Порівняльна характеристика методів діагностики та їх удосконалення при хламідіозі сільськогосподарських тварин

У контрольних групах, заражених чистими штамами хламідій, а також штамами з комплементом, всі миші гинули у визначені терміни. В інших групах, заражених роздільно комплементом або гіперімунною сироваткою, всі тварини залишались живими.

Сума економічних збитків від хламідіозу свиней в одному із господарств Чорнобаївського району від загибелі, вимушеного забою, недоодержання приплоду та зниження продуктивності тварин становила за рік 168 214,84 грн.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у встановленні наявності хламідіозу серед великої рогатої худоби і свиней, інших видів тварин у господарствах Черкаської області на підставі проведеного епізоотологічного моніторингу та результатів комплексних лабораторних досліджень. Визначено діагностичну цінність клініко-епізоотологічних та патолого-анатомічних даних, оцінені методи діагностики хламідіозу з використанням світлової, люмінесцентної мікроскопії, серологічних реакцій, розроблено удосконалений варіант реакції імуноферментного аналізу (ІФА). Вивчено імунологічні, загальнобіологічні властивості виділених штамів хламідій, здійснено їх ідентифікацію з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та реакції імунофлуоресценції (РІФ).

2. Із епізоотологічних особливостей для хламідіозу тварин в умовах Черкаської області характерно: інфекція уражає всі вікові і статеві групи тварин, між якими чітко простежується міжвидова передача. Доведена можливість виникнення природних вогнищ хламідіозу, стаціонарність яких підтримується голубами та деякими видами диких тварин (косулі, дикі свині). Із організму хворих тварин збудник виділяється через шлунково-кишковий тракт, з бронхіальним, вагінальним та кон'юнктивальним слизом, абортованими плодами, молоком, спермою плідників. Зараження тварин відбувалось через інфіковані корми, повітря, воду, предмети догляду, аліментарним, аерогенним, статевим та контактним шляхами.

3. Хламідіоз проявляється як змішана інфекція, одночасно з хламідіями виділялись ротаві руси, вірус ІРТ, парагрипу-3. Змішаний характер інфекції підтверджувався вірусологічними і серологічними дослідженнями. При дослідженні парних сироваток титри антитіл до названих збудників підвищувались в діагностично достовірних величинах. 4. Клінічні ознаки та патолого-анатомічні зміни при хламідіозі у великої рогатої худоби та свиней наближені за системністю ураження організму, інфекція може проявлятись у генітальній, респіраторній, нервовій і змішаній формах, виразність яких знаходиться в прямій залежності від інтенсивності прояву патологічних процесів. При гострій формі хвороба проявляється клінічними ознаками, які зтушовуються при хронічній формі і не проявляються при латентній формі. Такий стан необхідно враховувати при комплексній діагностиці хламідіозу, розцінюючи клініко-епізоотологічні та патолого-анатомічні дані як передмову до постановки діагнозу, остаточний висновок відносно якого здійснюється після проведення лабораторних досліджень.

5. При порівняльній характеристиці методів, які використовують для виявлення хламідій, встановлено, що метод Романовського-Гімза знаходить внутрішньоклітинні структури хламідій, проте показав низьку інформативність при виявленні позаклітинно розташованих хламідій, які можуть бути подібними до різних клітинних елементів, у мазках із стінки жовткового мішка курячих ембріонів. Більш результативні методи Стемпа і Маккіавелло, при яких хламідії і різні можливі артефакти фарбуються диференційовано.

6. Реакція імунофлуоресценції (РІФ) дозволяє швидко виявити та ідентифікувати хламідії за рахунок високої її специфічності. Провідного діагностичного значення набуває полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), яка дозволяє дати позитивний висновок відносно хламідіозу за наявності мінімальної кількості збудника в досліджуваному матеріалі та визначити його не тільки рід, але й вид.

7. Порівняльна оцінка серологічних методів діагностики хламідіозу показала низьку чутливість реакції зв'язування комплементу (РЗК) порівняно до реакцій РНГА та ІФА. Зокрема, при дослідженні 4990 проб сироватки крові великої рогатої худоби позитивними в РЗК виявились лише 350 (7 %) проб, в ІФА - 67,3 % проб. Граничні титри антитіл в РЗК також були відносно низькими (5-6 log₂), на фоні до 8 log₂ в ІФА та РНГА. При дослідженні 2541 проби сироватки крові свиней позитивними в РЗК виявились лише 3,0 % проб, у той час як у РНГА позитивних проб було 21,52 %, в ІФА - 24,3 %.

