LigB у E.coli принадлежат к этому классу. АТФ-зависимые ДНК-лигазы гетерогенны по размеру (от 30 до >100 кД), а НАД-зависимые ДНК-лигазы являются высокогомологичными мономерными ферментами с мол. массами 70-80 кД. ДНК-лигазы двух разных классов почти не гомологичны друг другу, за исключением 5 из 6 мотивов последовательности, образующих активный центр суперсемейства нуклеотидилтрансфераз (см. рис. 2.00). Эти мотивы сохраняются и у кэпирующих ферментов эукариотических мРНК, к-рые близки к ДНК-лигазам по механизму действия, но используют в качестве субстрата ГТФ.

Механизм реакции, катализируемой ДНК-лигазами разных классов, состоит из 3 последовательных стадий (рис. 2.20). Первая стадия заключается в активации лигазы - аденилировании с образованием ковалентного интермедиата фермент - АМФ (Е-АМФ), в котором остаток АМФ связан фосфоамидной связью с ?-аминогруппой консервативного остатка лизина в консервативном мотиве I активного центра. АТФ-зависимые эукариотические и архейные лигазы используют АТФ при образовании комплекса Е-АМФ и освобождают на первой стадии пирофосфат. Для бактериальных ДНК-лигаз донором АМФ в реакции аденилирования служит НАД⁺, при расщеплении которого освобождается НМН⁺. Последующие две стадии одинаковы для лигаз обоих классов.

Во время второй стадии АМФ переносится из комплекса Е-АМФ на 5'-концевую фосфатную группу ОР ДНК с образованием ковалентного интермедиата ДНК-АМФ с (5'5')-фосфоангидридной связью. Этот интермедиат является гораздо более короткоживущим, чем комплекс Е-АМФ. На заключительной стадии свободная 3'-гидроксильная группа ОР атакует (5'5')-связь в активированном комплексе ДНК-АМФ. Это сопровождается образованием фосфодиэфирной связи, устраняющей ОР в ДНК, и освобождением АМФ.

Несмотря на различия ДНК-лигаз двух разных классов, они выполняют близкие функции и могут замещать друг друга. Так, условно-летальный мутант E. coli, дефектный по НАД-зависимой лигазе LigA, полностью комплементируется активным фрагментом ДНК-лигазы I человека, а ДНК-лигаза LigA E. coli в свою очередь поддерживает митотический рост мутантов дрожжей с делециями генов CDC9 и LIG4, дефектных по АТФ-зависимым ДНК-лигазам I и/или IV. Однако бактериальная лигаза не исправляет дефект этих мутантов по экспцизионной репарации. Вероятно, для комплементации репаративного дефекта необходимы специфические взаимодействия ДНК-лигазы с родственными репаративными ферментами.

Рассмотрим более детально строение ДНК-лигаз и механизм последней стадии катализируемых ими реакций на примере НАД-зависимой ДНК-лигазы Tfi из термофильной бактерии Thermus filiformis - первой ДНК-лигазы, для которой методом рентгеноструктурного анализа установлена 3-мерная структура. Этот фермент, как и все ДНК-лигазы, имеет модульную организацию и состоит из 4 основных доменов (рис. 2.21). Он имеет длину 667 аминокислотных остатков (мол. м. 75,9 кД).

Рис. 4. Структура ДНК-лигазы Tfi из T. filiformis.

А. Домены и консервативные мотивы ДНК-лигазы Tfi. 1а - субдомен связывания НАД⁺, 1b - субдомен аденилирования, 2 - домен связывания олигонуклеотидов с укладкой ОВ, 3 - домен с цинковым пальцем и мотивом HhH спираль-шпилька-спираль, 4 - домен гомологии с белком BRCT; I, III, IV, V и VI - консервативные мотивы суперсемейства нуклеотидилтрансфераз.

B. Трехмерная структура ДНК-лигазы Tfi. Указано положение отдельных доменов

Самым большим является N-концевой домен 1, состоящий из двух субдоменов. На самом конце находится субдомен 1а длиной 73 остатка, являющийся сайтом связывания кофактора НАД⁺. Субдомен 1b (остатки 73-317) образован 3 антипараллельными -слоями и несколькими фланговыми -спиралями и является доменом аденилирования. Субдомен 1b содержит остаток лиз₁₁₆ активного центра, подвергающийся аденилированию. Следующий домен 2 является доменом связывания олигонуклеотидов, т.к. он имеет укладку связывания олигомеров ОВ, похожую на укладку взаимодействия с онДНК у связывающих он ДНК белков. Домены 1 и 2 содержат все 5 консервативных мотивов нуклеотидилтрансфераз и вместе образуют минимальный домен ДНК-лигазы, достаточный для каталитической активности, т.к. в их пределах расположены все каталитически существенные аминокислотные остатки и остатки, необходимые для специфического связывания ДНК-лигазы с ОР ДНК. Домены 1 и 2 физически взаимодействуют друг с другом, что вызывает значительное повышение аденилирующей активности домена 1. Для такого взаимодействия необходимо сильное изменение конформации белка со смещением С-концевой части домена 2 в сторону домена 1.