8. Удосконалено лабораторну діагностику хламідіозу сільськогоспо-дарських тварин. Результати досліджень використані в процесі конструювання тест-системи «ІФА Chlamyliso test AB», яка впроваджена в практику ветеринарної медицини України. Нами виділено штам хламідій, який використали для приготування антигену, одержали позитивну хламідіозну і негативну сироватки. Система пройшла виробниче випробування в ряді обласних лабораторій ветеринарної медицини України і рекомендована для практичного використання. На одержану систему розроблено технічні умови ТУУ 24.4-23524007-066:2006.

9. Від великої рогатої худоби і свиней виділено по 2 штами хламідій, ідентифікація яких здійснювалась за морфологічними, культуральними і антигенними характеристиками з використанням прямого варіанта РІФ. За даними ПЛР-аналізу штами належать до роду Chlamydophila. Штами серійно культивувались у жовтковому мішку курячих ембріонів, середньостатистична загибель яких коливалась в межах 4,1-4,5 діб. Титр штамів наростав з пасажами і становив для штамів ВС-2099 і Т-1549 в 9-му пасажі 10^-5,5 і 10^-5,33 ELD₅₀/0,4 мл, відповідно; для штаму А-2536 в 6-му пасажі 10^-4,16 ELD₅₀/0,4 мл; для штаму ДС-2562 в 11 пасажі - 10^-6,3 ELD₅₀/0,4 мл.

10. При різних способах зараження білих мишей виділені штами хламідій в 1-му пасажі практично не викликали загибелі тварин і 100 % летальність наставала тільки в 5-8-му пасажах після зараження в черевну порожнину або інтраторакально. Білі миші проявляли відносну резистентність до інтрацеребрального зараження, при якому загибелі не спостерігалось в 1-му пасажі, але летальність поступово наростала в наступних пасажах. У вагітних морських свинок штам Т-1549 після зараження в черевну порожнину викликав аборти вже в 1-му пасажі, решта штамів абортогенність проявляли в наступних пасажах. Летальність морських свинок становила 30-40 %. 11. При визначенні імунологічних властивостей штамів хламідій в дослідах перехресного зараження білих мишей, які попередньо були імунізовані цими штамами, встановлена спорідненість штамів ВС-2099 і Т-1549, виділених від великої рогатої худоби, в той час як штами А-2536 і ДС-2562, виділені від свиней, виявились між собою наближеними, але значно віддаленими від штамів великої рогатої худоби. Аналогічні результати були одержані і при постановці реакції нейтралізації на білих мишах з використанням сироватки крові півнів, гіперімунізованих названими вище штамами.

12. При зараженні штамом А-2536 3-х груп поросят-гнотобіотів різними способами відмічали зниження апетиту, незначне пригнічення, субфебрильна температура тіла. В одного поросяти хвороба проявилась гостро і воно загинуло на 21-шу добу. Позитивність експерименту підтверджувалась патолого-анатомічними змінами, наявністю в них хламідій, виявлених мікроскопічними методами, ПЛР, РІФ, виділенням хламідій на курячих ембріонах, білих мишах і морських свинках.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Діагностику хламідіозу сільськогосподарських тварин здійснювати з використанням комплексних досліджень, в яких на підставі клініко-епізоотологічних та патолого-анатомічних даних ставиться попередній діагноз.

2. При проведенні лабораторних досліджень з метою виявлення збудника безпосередньо в патологічному матеріалі використовувати в першу чергу реакцію імунофлуоресценції (РІФ) та полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Методам світлової мікроскопії з фарбуванням препаратів за Романовським-Гімза, Стемпом, Маккіавелло відводиться другорядне значення.

3. При проведенні серологічної діагностики сироватку крові досліджувати з використанням непрямої гемаглютинації (РНГА) та імуноферментного аналізу (ІФА). Реакцію зв'язування комплементу (РЗК), як низькочутливу, рекомендуємо ставити лише при дослідженні сироватки крові великої рогатої худоби.

4. При постановці реакції ІФА доцільно використовувати набір компонентів «Chlamyliso test AB», розроблений колективом співробітників НАУ з нашою участю. Запропонований варіант ІФА є уніфікованим і дозволяє досліджувати сироватку крові всіх сільськогосподарських тварин на тій підставі, що в реакції використано рекомбінантний білок G мічений пероксидазою, який здатний зв'язуватись з широким спектром Іg G ссавців. На одержану систему розроблено ТУУ 24.4-23524007-066:2006. Система пройшла виробничі випробування.