Домен 3 (остатки 403-581) является вторым «некаталитическим» контактным участком, обеспечивающим связывание ДНК-лигазы с ДНК. Он образован 2 сегментами белка. Область остатков 403-429 содежит 4 консервативных остатка цистеина, образующих цинковый палец типа Сys₄, а смежная область остатков 429-581 включает 4 копии мотива спираль-шпилька-спираль. Обе структуры часто используются белками для взаимодействия с ДНК. На самом С-конце ДНК-лигазы Tfi расположен необычный домен 4, или BRCT, гомологичный C-концевому домену эукариотического белка BRCA1, ассоциированного с раком молочной железы. Он состоит из 4-нитевого параллельного -слоя и трех -спиралей и имеется у очень многих лигаз. Домен 4 очень подвижен в так называемой «открытой» конформации ДНК-лигазы и сближен с N-концевым доменом 1а в «закрытой» конформации, в которой лигаза принимает тороидальную форму. Предполагается, что домен 4 играет в лигазе роль ворот, регулирующих связывание и освобождение днДНК. Подобно белку PCNA, в закрытой конформации ДНК-лигаза может образовывать скользящий зажим на ДНК и двигаться по ДНК до тех пор, пока она не встретит ОР. Аналогичную доменную структуру имеет ДНК-лигаза LigA E. coli, а в лигазе LigB отсутствуют два остатка цистеина цинкового пальца и весь С-концевой домен BRCT.

Известная 3-мерная структура ДНК-лигазы Tfi позволила предложить следующую гипотетическую схему (рис. 2.22), которая, вероятно, является общей для многих типов ДНК-лигаз. В исходном состоянии (А) лигаза находится в закрытом неактивном состоянии и неспособна связываться с ДНК. Аденилирование под действием НАД⁺ или АМФ (стадия I) переводит лигазу в открытое активированное состояние (В), в котором она неспецифически связывается с днДНК, вновь переходит в закрытое состояние С (стадия II) и транслоцируется по днДНК до тех пор, пока не встретит ОР в одной из нитей. Узнавание ОР в ДНК (стадия III) сопровождается изгибанием ДНК и изменением конформации белка на контактной поверхности между доменами 1 и 2. В результате 5'- и 3'-концы ОР оказываются в щели между этими доменами и сближаются с аденилированным остатком лиз₁₁₆. Это обеспечивает деаденилирование белка и перенос АМФ на 5'-конец разорванной нити (стадия IV). В этом состоянии лигаза связывает катионы Mg²⁺, необходимые для атаки 3'-гидроксильной группы нити ДНК на активированный АМФ 5'-конец онДНК (стадия V). В результате происходит воссоединение ОР, освобождение неорганического фосфата p_i и изменение конфирмации лигазы с переходом в открытую форму (F). Лигированная ДНК освобождается от ДНК-лигазы, которая возвращается в исходное неактивное закрытое состояние А (стадия VI).

Рис. 5. Модель каталитического цикла ДНК-лигазы Tfi.

I - аденилирование, II -связывание с ДНК, III - узнавание ОР и изгибание ДНК, IV - изменение конформации и деаденилирование фермента, V - воссоединение ОР и переход в открытую форму, V - освобождение ДНК.

1-4- домены ДНК-лигазы (см. рис. 2.21), 5 - ДНК с ОР; р_i - неорганический фосфат. Стрелками указано положение связанной ДНК и АМФ в аденилированном ферменте

Рассмотрим более детально молекулярный механизм последней стадии лигирования - деаденилирования интермедиата ДНК-АМФ и образования фосфодиэфирной связи между концами ОР (рис. 2.23). В общих чертах, эта реакция протекает с участием 2-валентных катионов металлов так же, как и стадия полимеризации, катализируемой ДНК-полимеразами (см. 1.00). В механизме участвуют два катиона Mg²⁺, координационно связанные с карбоксильными группами остатков глу₂₈₁, асп₂₈₃ и асп₁₁₈ в домене 1 ДНК-лигазы Tfi. Эти три остатка образуют отрицательно заряженный карман, расположенный рядом с аденилируемым остатком лиз₁₁₆. Аденилированный интермедиат ДНК-АМФ в лигировании соответствует включаемому в ДНК 5'-дНТФ в реакции синтеза ДНК. В активный центр ДНК-лизазы Tfi входит также положительно заряженный остаток арг₁₉₆, которые на предыдущей стадии узнавания ОР в ДНК мог электростатически взаимодействовать с отрицательно заряженным 5'-фосфатным концом ДНК. Аналогичную архитектуру активного центра, вероятно, имеют все ДНК-лигазы.

Рис. 6. Модель активного центра ДНК-лигазы Tfi на заключительной стадии IV (рис. 2.21) воссоединения ОР.

5. ДНК-топоизомеразы

Рис 7. Образование (+)-супервитков перед рекликативной вилкой и прекатенанов позади неё в процессе репликации и появление структуры «куриной лапы» после остановки репликативной вилки и разборки реплисомы

Таблица 2 Свойства и функции ДНК-топоизмераз

Рис. 8. Механизмы стадий расщепления и лигирования нити ДНК ДНК-топоизомеразами

Рис. 9. Доменная структура ДНК-топоизомераз типа IA.

А - ДНК-топоизомераза I E. coli, B - ДНК-топоизомераза III E. coli, C - ДНК-топоизомераза III человека.

1 - домен расщепления и прохождения нитей, 2 - домен связывания Zn²⁺, 3 - С-концевой домен

Рис. 10. Трехмерная структура фрагмента остатков 32-509 ДНК-топоизомеразы I E. coli.

Указано положение доменов I (остатки 32-63 и 72-157), II (остатки 214-278, 406-433 и 438-475), III (остатки 279-405 и 433-437) и IV (остатки 64-71, 158-213 и 476-560) и междоменных шарниров II/III II/IV, а также каталитического остатка тирозина (Y)

Рис. 11. Последовательныке стадии релаксации одного витка негативно суперспирализованной ДНК ДНК-топозомеразой I E. coli.

I, II, III и IV - домены топоизомеразы I, указанные на рис. 2.27. Отмечено положение 3'- и 5'-концов разрезаемой нити ДНК

Рис. 12. Организация доменов ДНК-топоизомераз типа II.

А - ДНК-топоизомераза II S. cerevisiae, B - ДНК-топоизомераза IV E. coli, С - ДНК-гираза E. coli.

I - АТФазный домен, II - домен связывания и расщепления ДНК, состоящий из субдоменов A' и B', которые соответствуют N-концевой области GyrA иС-концевой области GyrB ДНК-гиразы E. coli, IV - уникальная вставка в С-концевой области субъединицы GyrB ДНК-гиразы E. coli

Рис. 13. Трехмерная структура субъединиц ДНК-гиразы E. coli.

А - димер N-концевой половины (остатки 1-392) субъединицы GyrB,

В - димер фрагмента остатков 30-522 субъединицы GyrA

Рис. 14. Механизм переноса Т-сегмента ДНК через расщепляемый G-сегмент ДНК-топоизомеразами типа IIA.

I - АТФазные домены (N-ворота), II - домены захвата ДНК, III - области B', IV -

области САР, V - C-ворота. G-сегмент ДНК изображен черной прямой, а Т-фрагмент ДНК - серой прямой. N-ворота открыты на стадиях а-с и закрыты на стадиях d-f, а С-ворота открыты только на стадии f

Литература

Matson S.W. DNA helicases of Escherichia coli // Progr. Nucleic Acids Res. Mol. Biol., v. 40, 289-326, 1991

Lohman T.M. Helicase-catalyzed DNA unwinding // J. Biol. Chem., v. 268, 2269-2272, 1993

West S.C. DNA helicases: new breeds of translocating motors and molecular pumps // Cell, v. 86, 177-180, 1996

Lohman T.M., Bjornson K.P. Mechanism of helicase-catalyzed DNA unwinding // Ann. Rev. Biochem., v. 65, 169-214, 1996

Patel S.S., Picha K.M. Structure and function of hexameric helicases // Ann. Rev. Biochem., v. 69, 651-697, 2000

Hall M.C., Matson S.W. Helicase motifs: the engine that powers DNA unwinding // Mol. Microbiol., v. 34, 867-877, 1999