5. При проведенні комплексної діагностики на хламідіоз використовувати «Настанову із лабораторної діагностики хламідійних інфекцій сільськогосподарських тварин», розробленої за нашою участю і затверджену Департаментом ветеринарної медицини МінАПК України.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Неволько О.М. Економічні збитки при хламідіозі свиней / Неволько О.М. - Вет. біотехнол.-2008.-№12.-С.130-133.

2. Бортнічук В.А. Діагностичне значення реакції зв'язування комплементу (РЗК) при хламідіозі тварин / Бортнічук В.А., Неволько О.М., Хамко О.П. - Збірник наукових праць Луганського Національного аграрного університету.-2007.-№78/101.-С.68-72. (Здобувач провів дослідження з метою порівняльної оцінки серологічних методів діагностики хламідіозу, статистичну обробку одержаних результатів, підготував роботу до друку).

3. Бортнічук В.А. Хламідіоз великої рогатої худоби / Бортнічук В.А., Неволько О.М. - Сучасна вет. медицина.-2007.-№2.-С.22-23. (Здобувач вивчив джерела та форми хламідіозу великої рогатої худоби та основні причини його виникнення, визначив діагностичну цінність клініко-епізоотологічних та патолого-анатомічних даних, лабораторних досліджень, провів статистичну обробку одержаних результатів, підготував роботу до друку).

4. Неволько О.М. Діагностика хламідіозу у тварин різних видів залежно від форми прояву інфекції / [Неволько О.М., Хамко О.П., Бортнічук В.А., Чумак Р.М.] - Науковий вісник Національного аграрного університету.-2007.-№108.-С.240-244. (Здобувач провів клінічний огляд, патолого-анатомічний розтин, дослідив патологічний матеріал методами світлової і люмінесцентної мікроскопії, провів статистичну обробку одержаних результатів, підготував роботу до друку).

5. Неволько О.М. Хламідіоз свиней у Черкаській області: особливості прояву та діагностика / Неволько О.М., Хамко О.П. - Вет. біотехнол.-2006.-№9.-С.189-195.

6. Чумак Р.М. Застосування модифікованого імуноферментрного аналізу (на основі рекомбінантного білку G Streptococcus sp.) для діагностики хламідіозу у сільськогосподарських тварин з господарств Черкаської області / [Чумак Р.М., Бортнічук В.А., Рибальченко Д.Ю, Мартиненко Д.Л., Неволько О.М., Хамко О.П.] - Вет. біотехнол.-2007.-№11.-С.237-243. (Здобувач брав участь у розробці тест-системи «ІФА Clamyliso test AB», провів експериментальні дослідження, порівняв результати з реакцією зв'язування комплементу, провів статистичну обробку одержаних результатів, підготував роботу до друку).

7. Неволько О.М. Діагностичне значення клініко-епізоотологічних та патолого-анатомічних даних при хламідіозі сільськогосподарських тварин / Неволько О.М., Хамко О.П., Бортнічук В.А. - Вет. біотехнол.-2007.-№11.-С.129-133. (Здобувач провів епізоотичне обстеження господарств, порівняв клініко-епізоотологічні, патолого-анатомічні дані при хламідіозі у різних видів тварин, провів статистичну обробку одержаних результатів, підготував роботу до друку).

8. Ксьонз І. Штучне відтворення хламідіозу в лабораторному досліді на поросятах-гнотобіотах / [Ксьонз І., Курман А., Хандкарян В., Скрипка М., Неволько О.] - Вет. мед. України.-2008.-№4.-С.38-40. (Здобувач виділив польові ізоляти збудника хламідіозу, провів лабораторні дослідження патологічного матеріалу від поросят-гнотобіотів, узагальнив одержані результати, підготував роботу до друку).

9. Неволько О. Міжвидова передача хламідіозу тварин / Неволько О., Хамко О., Бортнічук В. - Вет. мед. України.-2007.-№2.-С.6-7. (Здобувач підтвердив можливість міжвидової передачі хламідіозу, виділив культуру хламідій, проаналізував матеріали, підготував роботу до друку).

АНОТАЦІЇ

Неволько О.М. Порівняльна характеристика методів діагностики та їх удосконалення при хламідіозі сільськогосподарських тварин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. - Національний аграрний університет, Київ, 2008.

Встановлена наявність хламідіозу у більшості районів Черкаської області, в першу чергу, серед великої рогатої худоби та свиней. Підтверджена можливість міжвидової передачі хламідіозу, створення його природних вогнищ, стаціонарність в яких підтримується синантропною птицею, особливо голубами, та деякими видами диких тварин (косулі, дикі кабани). Визначені шляхи виділення хламідій із організму та фактори його передачі.