Kersey S.E., Labib K. MCM proteins: evolution, properties, and role in DNA replication // Biochim. Biophys. Acta, v. 1398, 113-136, 1998

Tye B.K., Sawyers S. The hexameric eukaryotic MCM helicase: building symmetry from nonidentical parts // J. Biol. Chem., v. 275, 34833-34836, 2000

Labib K., Diffley J.F.X. Is the MCM2-7 complex the eukaryotic DNA replication fork helicase? // Curr. Opin. Genet/ Devel., v. 10, 64-70, 2001

von Hippel P.H., Delagoutte E. A general model for nucleic acids helicase and their “coupling” within macromolecular machines // Cell, v. 104, 177-190, 2001

Chase J.W., Williams K.R. Single-stranded DNA binding proteins required for DNA replication // Ann. Rev. Biochem., v. 55, 103-136, 1986.

Lohman T.M, Bujalowski W., Overman L.B. E. coli single strand binding protein: a new look at helix-stabilizing proteins // Trends Biochem. Sci., v. 13, 250-255, 1988.

Wold M.S. Replication protein A: a heterodimeric, single stranded DNA-binding protein required for eucaryotic DNA metabolism // Ann. Rev. Biochem., v. 66, 61-92, 1997.

Raghunathan S., Ricard C.S., Lohman T.M., Waksman G. Crystal structure of the homo-tetrameric DNA binding domain of Escherichia coli single-stranded DMA binding protein determined by multiwavelength x-ray diffraction on the selenomethionine protein at 2.9-A resolution // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 94, 6652-6657, 1997.

Shamoo Y., Friedman A.M., Parsons M.R., Konigsberg W.H., Steitz T.A. Crystal structure of a replication fork single-stranded DNA binding protein (T4 gp32) complexed to DNA // Nature, v. 376, 362-366, 1995.

Bochkareva E., Belegu V., Korolev S., Bochkarev A. Structure of the major single stranded DNA-binding domain of replication protein A suggests a dynamic mechanism for DNA binding // EMBO Journal, v. 20, 612-618, 2001.

Griep M.A. Primase structure and function // Indian J. Biochem. Biophys., v. 32, 171-178, 1995.

Arezi B., Kuchta R.D. Eucaryotic DNA primase // Trens Biochem. Sci., v. 25, 572-576, 2000.

Frick D.N., Richardson C.C. DNA primases // Ann. Rev. Biochem., v. 70, 39-80, 2001.

Aravind L., Leipe D.D., Koonin E.V. Toprim - a conservative domain in type IA and II topoisomerases, DnaG-type primases, OLD family nucleases and RecR proteins // Nucl. Acids Res., v. 26, 4205-4213, 1998.

Lehman I.R. DNA ligase: structure, mechanism, and function // Science, v. 186, 790-797, 1974

Lindahl T., Barnes D.E. Mammalian DNA ligases // Ann. Rev. Biochem., v. 61, 285-281, 1992.

Doherty A.J., Suh S.W. Structural and mechanistic conservation in DNA ligases // Nucleic Acids Res., v. 28, 4051-4058, 2000

Shuman S., Schwer B. RNA capping enzyme and DNA ligase: modular architecture and functional implications // Mol. Microbiol., v. 17, 405-410, 1995.

Lee J.Y., Chang C., Song H.K. et al. Crystal structure of NAD⁺-dependent DNA ligase: modular architecture and functional implications // EMBO Journal, v. 19, 1119-1129, 2000.

Postow L., Crisona N.J., Peter B.J., Hardy C.D., Cozzarelli N.R. Topological challenges to DNA replication // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 98, 8219-8236, 2001.

Wang J.C. DNA topoisomerases // Ann. Rev. Biochem., v. 65, 635-692, 1996

Berger J.M. Structure of DNA topoisomerases // Biochim. Biophys. Acta, v. 1400, 3-18, 1998

Champoux J.J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism // Ann. Rev. Biochem., v. 70, 369-413, 2001.

Tse-Dinh Y.-C. Bacterial and archeal type I topoisomerases // Biochim. Biophys. Acta, v. 1400, 19-27, 1998.

Levine C., Hiasa H., Marians K.J. DNA gyrase and topoisomerase IV: biochemical activities, physiological roles during chromosome repkication, and drug sensitivities // Biochim. Biophys. Acta, v. 1400, 29-43, 1998.

Nitiss J.L. Investigating the biological functions of DNA topoisomerases in eukariotic cells // Biochim. Biophys. Acta, v. 1400, 63-81, 1998.