Клініко-епізоотологічні та патолого-анатомічні дані при хламідіозі самостійного діагностичного значення не мають, але обов'язково враховуються в процесі комплексної діагностики з проведенням лабораторних досліджень.

Критично оцінені діагностичні методи світлової та люмінесцентної мікроскопії, визначені можливі артефакти, на які потрібно звертати увагу при прямому дослідженні препаратів на хламідіоз. Особливої діагностичної цінності при цьому надається реакції імунофлуоресценції (РІФ) та полімеразно-ланцюговій реакції (ПЛР).

Доведена відносно низька чутливість реакції зв'язування комплементу (РЗК) при серологічній діагностиці хламідіозу на фоні високочутливих реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) та реакції імуноферментного аналізу (ІФА). Так, при дослідженні 4990 сироватки крові великої рогатої худоби позитивними в РЗК виявились лише 330 проб (7 %), в ІФА - 67,3 % проб. Граничні титри антитіл у РЗК становили 5-6 log₂, в ІФА - до 8 log₂, в РНГА - до 10 log₂.

Розроблено уніфікований варіант ІФА, в якій антивидова сироватка замінена на рекомбінантний білок G, аналог мембранного білка Streptococcus sp., міченого пероксидазою. На одержану систему розроблено і затверджені технічні умови ТУУ 24.4-23524007-066:2006.

Від великої рогатої худоби і свиней виділено 4 штами хламідій, у яких вивчені основні біологічні та імунологічні властивості. На підставі проведеного ПЛР-аналізу штами належать до роду Chlamydophila.

При зараженні поросят-гнотобіотів одним із виділених штамів хламідій одержали не типовий прояв хвороби, проте позитивність біопроби підтвердилася виявленням хламідій в мазках із внутрішніх органів методами РІФ, ПЛР та виділенням хламідій на курячих ембріонах, білих мишах і морських свинках.

Матеріали дисертації частково використані при написанні «Настанови з лабораторної діагностики хламідійних інфекцій сільськогосподарських тварин», затвердженої Департаментом ветеринарної медицини МінАПК України.

Ключові слова: хламідіоз, діагностика, серологічні реакції, штами хламідій.

Неволько О.М. Сравнительная характеристика методов диагностики и их усовершенствование при хламидиозе сельскохозяйственных животных. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология и вирусология. - Национальный аграрный университет, Киев, 2008.

Наличие хламидиоза на территории Черкасской области определено в большинстве районов преимущественно среди крупного рогатого скота и свиней. Подтверждена возможность межвидовой передачи инфекции с созданием её естественных очагов, стационарность в которых поддерживается, в первую очередь, синантропной птицей, особенно голубями, а также некоторыми дикими животными (косули, дикие свиньи).

Из организма больных животных возбудитель выделяется через желудочно-кишечный тракт, с бронхиальной, конъюнктивальной, вагинальной слизью, абортированными плодами, молоком, спермой производителей. Заражение животных происходит через инфицированные корма, воздух, воду, предметы ухода, алиментарным, аэрогенным, половым и контактным путями.

Клинико-епизоотологические и патолого-анатомические данные при хламидиозе самостоятельного диагностического значения не имеют, но обязательно учитываются в процессе комплексной диагностики с проведением лабораторных исследований.

Критически оценена диагностическая значимость методов световой и люминесцентной микроскопии, определенные возможные артефакты, на которые необходимо обращать внимание при прямом исследовании препаратов. Особую диагностическую ценность имеют реакция иммунофлуоресценции (РИФ) и полимеразная цепная реакция (ПЦР), которые способны подтвердить хламидиозную природу выявлением микроорганизмов. Показана относительно низкая чувствительность реакции связывания комплемента (РСК) при серологической диагностике хламидиоза на фоне высокочувствительных реакции непрямой гемаглютинации (РНГА) и реакции иммуноферментного анализа (ИФА). В частности, при исследовании 4990 сыворотки крови крупного рогатого скота положительными в РСК были лишь 330 проб (7 %), в то время как в ИФА количество таких проб составило 67,3 %. Предельные титры антител в РСК составили 5-6 log₂, в ИФА - до 8 log₂, в РНГА - до 10 log₂.

Разработан унифицированный вариант ИФА, в котором антивидовая сыворотка заменена рекомбинантным белком G, аналогом мембранного белка Streptococcus sp., меченного пероксидазой и способного с высокой афинностью взаимодействовать с широким спектром иммунных глобулинов млекопитающих. Предложенная тест-система была довольно чувствительной и выявляла по сравнению с РСК значительно большее количество положительных проб сывороток крови как у крупного рогатого скота, так и свиней. Из 367-ми исследованных проб сыворотки крупного рогатого скота позитивными в РСК оказалась 161 проба (43,8 %), в ИФА - 75,4 %, причем титры антител соответственно колебались в пределах 3,2-4,6 log₂ (РСК) и 3,2-8,2 log₂ (ИФА). Из 262-х проб сыворотки крови свиней положительными в РСК были лишь 24 пробы (9,1 %), в ИФА - 151 проба (57,6 %). Титры антител, соответственно, составляли 1,8-3,1 log₂ (РСК) и 2,3-6,1 log₂ (ИФА).

На полученную систему разработаны и утверждены технические условия ТУУ 24.4-23524007-066:2006.

От крупного рогатого скота и свиней выделены 4 штамма хламидий, которые на основании ПЦР-анализа отнесены к роду Chlamydophila. Изучен спектр патогенности выделенных штаммов по отношению к белым мышам и морским свинкам. В опытах перекрестного заражения белых мышей, а также путем постановки реакции нейтрализации определены иммунологические особенности выделенных штаммов. Показана значительная отдаленность по иммунологическим характеристикам штаммов свиного происхождения от тех, которые были выделены от крупного рогатого скота.

При заражении 3-х групп поросят-гнотобиотов различными способами одним из выделенных штаммов типичного проявления хламидиоза воспроизвести не удалось, однако позитивность биопробы подтверждена патолого-анатомическим вскрытием, наличием во внутренних органах зараженных поросят хламидий (методы ПЦР, РИФ, Романовского-Гимза), а также выделением хламидий на куриных эмбрионах, белых мышах и морских свинках.

Сумма ущерба для одного из свиноводческих хозяйств, неблагополучного по хламидиозу, от падежа, вынужденного убоя животных, недополучения продукции и снижения её качества составила за год 168 тыс. 214 грн 84 коп.

Ключевые слова: хламидиоз, диагностика, серологические реакции, штаммы хламидий.

Nevol'ko О. Comparative description of methods of diagnostics and their improvement at Chlamydios of agricultural animals. - Manuscript.

The dissertation on competition of a scientific degree of the candidate of veterinary sciences on a speciality 16.00.03 - Veterinary microbiology and virology. - National Agrarian University, Kyiv, 2008.

The presence of Chlamydios is set in most districts of the Cherkasy area above all things among a cattle and pigs. Conformation of possibility of interspecific transmission of chlamydios, creation of him, natural hearths constancy of which is supported migratory birds. Especially by pigeons, and some types of wild animals (roe deer, wild wild boars). The ways of selection of chlamydia and factors of his transmission are certain.

Kliniko-epizootological and pathoanatomical records is given at chlamydios independent diagnostic value does not have, but necessarily taken into account in the process of complex diagnostics with the leadthrough of laboratory researches.

Critically evaluation diagnostic methods of light and luminescence microscopies, the certain are possible artefakty, on which it is needed to pay attention at direct research of preparations on chlamydios. Special diagnostic value here gets an immunofluorescence ( RIF) and polymeras-chain reaction.(PLR).

The low sensitiveness of complement tying reaction is well-proven relatively (RZK) to serum diagnostics of chlamydios on a background the highly sensitive reactions of indirect hemagglutination (RIGA) and reaction of immunefermentative analysis (IFA). So, at research of a 4990 whey of cattl's blood 330 tests (7 %) appeared in RZK positive only, there are 67,3 % tests in IFA. Were maximum titles of antibodies in RZK 5-6 log₂,в of IFA - to 8 log₂, in RNGA - to 10 log₂.

Is the compatible variant of IFA developed, in which a antispecies whey is transferable arecombinant albumen G, by an analogue diaphragm squirrel Streptococcus Sp., marked in perocsydasa. On the got system it is developed and assertion oftechnical specifications TUU of 24.4- 23524007 -066:2006. From a cattls and pigs are selected 4 cultures of chlamydia, what studied basic biological and immunological properties are in. On the basis of conducted PLR - cultures are attributed an analysis to the sort of Chlamydophila.

At the infection of piglits - гнотобіотів one of the selected cultures a biottest was confirmed the exposure of Chlamydia in strokes from internalss by the methods of RIF, PLR and selection of Chlamydia on chicken embryons, white mise and guinea-pigs.

Materials of dissertation are partly used for writing „Options for the laboratory diagnostics of Chlamydia infections of agricultural animals”. Conformed by Department of veterinary medicine of Mines of AIC of Ukraine.

Key words: сhlamydios, diagnostics, serum reactions, cultures of Chlamydia.

Размещено на Allbest.ru